Einfache Etablierung einer vaskularisierten osteogenen Knochenmarksnische unter Verwendung von vorgegossenen Poly(ethylenglykol) (PEG)-Hydrogelen in einer bildgebenden Mikrotiterplatte
19. Mai 2023
Ein In-vitro-Modell der Gefäßnische des Knochenmarks wird erstellt, indem mesenchymale und endotheliale Zellen auf vorgegossene 3D-PEG-Hydrogele gesät werden. Die endothelialen Netzwerke, die EZM-Komponenten und die ALP-Aktivität der Nischen variieren je nach verwendetem Wachstumsfaktor. Die Plattform kann für fortgeschrittene Krebsmodelle verwendet werden.
Die meisten In-vitro-Vaskularisierungsstudien verwenden natürlich gewonnene Matrices. Obwohl sie in der Regel sehr leitfähig für biologische Prozesse sind, erschwert ihre inhärente biologische Aktivität die Untersuchung der Einflüsse einzelner Parameter. Hier können wir selektiv unsere interessierenden Spieler hinzufügen und beurteilen, wie sich das System verändert.
Die sequentielle Aussaat von Zellen auf unseren synthetischen Hydrogelen mit blankem Schiefer ermöglicht die Bildung sehr definierter Nischen. Hier besiedeln hBMMSs die Hydrogele und lagern ihre inhärente extrazelluläre Matrix ab. Dies liefert das Substrat für die später ausgesäten Endothelzellen.
Diese Funktion ist in anderen 3D-In-vitro-Modellen nicht üblich. Die Möglichkeit, verschiedene Zelltypen sequentiell hinzuzufügen, ermöglicht die Erstellung von Hochdurchsatz-kompatiblen In-vitro-Modellen mit großer Komplexität. Diese Modelle können angepasst werden, um spezifischere osteogene vaskularisierte Nischen zu generieren und die Funktionen zellulärer und molekularer Akteure zu untersuchen.
Übersicht
Diese Studie etabliert ein In-vitro-Modell der Knochenmark-Gefäßnische unter Verwendung von 3D-PEG-Hydrogelen. Das Modell ermöglicht die sequenzielle Besiedlung mit mesenchymalen und endothelialen Zellen und erlaubt somit die Untersuchung zellulärer Interaktionen sowie der Wirkung von Wachstumsfaktoren auf die Nischenentwicklung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Gewebetechnik
Hintergrund
- Traditionelle In-vitro-Modelle verwenden häufig natürliche Matrizen, was die Untersuchung spezifischer Parameter erschwert.
- Die synthetischen Hydrogels bieten eine kontrollierte Umgebung für die Zellseeding.
- Durch schrittweise Zellhinzugabe lassen sich komplexe, hochdurchsatzfähige Modelle erstellen.
- Diese Modelle können angepasst werden, um osteogene, vaskularisierte Nischen zu untersuchen.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines synthetischen In-vitro-Modells zur Untersuchung von vaskulären Knochenmarknischen.
- Beurteilung des Einflusses verschiedener Wachstumsfaktoren auf die Bildung endothelialer Netzwerke.
- Ermöglichung von Hochdurchsatz-Experimenten mit definierten zellulären Interaktionen.
Verwendete Methoden
- Aussaat von hBM-MSCs und GFP-HUVECs auf PEG-Hydrogelen.
- Überwachung der Zellkultur-Entwicklung mittels Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie.
- Quantifizierung endothelialer Netzwerkparameter mittels ImageJ-Analyse.
- Beurteilung der Wirkung von Wachstumsfaktoren auf das Zellverhalten und die Netzwerkbildung.
Hauptergebnisse
- Endotheliale Netzwerke bildeten sich in Gegenwart von FGF-2 stärker aus als bei BMP-2.
- Mit Wachstumsfaktoren wurde eine höhere Vernetzung beobachtet als ohne.
- Die quantitative Analyse zeigte signifikante Unterschiede in der Netzwerklänge und Anzahl der Verzweigungen je nach Vorhandensein von Wachstumsfaktoren.
- Das Modell demonstrierte erfolgreich die Fähigkeit, definierte vaskuläre Nischen zu erzeugen.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Modell ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der vaskulären Nischen im Knochenmark.
- Die sequenzielle Zellseeding erhöht die Komplexität von In-vitro-Studien.
- Wachstumsfaktoren beeinflussen die Entwicklung des endothelialen Netzwerks signifikant.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Schaffung einer vaskularisierten osteogenen Knochenmarknische in einem hochdurchsatzfähigen, bildgebungskompatiblen Format schließt eine entscheidende Lücke in der präklinischen Arzneimittelentwicklung. Diese 3D-PEG-Hydrogel-Plattform ermöglicht eine gezielte Untersuchung zellulärer und molekularer Interaktionen, die für die Biologie von Knochen und Knochenmark relevant sind, und unterstützt eine vorhersagekräftige Bewertung in frühen onkologischen und knochenerkrankungsbezogenen Entwicklungsstufen. Ihre Reproduzierbarkeit und Quantifizierbarkeit erleichtert eine robuste Zielvalidierung und die mechanistische Risikominimierung zur Voranbringung von Forschungsportfolios.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die gezielte Manipulation zellulärer und matrixgebundener Komponenten zur hypothesengeleiteten Target-Validierung.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung durch die Isolierung der Effekte von Wachstumsfaktoren und Zelltypen auf die Bildung der vaskulären Nische.
- Erleichtert die funktionelle Beurteilung osteogener und angiogener Signalwege in einem krankheitsrelevanten 3D-Kontext.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet ein standardisiertes, reproduzierbares 3D-Kokultursystem, das mit bildbasierten Hochdurchsatzanalysen und Quantifizierung kompatibel ist.
- Ermöglicht robuste, quantitative Messungen von Parametern des vaskulären Netzwerks sowie von Markern der osteogenen Differenzierung.
- Ermöglicht skalierbare, automatisierungstaugliche Arbeitsabläufe für die Wirkstoffscreening und phänotypische Assays.
Translationale und präklinische Forschung
- Modelliert das humane Knochenmark-Mikromilieu für translationsorientierte Studien zu Krebszellinteraktionen und Metastasierung.
- Ergänzt biomarkerbasierte Ansätze durch die Quantifizierung der ALP-Aktivität und der Parameter vaskulärer Netzwerke.
- Ermöglicht Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem es 2D-in-vitro- und in-vivo-Modelle verbindet.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Plattform integriert sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase, indem sie die Überprüfung von Hypothesen, die quantitative Bildschirmung und die translationale Modellierung innerhalb eines einzigen, wiederverwendbaren Systems ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Isolierung und Untersuchung spezifischer Wachstumsfaktoren oder Zelltypen, um die Rolle von Signalwegen zu klären.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Messwerte für vaskuläre und osteogene Endpunkte, die für die Analyse im Hochdurchsatzverfahren geeignet sind.
- Analytik: Unterstützt die automatisierte Bildauswertung und Normalisierung, um belastbare Vergleiche zwischen verschiedenen Bedingungen zu ermöglichen.
- Translationale Forschung: Stellt ein für den Menschen relevantes Modell bereit, um Wechselwirkungen zwischen Krebs und dem Knochenmarknischen zu untersuchen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine modulare, anpassungsfähige Plattform für vielfältige Forschungs- und Entwicklungsprogramme, die auf Knochen, Knochenmark oder metastatische Erkrankungen abzielen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert biologische Mehrdeutigkeiten bei der Validierung von Zielstrukturen und Signalwegen.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit für Teams an mehreren Standorten und aus verschiedenen Fachbereichen.
- Strategischer Wert: Verbessert die Qualität von Go/No-Go-Entscheidungen und die Kapitalnutzungseffizienz, indem bereits früh im Entwicklungsprozess belastbare, quantifizierbare Daten bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Kandidaten mit nachgewiesenen mechanistischen Grundlagen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der 3D-Zellkultur, Bildgebung und quantitativen Bildanalyse.
- Benötigt Zugang zu Fluoreszenzmikroskopie, Mikroplatten-Readern und kompatibler Analyse-Software (z. B. ImageJ).
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über verschiedene Arbeitsgruppen hinweg bei der Beschaffung von Zellen, der Vorbereitung der Matrix und den Protokollen zur Quantifizierung voraus.
- Kann an verschiedene Zelltypen und Wachstumsfaktor-Bedingungen angepasst werden, um krankheitsspezifische Modelle zu erstellen.
- Zu den Einschränkungen gehört die Notwendigkeit einer sorgfältigen Normalisierung und Validierung der Quantifizierungs-Algorithmen über verschiedene Experimentdurchläufe hinweg.
Biopharma-Häufige Fragen
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:04
Establishing the 3D Stromal Monoculture
2:44
Establishing the 3D Stromal‐Endothelial Cell Co‐Culture
4:25
Quantifying the Endothelial Cell Network Formation after the 3D Stromal‐Endothelial Cell Co‐Culture
6:53
Assessing the Osteogenic Differentiation of 3D Stromal‐Endothelial Cells by Monitoring the Alkaline Phosphatase Activity
