Histonmodifikations-Screening mittels Flüssigkeitschromatographie, Ionenmobilitätsspektrometrie und Flugzeit-Massenspektrometrie
12. Januar 2024
Ein analytischer Arbeitsablauf, der auf Flüssigkeitschromatographie, Mobilitätsspektrometrie mit gefangenen Ionen und Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) basiert, für eine hochzuverlässige und hochgradig reproduzierbare "Bottom-up"-Analyse von Histonmodifikationen und -identifizierung basierend auf Hauptparametern (Retentionszeit [RT], Kollisionsquerschnitt [CCS] und genaues Masse-zu-Ladungs-Verhältnis [m/z]).
Es wird eine Methode vorgeschlagen, bei der ein Histon-Extraktionsprotokoll mit einer Effizienz von 95 % verwendet wird. Zusammen mit LC-TIMS-ToF MS/MS ist es möglich, in kurzer Zeit ein Screening auf die im Histon vorhandenen PTMs zu erhalten. Und vor allem die Möglichkeit, Isomere zu trennen.
Die Trennung von isomeren Peptiden ist zwar nur mit Tandem-Massenspektrometrie möglich, aber oft schwierig. Durch die Integration von TIMS führen wir eine zusätzliche Dimension der Trennung ein und vereinfachen viele Positionsisomerenidentifikationen. Darüber hinaus erhöht die passive Technologie die Empfindlichkeit dieser Experimente und verbessert so unsere Fähigkeit, epigenetische Variationen zu analysieren.
Mit der verbesserten Fähigkeit, PTM-Positionen zu identifizieren, geht die Möglichkeit einher, die Korrelation zwischen verschiedenen Umwelt- oder biologischen Faktoren und deren Auswirkungen auf das Epigenom weiter zu bestimmen. Methoden, die die Analyse von Histonen verbessern und erleichtern, können auf verschiedene Forschungsbereiche angewendet werden, einschließlich der Medizin- und Umweltchemie. Die Dynamik der Proteinbestätigung in nativen oder beschädigten Zuständen wird durch die Implementierung von TIMS MS/MS mit HDX ermittelt.
Durch LC-TIMS-ToF MS/MS und Nano LC-TIMS-ToF MS/MS werden die Unterschiede in PTM in verschiedenen biologischen Proben kartiert.
Übersicht
Diese Studie stellt einen analytischen Workflow vor, der Flüssigkeitschromatographie, gefangene Ionenmobilitätsspektrometrie und Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) nutzt, um histonale Modifikationen mit hoher Zuverlässigkeit zu analysieren. Die Methode verbessert signifikant die Identifizierung posttranslationaler Modifikationen (PTMs) und ihrer positionsisomeren Formen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biokemie
- Epigenetik
Hintergrund
- Histone spielen eine entscheidende Rolle bei der Genregulation durch verschiedene Modifikationen.
- Die Identifizierung dieser Modifikationen ist entscheidend für das Verständnis epigenetischer Mechanismen.
- Herkömmliche Methoden stehen vor Herausforderungen bei der Trennung von Isomeren.
- Die Einbindung von TIMS bietet eine zusätzliche Dimension für eine verbesserte Trennung.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur effizienten Extraktion und Analyse von Histonen.
- Verbesserung der Identifizierung von PTMs und deren Isomeren.
- Korrelierung von Umweltfaktoren mit epigenetischen Variationen.
Verwendete Methoden
- Protokoll zur Histonaufreinigung mit einer Effizienz von 95 %.
- LC-TIMS-ToF MS/MS zur hochauflösenden Analyse.
- Passive Technologie zur Erhöhung der Empfindlichkeit in Experimenten.
- Screening auf in Histonen vorhandene PTMs.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Trennung von Isomer-Peptiden mittels TIMS.
- Verbesserte Identifizierung von PTM-Positionen.
- Erweiterte Fähigkeit, epigenetische Variationen zu analysieren.
- Mögliche Korrelationen zwischen biologischen Faktoren und dem Epigenom.
Schlussfolgerungen
- Die vorgeschlagene Methode verbessert die Analyse von Histonmodifikationen erheblich.
- Die Einbindung von TIMS vereinfacht die Identifizierung von Isomeren.
- Dieser Ansatz eröffnet neue Möglichkeiten für die Erforschung epigenetischer Einflüsse.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das Hochdurchsatz-Screening von histonischen posttranslationalen Modifikationen (PTMs) mittels LC-TIMS-ToF MS/MS adressiert einen kritischen Bedarf an präziser epigenetischer Kartierung in der frühen Entdeckung und Zielvalidierung. Die Fähigkeit, PTM-Positionen sicher zuzuweisen und isomere Formen zu unterscheiden, erhöht das Vorhersagevertrauen bei der Verknüpfung epigenetischer Zustände mit biologischen Reaktionen. Dieser Workflow unterstützt risikoadjustierte Portfolioentscheidungen, indem er eine robuste, quantitative Analyse von Chromatinmodifikationen ermöglicht, die für Krankheitsmechanismen relevant sind.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung epigenetischer regulatorischer Mechanismen durch hochsichere PTM-Zuordnung.
- Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung durch Unterscheidung von positionsisomeren Histonmodifikationen.
- Erleichtert die biologische Ent风险ierung, indem PTM-Muster mit umweltbedingten oder genetischen Faktoren korreliert werden.
- Verbessert die Vorhersagesicherheit für die Weiterentwicklung epigenetischer Zielstrukturen in der Entdeckungspipeline.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte biologische Proben für die nachgeschaltete Untersuchung chromatinmodifizierender Verbindungen vor.
- Liefert reproduzierbare, quantitative PTM-Profile zur Assay-Standardisierung und Benchmarking.
- Ermöglicht skalierbare, hochdurchsatzfähige Analysen, die für Screening-Kampagnen geeignet sind.
- Unterstützt die zuverlässige Bewertung der Wirkung von Verbindungen auf die Landschaft der Histonmodifikationen.
Translationale und präklinische Forschung
- Koppelt den Nachweis von PTMs mit krankheitsrelevanten epigenetischen Biomarkern, sofern dies durch den Probekontext unterstützt wird.
- Gewährleistet Kontinuität von der entdeckungsorientierten epigenetischen Kartierung bis zur Validierung in präklinischen Modellen.
- Ermöglicht eine risikoadjustierte Weiterentwicklung durch Quantifizierung von PTM-Veränderungen als Reaktion auf biologische Störungen.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung in der translationsmedizinischen Forschung durch detaillierte Profilierung von Modifikationen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses LC-TIMS-ToF-MS/MS-Protokoll integriert den gesamten Prozess von der frühen Entdeckung bis zur Leitstrukturidentifizierung und unterstützt sowohl hypothesengetriebene als auch screeningbasierte Arbeitsabläufe in der Epigenetikforschung.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch die Zuordnung von PTM-Mustern zu biologischen Ergebnissen.
- Screening: Stellt quantitative, versuchsfertige PTM-Daten für die Bewertung von Verbindungen und die Beurteilung der Reproduzierbarkeit bereit.
- Analytik: Bietet hochauflösende Messungen von PTM-Positionen, Isomerentrennung und Fragmentierungsspektren für den vergleichenden Analysenansatz.
- Translationale Forschung: Ermöglicht gegebenenfalls die Abstimmung von PTM-Profilen mit Krankheitsmodellen und Biomarker-Strategien.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare analytische Plattform für laufende epigenetische Studien über mehrere Programme hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen bei der Validierung epigenetischer Zielstrukturen.
- Operationaler Wert: Standardisiert die PTM-Analyse mit hoher Reproduzierbarkeit und Durchsatzleistung.
- Strategischer Wert: Unterstützt fundierte Go/No-Go-Entscheidungen und kapitaleffizientes Portfolio-Management.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung epigenetischer Zielstrukturen und Programme.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Massenspektrometrie, Chromatographie und Proteomik-Datenanalyse.
- Benötigt Zugang zu fortschrittlicher LC-TIMS-ToF-MS/MS-Ausrüstung und unterstützender Software.
- Erfordert die Standardisierung von Probenvorbereitungs- und Dateninterpretationsprotokollen über Teamgrenzen hinweg.
- Kann eine Anpassung an verschiedene biologische Matrizes oder Histonquellen erfordern.
- Die Kalibrierung des Instruments und die Optimierung der Methode sind entscheidend für Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit.
