Name: Produktion und Optimierung von LTE, einem von Leishmania tarentolae abgeleiteten zellfreien Proteinexpressionssystem für die rekombinante Proteinproduktion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T12:10:00.000+00:00
Duration: 3 min 59 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung eines gefriergetrockneten zellfreien Proteinexpressionssystems aus Leishmania tarentolae. Diese Methode ermöglicht stabile rekombinante Proteinproduktion bei Raumtemperatur für Forschung und Feldanwendungen.

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<meta charset="utf8"></head><body>Optimiertes Protokoll für die Herstellung von Leishmania Translational Extract (LTE)

<ol><li>Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dependence+of+cell-free+protein+synthesis+in+E.coli+upon+naturally+occurring+or+synthetic+polyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">The dependence of cell-free protein synthesis in E.coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 47 (10), 1588-1602 (1961).</li>
<li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+2.3+mg%2Fml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li>
<li>Kelwick, R., Webb, A. J., MacDonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Bacillus+subtilis+cell-free+transcription-translation+system+for+prototyping+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">Development of a Bacillus subtilis cell-free transcription-translation system for prototyping regulatory elements.</a> Metab Eng. 38, 370-381 (2016).</li>
<li>Ezure, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+system+prepared+from+insect+cells+by+freeze-thawing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis system prepared from insect cells by freeze-thawing.</a> Biotechnol Prog. 22 (6), 1570-1577 (2006).</li>
<li>Harbers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wheat+germ+systems+for+cell-free+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Wheat germ systems for cell-free protein expression.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2762-2773 (2014).</li>
<li>Kobs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+the+cell-free+protein+expression+system+that+meets+your+experimental+goals%5BTitle%5D)+AND+%22Promega+Corporation%22%5BJournal%5D)">Selecting the cell-free protein expression system that meets your experimental goals.</a> Promega Corporation. 21, 6-9 (2008).</li>
<li>Kovtun, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+cell-free+protein+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Leishmania cell-free protein expression system.</a> Methods. 55 (1), 58-64 (2011).</li>
<li>Basile, G., Peticca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Leishmania+tarentolae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Leishmania tarentolae.</a> Mol Biotechnol. 43 (3), 273-278 (2009).</li>
<li>Mureev, S., Kovtun, O., Nguyen, U. T., Alexandrov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-independent+translational+leaders+facilitate+cell-free+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Species-independent translational leaders facilitate cell-free expression.</a> Nat Biotechnol. 27 (8), 747-752 (2009).</li>
<li>Gambin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+reveals+the+oligomerization+and+folding+steps+driving+the+prion-like+behavior+of+ASC%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence reveals the oligomerization and folding steps driving the prion-like behavior of ASC.</a> J Mol Biol. 430 (4), 491-508 (2018).</li>
<li>Sierecki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+mapping+of+interactions+between+human+SNX-BAR+proteins+measured+in+vitro+by+AlphaScreen+and+single-molecule+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Rapid mapping of interactions between human SNX-BAR proteins measured in vitro by AlphaScreen and single-molecule spectroscopy.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2233-2245 (2014).</li>
<li>Sierecki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomolar+oligomerization+and+selective+co-aggregation+of+alpha-synuclein+pathogenic+mutants+revealed+by+single-molecule+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Nanomolar oligomerization and selective co-aggregation of alpha-synuclein pathogenic mutants revealed by single-molecule fluorescence.</a> Sci Rep. 6, 37630(2016).</li>
<li>Leitao, A., Bhumkar, A., Hunter, D. J. B., Gambin, Y., Sierecki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+a+selective+mechanism+for+the+inhibition+of+alpha-synuclein+aggregation+by+beta-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Unveiling a selective mechanism for the inhibition of alpha-synuclein aggregation by beta-synuclein.</a> Int J Mol Sci. 19 (2), 334(2018).</li>
<li>Gambin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+reveals+self+assembly+and+nanoscale+segregation+of+two+distinct+cavin+subcomplexes+on+caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis reveals self assembly and nanoscale segregation of two distinct cavin subcomplexes on caveolae.</a> Elife. 3, e01434(2013).</li>
<li>Ve, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+TIR-domain-assembly+formation+in+MAL-+and+MyD88-dependent+TLR4+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis of TIR-domain-assembly formation in MAL- and MyD88-dependent TLR4 signaling.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (9), 743-751 (2017).</li>
<li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+organisation+of+in+vitro+reconstituted+HOPS+and+CORVET+multisubunit+membrane+tethering+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Subunit organisation of in vitro reconstituted HOPS and CORVET multisubunit membrane tethering complexes.</a> PLoS One. 8 (12), e81534(2013).</li>
<li>Ruehrer, S., Michel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+Leishmania+tarentolae+cell-free+extracts+for+the+synthesis+of+human+solute+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Exploiting Leishmania tarentolae cell-free extracts for the synthesis of human solute carriers.</a> Mol Membr Biol. 30 (4), 288-302 (2013).</li>
<li>Varasteh Moradi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Interactions+among+cell-free+expressed+Zika+virus+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Mapping Interactions among cell-free expressed Zika virus proteins.</a> J Proteome Res. 19 (4), 1522-1532 (2020).</li>
<li>Gagoski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+pipeline+for+discovery+of+thermotolerant+xylanases+and+endo-1%2C4-beta-glucanases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell-free pipeline for discovery of thermotolerant xylanases and endo-1,4-beta-glucanases.</a> J Biotechnol. 259, 191-198 (2017).</li>
<li>Ergun Ayva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+performance+parameters+of+artificial+allosteric+protein+switches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Exploring performance parameters of artificial allosteric protein switches.</a> J Mol Biol. 434 (17), 167678(2022).</li>
<li>Lau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+biosensor+for+real-time+interaction+dynamics+of+host+proteins+with+HIV-1+capsid+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Fluorescence biosensor for real-time interaction dynamics of host proteins with HIV-1 capsid tubes.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 11 (38), 34586-34594 (2019).</li>
<li>Ryan, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+antiinflammatory+biologics+shaped+by+parasite-host+coevolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Novel antiinflammatory biologics shaped by parasite-host coevolution.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 119 (36), e2202795119(2022).</li>
<li>McMahon, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+intracellular+cavin+target+proteins+reveals+cavin-PP1alpha+interactions+regulate+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of intracellular cavin target proteins reveals cavin-PP1alpha interactions regulate apoptosis.</a> Nat Commun. 10 (1), 3279(2019).</li>
<li>Sierecki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-free+approach+to+accelerate+the+study+of+protein-protein+interactions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">A cell-free approach to accelerate the study of protein-protein interactions in vitro.</a> Interface Focus. 3 (5), 20230018(2013).</li>
<li>Johnston, W. A., Moradi, S. V., Alexandrov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaption+of+the+Leishmania+cell-free+expression+system+to+high-throughput+analysis+of+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Adaption of the Leishmania cell-free expression system to high-throughput analysis of protein interactions.</a> Methods Mol Biol. 2025, 403-421 (2019).</li>
<li>Jung, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+formation+and+interactome+analysis+of+caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-free formation and interactome analysis of caveolae.</a> J Cell Biol. 217 (6), 2141-2165 (2018).</li>
<li>Fontaine, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+domain+analysis+of+SOX18+transcription+factor+using+a+single-chain+variable+fragment-based+approach%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Functional domain analysis of SOX18 transcription factor using a single-chain variable fragment-based approach.</a> MAbs. 10 (4), 596-606 (2018).</li>
<li>Overman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+targeting+of+the+transcription+factor+SOX18+delays+breast+cancer+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Pharmacological targeting of the transcription factor SOX18 delays breast cancer in mice.</a> Elife. 6, e21221(2017).</li>
<li>Kubala, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+farnesyltransferase+alpha+subunit+regulates+vacuolar+protein+sorting-associated+protein+4A+%28Vps4A%29--dependent+intracellular+trafficking+through+recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Mammalian farnesyltransferase alpha subunit regulates vacuolar protein sorting-associated protein 4A (Vps4A)--dependent intracellular trafficking through recycling endosomes.</a> Biochem Biophys Res Commun. 468 (4), 580-586 (2015).</li>
<li>Han, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortactin+scaffolds+Arp2%2F3+and+WAVE2+at+the+epithelial+zonula+adherens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cortactin scaffolds Arp2/3 and WAVE2 at the epithelial zonula adherens.</a> J Biol Chem. 289 (11), 7764-7775 (2014).</li>
<li>Das Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+IIa+histone+deacetylases+drive+toll-like+receptor-inducible+glycolysis+and+macrophage+inflammatory+responses+via+pyruvate+kinase+M2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Class IIa histone deacetylases drive toll-like receptor-inducible glycolysis and macrophage inflammatory responses via pyruvate kinase M2.</a> Cell Rep. 30 (8), 2712-2728.e8 (2020).</li>
<li>Leitão, A. D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectivity+of+protein+interactions+along+the+aggregation+pathway+of+%CE%B1-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Selectivity of protein interactions along the aggregation pathway of α-synuclein.</a> BioRxiv. , (2021).</li>
<li>Gagoski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+benchmarking+of+four+cell-free+protein+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Performance benchmarking of four cell-free protein expression systems.</a> Biotechnol Bioeng. 113 (2), 292-300 (2016).</li>
<li>Johnston, W. A., Alexandrov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+eukaryotic+cell-free+lysate+from+Leishmania+tarentolae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Production of eukaryotic cell-free lysate from Leishmania tarentolae.</a> Methods Mol Biol. 1118, 1-15 (2014).</li>
<li>Hunter, D. J. B., Bhumkar, A., Giles, N., Sierecki, E., Gambin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+instabilities+explain+batch-to-batch+variability+in+cell-free+protein+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Unexpected instabilities explain batch-to-batch variability in cell-free protein expression systems.</a> Biotechnol Bioeng. 115 (8), 1904-1914 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>PD-10 SuperDex 25 Säulen</td><td>Cytiva</td><td>17085101</td><td>Gel-Filtrationssäulen</td></tr><tr><td>Stickstoff-Kavitationszell-Disruptor</td><td>Parr Industries</td><td>4635 oder 4639</td><td>Zell-Disruptor</td></tr><tr><td>Aus Rindern gewonnenes Hemin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5533</td><td>Kulturzusatz</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 10000U/ml</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15140122</td><td>Antibiotika-Mix</td></tr><tr><td>Optiplate 384</td><td>Perkin-Elmer</td><td>6007290</td><td>Multiwell-Platte für 10ul-Expressionen</td></tr><tr><td>Oligonukleotid-IDT-Synthese</td><td></td><td></td><td>&nbsp; Oligo mit Sequenz CAATAAAGTACAGAAACTGATAC TTATATAGCGTT,</td></tr><tr><td>Kreatinphosphokinase</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>9001-15-4</td>, <td>Enzym</td></tr><tr><td>Tecan Spark</td>, <td>Tecan</td><td></td><td>oder ähnlich, Multimode Platereader</td></tr>, <tr><td>Chemidoc MP Imager</td>, <td>Biorad</td><td></td><td>oder ähnliche SDS-PAGE Gel Imager</td></tr>, <tr><td>4-12%, Bis-Tris Gele,</td><td>Invitrogen</td><td>NW04125</td><td>SDS-PAGE Gele</td></tr><tr><td>Biophotometer</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>oder ähnlich Küvette Specrophotometer</td></tr><tr><td>Nanodrop One</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>Nanodrop Spektralphotometer</td></tr><tr><td>Avanti JXN-26 Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>oder ähnliche Zentrifuge, mit Rotoren/Röhrchen 10K und 50K g</td></tr><tr><td>5424R Mikrozentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>oder ähnliche Mikrozentrifuge, mit 1,5ml Mikrozentrifugenröhrchen</td></tr><tr><td>Kolben-Inkubator Inova S44i</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>oder ähnlicher Kolben-Inkubator-Schüttler geeignet für 5-Liter-Kolben</td></tr><tr><td>5-Liter-Glaskulturkolben</td><td></td><td></td><td>Prallglaskolben für das Kulturwachstum</td></tr><tr><td>Bactotrypton</td><td>BD</td><td>211705</td><td>Wachstumsmedium</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Merck</td><td>VM930053</td><td>Wachstumsmedium</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td></td><td></td><td>Jede analytische Qualität</td></tr><tr><td>Glukose</td><td></td><td></td><td>Jede analytische Qualität</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td></td><td></td><td>Jede analytische Qualität</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td></td><td></td><td>Jede analytische</td></tr><tr><td>Reinstwässer</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td>Oder Ausgabe von einem beliebigen MilliQ-Wasserspender</td></tr></tbody></table>

produktion und optimierung von lte, einem von leishmania tarentolae abgeleiteten zellfreien proteinexpressionssystem für die rekombinante proteinproduktion

Production and Optimization of LTE, a Leishmania tarentolae Derived Cell-Free Protein Expression System for Recombinant Protein Production

Der Zweck der zellfreien Proteinexpression besteht darin, Proteine in voller Länge in einer gefalteten, aktiven Form herzustellen, die für eine Vielzahl von Anwendungen geeignet sind. LTE (Leishmania tarentolae-Extrakt ) wurde zuvor mit anderen prokaryotischen und eukaryotischen zellfreien Expressionssystemen verglichen und zeigt eine hohe Fähigkeit, Trunkierung und Aggregation bei optimalem Betrieb zu vermeiden, insbesondere im Vergleich zu zellfreier Expression auf E . coli-Basis 33. Dies ging jedoch zuvor mit erheblichen Unterschieden in der Ausgabequalität von Charge zu Charge einher. Das derzeitige Verfahren enthält weitere Verbesserungen, um eine gleichbleibende Ausgabequalität zu gewährleisten, hauptsächlich durch eine teilweise Supplementierung der notwendigen Fütterungslösung vor dem anfänglichen Einfrieren des LTE in Aliquoten. Es folgt die Optimierung des transkriptionellen Inputs rNTP.Mg in einer Auffülllösung, die zu jeder nachfolgenden Reaktion hinzugefügt oder zur direkten Vervollständigung der gefrorenen Aliquoten verwendet werden kann. Bemerkenswert ist, dass die Optimierungsreaktionen auch eine typische Verwendung von LTE zur praktischen Expression von Proteinen darstellen, wobei die Reaktionen 2 h lang bei 25 °C durchgeführt wurden.
Daten zur Optimierung der Konzentration von rNTP.Mg in zellfreien Reaktionen liefern einen repräsentativen Datensatz. Die Expressionsniveaus nehmen in der Regel mit zunehmender transkriptioneller Eingabe (rNTP.Mg) zu, was auf eine erfolgreiche Expression hinweist. Es wird jedoch eine Schwelle erreicht, bei der das System zu einer nicht-produktiven Expression von verkürzten Produkten neigt, insbesondere im Fall von größeren Proteinen (&gt;50 kDa). Diese suboptimale Expression führt mit zunehmender rNTP.Mg zu einem Verlust des Fluoreszenzsignals, was sich besonders bei C-terminalen Fluorophorfusionen zeigt, bei denen die Translation des Polypeptids das Fluorophor selbst nicht erreicht. Bei N-terminalen Fusionen tritt zwar nicht unbedingt eine Verringerung der Gesamt-RFU (Relative Fluorescence Units) bei überschüssigem rNTP.Mg auf, während eine fehlgeschlagene Expression auf SDS-PAGE-Gelen als mehrere fluoreszierende Produkte mit abnehmender Größe sichtbar ist. Dieser Ansatz nutzt die Fähigkeit von GFP (Green Fluorescent Protein), die Fluoreszenz auch dann aufrechtzuerhalten, wenn es auf einem herkömmlichen SDS-PAGE-Gel sichtbar gemacht wird, vorausgesetzt, die Proben werden nach dem Mischen nicht erhitzt. Stattdessen werden sie mit Gel-Ladepuffer gemischt und direkt auf das Gel geladen. Während SDS-PAGE-Gelmaterialien und -geräte in der Regel austauschbar sind, muss der Gel-Imager in der Lage sein, die GFP-Fluoreszenz sichtbar zu machen. Eine typische Konfiguration für die GFP-Visualisierung wird mit Anregung bei 485 nm (Bandbreite 5 nm), Emission bei 516 nm (Bandbreite 5 nm) und einem Leseintervall von 1 Minute über 2 h bereitgestellt.
Eine Optimierung des Systems allein durch die Expression von eGFP ist möglich. Abbildung 2A,B (Einschub) zeigt typische Expressionsausgaben von Optimierungsreaktionen für zwei LTE-Chargen, wobei die eGFP RFU mit steigender rNTP.Mg Konzentrationen zunimmt und ein optimales Niveau von +0,6x rNTP.Mg (Abbildung 2A) und +0,3x rNTP.Mg (Abbildung 2B) für maximale RFU erreicht. Die reduzierte rNTP-Feed-Lösung enthält das 0,6-fache rNTP.Mg, was zu insgesamt rNTP.Mg Niveaus führt, die das 1,2-fache und das 0,9-fache des Standardbetrags für diese LTE-Chargen betragen. Abbildung 2C zeigt die Kinetik des RFU-Anstiegs während der Reaktion für die LTE-Charge in Abbildung 2B und zeigt eine biphasische Reaktion mit zwei diskreten Phasen über die Dauer der Reaktion.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65592/65592fig02.jpg"> Abbildung 2: Optimierung der rNTP.Mg Aufsättigung in LTE mit reduziertem rNTP 5x FS. (A) Expressionsniveaus von eGFP nach 140 min Expression aus einem Kontrollplasmid bei unterschiedlichen rNTP.Mg Auffrischungsniveaus in der zellfreien Expressionsreaktion (n = 3, Mittelwert ± SD aufgetragen). (B) Optimierung einer anderen LTE-Produktionscharge, die eine reduzierte Expression über einen bestimmten rNTP.Mg-Schwellenwert hinaus zeigt. (C) Kinetik der eGFP-Akkumulation in den gleichen Reaktionen wie (B), mit zunehmender rNTP.Mg Auffüllung. Diese Daten repräsentieren auch die typische Kinetik der Proteinakkumulation in der LTE-Batch-Expression. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65592/65592fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Es sollte jedoch beachtet werden, dass eGFP als kleines Protein (27 kDa), das leicht zu falten ist, wahrscheinlich exprimiert, gefaltet und gereift wird, unabhängig vom verwendeten zellfreien Expressionssystem. Ein Versagen des Systems ist wahrscheinlicher, wenn größere Proteine von Interesse exprimiert werden, wobei verkürzte Produkte bei Eingangsproteingrößen von mehr als 70 kDa deutlicher werden33. Daher ist die Optimierung des Systems mit den Proteinen, die für die tatsächliche Verwendung vorgesehen sind, überlegen, wobei eGFP immer noch zur Quantifizierung vorhanden ist, aber als N-terminale Fusion mit dem interessierenden Protein.
Abbildung 3 zeigt eine typische Optimierung des rNTP.Mg Auffüllgrads bei Verwendung eines größeren Protein-Templates, das anfällig für die Abgabe von verkürzten Produkten ist (eGFP-Sox18). Unter Verwendung eines semi-nativen Gel-SDS-PAGE-Formats (d.h. ohne Erhitzen von Proben) ist es möglich, das fortschreitende Versagen der Expression zu visualisieren. Eine optimale rNTP.Mg Zugabe bei +0,1x (kombiniert mit der 0,6x rNTP.Mg in der Teilfütterungslösung, insgesamt 0,7x) reduziert deutlich den Anteil der Proteinbande in voller Länge als Teil der gesamten fluoreszierenden Expressionsprodukte, was auf einen Systemausfall mit übermäßiger rNTP.Mg Zugabe hinweist.
Wie im Protokoll erwähnt, ist es möglich, den rNTP.Mg Optimierungsschritt zu überspringen und die volle Menge an rNTP.Mg direkt in der "Standard"-Fütterungslösung während der Supplementierung unmittelbar nach der Gelfiltration in Schritt 6.2 hinzuzufügen. Auf diese Weise kehrt das Protokoll im Wesentlichen zu den ursprünglich veröffentlichten Methoden zur Erstellung von LTE34 zurück. Die Autoren glauben jedoch, dass die Anpassung des Systems an eine optimale Leistung, wie in Abbildung 3 (Lane D bis Lane E) gezeigt, die zusätzliche Komplexität des Protokolls überwiegt und den Wert von LTE als Proteinexpressionswerkzeug erhöht.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65592/65592fig03.jpg"> Abbildung 3: Effekt einer zunehmenden rNTP.Mg-Auffüllung auf die eGFP-Sox18-Expression in teilweise supplementiertem LTE. Semi-natives SDS-PAGE-Gel, das die Auswirkungen einer Erhöhung der rNTP.Mg-Auffüllung auf die eGFP-Sox18-Expression darstellt. Bahn A: +0,1x (rNTP.Mg) Aufladung, Bahn B: +0,2x (rNTP.Mg), Bahn C: +0,3x (rNTP.Mg), Bahn D: +0,4x (rNTP.Mg). Die N-terminale eGFP-Fusion wird durch Fluoreszenzabtastung des Gels sichtbar. Das primäre Band in Bahn A stellt eGFP-Sox18 in voller Länge dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65592/65592fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2">Bestandteil</td>
			<td rowspan="2">Bestandskonzentration</td>
			<td>5x Futterlösung</td>
			<td>μL Stamm/ml 5x Fütterungslösung</td>
		</tr><tr><td>Ausfall (reduzierter rNTP)</td>
			<td>Ausfall (reduzierter rNTP)</td>
		</tr><tr><td>Spermidin</td>
			<td>ca. 100 mM</td>
			<td>ca. 1,25 Mio.</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>DVB-T</td>
			<td>500 mM</td>
			<td>ca. 10 mM</td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td>Kreatinphosphat</td>
			<td>ca. 1000 mM</td>
			<td>ca. 200 mM</td>
			<td>200</td>
		</tr><tr><td>HEPES-KOH pH7,6</td>
			<td>ca. 2500 mM</td>
			<td>ca. 100 mM</td>
			<td>40</td>
		</tr><tr><td>PEG3000</td>
			<td>0,5 V/V</td>
			<td>0,05 V/V</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>Protease-Inhibitor-Cocktail</td>
			<td>120-mal</td>
			<td>5-fach</td>
			<td>43</td>
		</tr><tr><td>Aminosäuren</td>
			<td>3,6 mM (Stück)</td>
			<td>0,68 mM (Stück)</td>
			<td>190</td>
		</tr><tr><td>ATP</td>
			<td>ca. 100 mM</td>
			<td>8,5 (5,1) mM</td>
			<td>85 (51)</td>
		</tr><tr><td>Zum GTP</td>
			<td>ca. 100 mM</td>
			<td>3,2 (1,9) mM</td>
			<td>32 (19)</td>
		</tr><tr><td>UTP</td>
			<td>ca. 100 mM</td>
			<td>2,5 (1,5) mM</td>
			<td>25 (15)</td>
		</tr><tr><td>CTP</td>
			<td>ca. 100 mM</td>
			<td>2,5 (1,5) mM</td>
			<td>25 (15)</td>
		</tr><tr><td>Mg(OAc)2</td>
			<td>1 Mio.</td>
			<td>16,7 (10) mM</td>
			<td>16.7 (10)</td>
		</tr><tr><td>Anti-Spleiß-Leader-Oligo</td>
			<td>1 Mio.</td>
			<td>0,05 Mio.</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>T7-RNA-Polymerase</td>
			<td>5 mg/ml</td>
			<td>0,5 mg/ml</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>Kreatin-Phosphokinase</td>
			<td>5 Einheiten/μL</td>
			<td>0,2 Einheiten/μl</td>
			<td>42</td>
		</tr><tr><td>Reinstwasser</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>19 (93)</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Zusammensetzung der 5x Futterlösung (5x FS) für LTE. 1 ml 5x FS ist für jeweils 2,5 ml unsupplementiertes Lysat nach der Gelfiltration erforderlich. Durch die Ergänzung mit dem Standardwert von 5x FS entsteht ein expressionsfähiges LTE für den Einsatz in Expressionsreaktionen bei einem Verhältnis von 7 μL/10 μL. Das Rezept mit reduziertem rNTP.Mg (Mengen in Kursivschrift) wird für die LTE-Expressionsoptimierung empfohlen und enthält das 0,6-fache der Standardwerte von rNTPs und Magnesium. Diese können im anschließenden Optimierungsexperiment mit den in Tabelle 2 skizzierten Ergänzungen auf variable Werte (0,6 bis 1,1 mal) angepasst werden.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>rNTP-Aufladung</td>
			<td>ATP (100 mM)</td>
			<td>GTP (100 mM)</td>
			<td>UTP (100 mM)</td>
			<td>CTP (100 mM)</td>
			<td>MgOAc (1 Mio.)</td>
			<td rowspan="2">Reinstwasser</td>
		</tr><tr><td>(1 μL/10 μL rxn)</td>
			<td>μL/200 μL</td>
			<td>μL/200 μL</td>
			<td>μL/200 μL</td>
			<td>μL/200 μL</td>
			<td>μL/200 μL</td>
		</tr><tr><td>+0x</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>200</td>
		</tr><tr><td>+0,1-mal</td>
			<td>3.4</td>
			<td>1.3</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>0.7</td>
			<td>193</td>
		</tr><tr><td>+0,2-mal</td>
			<td>6.8</td>
			<td>2.5</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>1.3</td>
			<td>185</td>
		</tr><tr><td>+0,3-mal</td>
			<td>10.2</td>
			<td>3.8</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>2</td>
			<td>178</td>
		</tr><tr><td>+0,4-mal</td>
			<td>13.6</td>
			<td>5.1</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>2.7</td>
			<td>171</td>
		</tr><tr><td>+0,5-mal</td>
			<td>17</td>
			<td>6.4</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>3.3</td>
			<td>163</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: Zusammensetzung der (rNTP.Mg) Aufladelösungen für die LTE-Optimierung. Diese Lösungen werden zur Optimierung der LTE verwendet, indem 1 μl Auffülllösung pro 10 μl Proteinexpressionsreaktion hinzugefügt werden. Sobald ein Auffüllgrad im Optimierungsexperiment bestimmt wurde, kann er konsistent zu allen nachfolgenden Proteinexpressionsreaktionen mit denselben LTE-Batch-Aliquoten hinzugefügt werden. Alternativ kann es direkt zu den Aliquoten selbst mit 1 μl Zugabe pro 7 μl (ohne Auftauen) hinzugefügt werden. Nach dem Auftauen und Mischen werden diese Lysate mit 8 μl LTE pro 10 μl Proteinexpression verwendet, wobei das während der Optimierung festgelegte rNTP.Mg Auffüllniveau beibehalten wird.

Produktion und Optimierung von LTE, einem von Leishmania tarentolae abgeleiteten zellfreien Proteinexpressionssystem für die rekombinante Proteinproduktion

This protocol outlines the production and optimization of a eukaryotic Cell-Free Protein Expression System (CFPS) derived from the unicellular flagellate ...

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Research

Forschung

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Bioengineering

Biotechnik

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Herstellung von Proteinproduktion synthetischer Zellen mit zellfreien bakteriellen Extrakten, Liposomen und Emulsionstransfer

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Schnelle, kostengünstige und unkomplizierte Herstellung von bakteriellem zellfreiem Lysat

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Entwicklung von Leishmania-Speziesstämmen mit konstitutiver Expression von eGFP

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Erfahren Sie die Herstellung eines gefriergetrockneten zellfreien Proteinexpressionssystems aus Leishmania tarentolae. Diese Methode ermöglicht stabile rekombinante Proteinproduktion bei Raumtemperatur für Forschung und Feldanwendungen.

Produktion und Optimierung von LTE, einem von Leishmania tarentolae abgeleiteten zellfreien Proteinexpressionssystem für die rekombinante Proteinproduktion (Video) | JoVE Journal

Produktion und Optimierung von LTE, einem von Leishmania tarentolae abgeleiteten zellfreien Proteinexpressionssystem für die rekombinante Proteinproduktion

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