Name: Gaschromatographie-Massenspektrometrie-basierte gezielte Metabolomik von Hartkorallenproben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Erfahren Sie die gezielte Metabolomik von Hartkorallenproben mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Stoffwechselinteraktionen zwischen Korallengewebe und Symbiodiniaceae für Forschung zur Korallenresilienz.

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J.L.M. wurde durch ein Forschungsstipendium des UTS-Kanzlers unterstützt.

Metaboliten-Profilierung von Steinkorallenproben mittels GC-MS

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offenzulegen.

Die Trennung von Wirt und Symbiont ist durch einfache Zentrifugation leicht und schnell zu erreichen, und die Ergebnisse hier zeigen, dass die Trennung der Fraktionen wertvolle Informationen liefern kann, die auf spezifische Beiträge von Holobiontenmitgliedern hinweisen, die zur funktionellen Analyse der Korallengesundheit beitragen können. In erwachsenen Korallen wird die Lipidsynthese hauptsächlich vom ansässigen Algensymbionten 40 durchgeführt, der Lipide (z. B. Triacylglycerin und Phospholipide)41 und Fettsä...

Metaboliten stellen die Endprodukte zellulärer Prozesse dar, und die Metabolomik - die Untersuchung der von einem bestimmten Organismus oder Ökosystem produzierten Metaboliten - kann ein direktes Maß für die Funktionsweise von Organismen liefern1. Dies ist besonders wichtig für die Erforschung von Ökosystemen, symbiotischen Interaktionen und Wiederherstellungswerkzeugen, da das Ziel der meisten Managementstrategien darin besteht, bestimmte Ökosystemdienstleistungen zu erhalten (oder wiederherzustellen)2. Korallenriffe sind ein aquatisches Ökosystem, das den potenziellen Wert der Metabolomik für die Aufklärung symbiotischer Interaktionen und die Verknüpfung von korallenphysiologischen Reaktionen mit Auswirkungen auf Gemeinde- und Ökosystemebene demonstriert3. Die Anwendung der Hochdurchsatz-Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) wird besonders geschätzt, da sie in der Lage ist, ein breites Spektrum von Metabolitenklassen gleichzeitig mit hoher Selektivität und Empfindlichkeit schnell zu analysieren, eine schnelle Identifizierung von Verbindungen zu ermöglichen, wenn Spektralbibliotheken verfügbar sind, und ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit und Genauigkeit bei relativ niedrigen Kosten pro Probe zu bieten.
Korallen sind Holobionten, die aus dem Korallentier, photosynthetischen Dinoflagellaten-Endosymbionten (Familie: Symbiodiniaceae4) und einem komplexen Mikrobiombestehen 5,6. Insgesamt wird die Fitness des Holobionten vor allem durch den Austausch von kleinen Molekülen und Elementen aufrechterhalten, um die Stoffwechselfunktion jedes Mitglieds zu unterstützen 7,8,9,10. Metabolomische Ansätze haben sich als besonders leistungsfähig erwiesen, um die metabolischen Grundlagen der Symbiosespezifität9,11, der Bleichreaktion auf thermischen Stress 7,8,12,13, der Krankheitsreaktionen 14, der Reaktionen auf Umweltverschmutzung 15, der Photoakklimatisierung 16 und der chemischen Signalgebung 17 in Korallen aufzuklären sowie die Entdeckung von Biomarkern zu unterstützen 18,19. Darüber hinaus kann die Metabolomik eine wertvolle Bestätigung für die Schlussfolgerungen liefern, die aus DNA- und RNA-basierten Techniken abgeleitet werden 9,20. Es besteht daher ein erhebliches Potenzial für den Einsatz der Metabolomik zur Bewertung der Gesundheit von Riffen und zur Entwicklung von Instrumenten für den Schutz von Riffen3, z. B. durch den Nachweis metabolischer Biomarker für Stress18,19 und für die Untersuchung des Potenzials aktiver Managementstrategien wie Ernährungssubventionen21.
Die Trennung der Wirts- und Symbiontenzellen und die Analyse ihrer Metabolitenprofile unabhängig voneinander und nicht zusammen wie der Holobiont kann mehr Informationen über die Partnerinteraktionen, den unabhängigen physiologischen und metabolischen Status und die potenziellen molekularen Mechanismen für die Anpassung liefern 11,12,22,23,24. Ohne die Koralle und die Symbiodiniaceae zu trennen, ist es fast unmöglich, den Beitrag und den Stoffwechsel von Korallen und/oder Symbiodiniaceae unabhängig voneinander aufzuklären, außer mit komplexer Genomrekonstruktion und metabolischer Modellierung25, aber dies muss noch auf die Korallen-Dinoflagellaten-Symbiose angewendet werden. Darüber hinaus kann der Versuch, Informationen über den individuellen Stoffwechsel des Wirts oder Algensymbionten aus dem Metabolitenprofil des Holobionten zu extrahieren, zu Fehlinterpretationen führen.
Zum Beispiel wurde bis vor kurzem angenommen, dass das Vorhandensein von mehrfach ungesättigten C18:3n-6-, C18:4n-3- und C16-Fettsäuren in Extrakten aus Korallen- und Holobiongewebe vom Algensymbionten stammt, da man davon ausging, dass Korallen nicht die für die Produktion von Omega-3 (ω3)-Fettsäuren essentiellen ωx-Desaturasen besitzen; Neuere genomische Beweise deuten jedoch darauf hin, dass mehrere Nesseltiere die Fähigkeit haben, ω3-PUFA de novo zu produzieren und ω3-langkettiges PUFA26 weiter zu biosynthetisieren. Die Kombination von GC-MS mit stabiler Isotopenmarkierung (z. B. 13 C-Bicarbonat, NaH13CO 3) kann verwendet werden, um das Schicksal von photosynthetisch fixiertem Kohlenstoff durch holobionte Stoffwechselnetzwerke von Korallen sowohl unter Kontrollbedingungen als auch als Reaktion auf externe Stressoren zu verfolgen27,28. Ein kritischer Schritt bei der Verfolgung des 13-C-Schicksals ist jedoch die Trennung des Korallengewebes von den Algenzellen - nur dann kann das Vorhandensein einer 13-C-markiertenVerbindung in der Korallenwirtsfraktion eindeutig als von Symbiodiniaceae abgeleiteter Metabolit, der in die Koralle transloziert wurde, oder als nachgeschaltetes Produkt einer translozierten markierten Verbindung zugeordnet werden. Diese Technik hat ihre Leistungsfähigkeit unter Beweis gestellt, indem sie die lang gehegte Annahme in Frage stellte, dass Glycerin die primäre Form ist, in der Photosynthese vom Symbionten zum Wirt transloziertwird 29, und indem sie aufklärte, wie sich der Nährstofffluss zwischen den Partnern während des Bleichens27,28 und als Reaktion auf inkompatible Symbiodiniaceae-Arten verändert11.
Während die Entscheidung, Gewebe zu trennen, in erster Linie von der Forschungsfrage bestimmt wird, sind die Praktikabilität, Zuverlässigkeit und potenziellen metabolischen Auswirkungen dieses Ansatzes wichtig zu berücksichtigen. Hier stellen wir detaillierte, demonstrierte Methoden zur Extraktion von Metaboliten aus dem Holobionten, sowie den getrennten Wirts- und Symbiontenfraktionen vor. Wir vergleichen die Metabolitenprofile des Wirts und des Symbionten unabhängig voneinander und wie diese Profile mit dem holobionten Metabolitenprofil verglichen werden.

<table><tbody><tr><td>100% Methanol in LC-Qualität</td><td>Merck</td><td>439193</td><td>LC-Qualität essentielle</td></tr><tr><td>2 mL Mikrozentrifugenröhrchen, PP</td><td>Eppendorf</td><td>30121880</td><td>Polypropylen bietet eine hohe Beständigkeit gegen Chemikalien, mechanische Beanspruchung und extreme Temperaturen</td></tr><tr><td>2030 Shimadzu Gaschromatograph</td><td>Shimadzu</td><td>GC-2030</td><td></td></tr><tr><td>710-1180 & Mikro; m säuregewaschene Glasperlen</td><td>Merck</td><td> G1152</td><td>Diese Größe ist optimal zum Aufbrechen der Symbiodiniaceae-Zellen</td></tr><tr><td>AOC-6000 Plus Multifunktionaler Autosampler</td><td>Shimadzu</td><td>AOC6000</td><td></td></tr><tr><td>Bradford-Reagenz</td><td>Merck</td><td>B6916</td><td>Jedes kolorimetrische Proteinreagenz ist akzeptabel</td></tr><tr><td>Druckluftpistole</td><td>Ozito</td><td>6270636</td><td>Ähnliches Design akzeptabel. Es ist von entscheidender Bedeutung, eine Armatur für einen 1-ml-Kipper zu haben.</td></tr><tr><td>&nbsp; DB-5 Säule mit 0,25 mm Innendurchmesser Säule und 1 & micro; m Schichtdicke</td>: <td>Agilent</td><td>122-5013</td><td></td></tr><tr><td>DMF</td>, <td>Merck</td><td>RTC000098</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol-6-13C und/oder 13C5&ndash; 15N Valin</td>, <td>Merck</td><td>605514/ 600148</td><td>Dem Methanol können einer oder beide internen Standards zugesetzt werden.</td></tr><tr><td>96-Well-Platte mit flachem Boden</td><td>Merck</td><td>CLS3614</td><td></td></tr><tr><td>Glasszintillationsfläschchen</td><td>Merck</td><td>V7130</td><td>20 mL, mit nicht-plastischem Siegel</td></tr><tr><td>Immunoglogin G</td><td>Merck</td><td>56834</td><td>wenn nicht verfügbar, Rinderserumalbumin ist akzeptabel</td></tr><tr><td>Primer</td><td>v4</td><td></td>R v4.1.2 Shimadzu <td></td></tr><tr><td></td><td></td> LabSolutions Insight Software <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>v3.6</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Merck</td><td>S5881</td><td>Pellets zur Herstellung von 1 M Lösung</td></tr><tr><td>Tidyverse</td><td></td><td>v1.3.1</td><td>R Paket</td></tr><tr><td>TissueLyser LT</td><td>Qiagen</td><td>85600</td><td>Oder ähnlich</td></tr><tr><td>TQ8050NX Triple Quadrupol Massenspektrometer</td><td>Shimadzu</td><td>GCMS-TQ8050 NX</td><td></td></tr><tr><td>UV-96 Well-Platte</td><td>Greiner</td><td>M3812</td><td></td></tr><tr><td>Whirl-Pak Probenbeutel</td><td>Merck</td><td>WPB01018WA</td><td>Probenentnahmebeutel; Größe: groß genug, um ein ~5 cm großes Korallenfragment aufzunehmen, aber nicht zu groß, dass das Wasser zu weit gestreut wird</td></tr></tbody></table>

gaschromatographie-massenspektrometrie-basierte gezielte metabolomik von hartkorallenproben

Gas Chromatography-Mass Spectrometry-Based Targeted Metabolomics of Hard Coral Samples

Auf Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) basierende Ansätze haben sich als leistungsfähig erwiesen, um die metabolischen Grundlagen der Nesseltier-Dinoflagellaten-Symbiose aufzuklären und wie Korallen auf Stress reagieren (z. B. während der temperaturinduzierten Bleiche). Das Steady-State-Metaboliten-Profiling des Korallen-Holobionten, der den Nesseltierwirt und seine assoziierten Mikroben (Symbiodiniaceae und andere Protisten, Bakterien, Archaeen, Pilze und Viren) umfasst, wurde erfolgreich unter Umgebungs- und Stressbedingungen angewendet, um den ganzheitlichen Stoffwechselstatus der Koralle zu charakterisieren.
Um die Fragen rund um die symbiotischen Interaktionen zu beantworten, ist es jedoch notwendig, die Metabolitenprofile des Korallenwirts und seiner Algensymbionten unabhängig voneinander zu analysieren, was nur durch eine physikalische Trennung und Isolierung der Gewebe erreicht werden kann, gefolgt von einer unabhängigen Extraktion und Analyse. Während die Anwendung der Metabolomik im Korallenbereich relativ neu ist, haben die anhaltenden Bemühungen von Forschungsgruppen zur Entwicklung robuster Methoden zur Analyse von Metaboliten in Korallen geführt, einschließlich der Trennung des Korallenwirtsgewebes und der Algensymbionten.
In diesem Artikel wird eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Holobiontentrennung und die Extraktion von Metaboliten für die GC-MS-Analyse vorgestellt, einschließlich der wichtigsten Optimierungsschritte, die in Betracht gezogen werden sollten. Wir zeigen, dass das kombinierte Metabolitenprofil der beiden Fraktionen (Koralle und Symbiodiniaceae) nach unabhängiger Analyse dem Profil des Ganzen (Holobiont) ähnelt, aber durch die Trennung der Gewebe können wir auch wichtige Informationen über den Stoffwechsel und die Wechselwirkungen zwischen den beiden Partnern erhalten, die aus dem Ganzen allein nicht gewonnen werden können.

Alle Daten, die während dieser Arbeit erstellt wurden, sind in den Zusatzinformationen verfügbar.
Wirt-Symbionten-Trennung
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65628/65628fig01.jpg"> Abbildung 1: Aufbau und Validierung der Trennung von Korallenwirtsgewebe und Symbiodiniaceae-Zellen. (A) Der Luftpistolenaufbau zur Entnah...

Hier stellen wir die Extraktion und Präparation von polaren und semipolaren Metaboliten aus einem Korallenholobionten, sowie getrenntem Korallenwirtsgewebe und Symbiodiniaceae-Zellfraktionen für die gaschromatographische Massenspektrometrie-Analyse vor.

Gaschromatographie-Massenspektrometrie-basierte gezielte Metabolomik von Hartkorallenproben

Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)-based approaches have proven to be powerful for elucidating the metabolic basis of the ...

Wie jeder Organismus sind auch Korallen auf hervorragende Nahrung angewiesen, um zu wachsen und Riffe für Immunität und Fortpflanzung zu bauen und wechselnden Umweltbedingungen standzuhalten. Aber wir wissen nur sehr wenig über die optimale Ernährung von Korallen unter normalen oder sich ändernden Bedingungen und darüber, wie jedes Mitglied des Korallenholobionten zu diesem Ernährungszustand beiträgt. Korallen sind Holobionten, die aus dem Wirt und verschiedenen symbiotischen Mikroorganismen bestehen.Dazu gehören Symbiodiniaceae, Protisten, Bakterien, Viren und Pilze. Die Fitness des Holobionten hängt von den metabolischen Wechselwirkungen zwischen diesen Mitgliedern ab. Zum Beispiel liefern Symbiodiniaceae Photosynthese, um den Stoffwechsel des Wirts zu unterstützen und ihm zu helfen, sich an veränderte Bedingungen anzupassen.Um diese wichtige Partnerschaft zu verstehen, müssen wir die chemische und metabolische Zusammensetzung jedes Partners separat untersuchen. Diese Ergebnisse zeigten, dass durch die Trennung von Wirts- und Symbiontenfraktionen für die Stoffwechselanalyse mehr Informationen gewonnen werden können. Die Entscheidung, einzelne Fraktionen im Vergleich zum Holobionten zu analysieren, wird jedoch letztlich von der Forschungsfrage bestimmt.In Fällen, in denen eine Analyse des Holobionten vorzuziehen ist, haben wir eine Methodik für die Extraktion von Holobiont-Metaboliten und Vorschläge bereitgestellt, um während der Analyse so viele Informationen wie möglich zu erhalten. Die in dieser Studie verwendeten Methoden eröffnen neue Wege für die Forschung. Dazu gehören die Aufdeckung potenzieller Biomarker, die Identifizierung wichtiger Metaboliten in bestimmten Lebensphasen oder Stressbedingungen, das Verständnis der Vorteile der Assoziation mit bestimmten Spezies und die Erforschung von Interaktionen innerhalb des Holobionten.Zukünftige Forschungen werden sich auf die Anwendung der hier etablierten Protokolle auf verschiedene Forschungsbereiche konzentrieren, einschließlich des Nachweises von Biomarkern mit Anwendungen in der Erhaltung und Wiederherstellung von Korallenriffen. Diese Methodik kann auch dort angewendet werden, wo die Trennung von Fraktionen für andere physiologische Messungen nicht möglich ist. Zum Beispiel bei der Analyse flüchtiger Metabolitenemissionen aus Korallenkolonien.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die nicht-gezielte Erstellung von Metabolitenprofilen durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in Verbindung mit Massenspektrometrie (UPLC-MS) ist eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung des Stoffwechsels.  In diesem Artikel wird ein typischer Arbeitsablauf für die Erstellung von nicht-zielgerichteten Metabolitenprofilen von Serum beschrieben, einschließlich Probenorganisation und -vorbereitung, Datenerfassung, Datenanalyse, Qualitätskontrolle und Metabolitenidentifizierung.

Large Scale Non gezielte Metabolomic Profiling von Serum von Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Untargeted metabolomics stellt eine Hypothese generieren Momentaufnahme eines metabolischen Profils. Dieses Protokoll wird zeigen, die Extraktion und Analyse von Metaboliten von Zellen, Serum oder Gewebe. Eine Reihe von Metaboliten werden mit flüssigem befragten-Flüssigphasenextraktion, Mikroströmungsfühler UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie / hochauflösende Massenspektrometrie (UPLC-HRMS), gekoppelt mit Differential-Analyse-Software.

Untargeted Metabolomics aus biologischen Quellen Mit UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie-hochauflösender Massenspektrometrie (UPLC-HRMS)

Metabolite Profiling hat sich in der Studie der Stoffwechsel in Gesundheit und Krankheit ein wertvolles Gut. Verwendung normaler-Phasen-Flüssigkeits-Chromatographie, um hochauflösende Massenspektrometrie mit Polaritätsumschaltung und eine schnelle Arbeitszyklus gekoppelt ist, beschreiben wir ein Protokoll zur Analyse der Stoffwechselpolar Zusammensetzung von biologischem Material mit hoher Empfindlichkeit, Genauigkeit und Auflösung.

Eine Strategie für einfühlsam, Large Scale Quantitative Metabolomics

Dieses Protokoll ist für die Extraktion und Konzentration von Protein und DNA aus mikrobieller Biomasse, die aus Meerwasser gesammelt wurde, gefolgt von der Erzeugung von tryptischen Peptiden, die für die Tandem-Massenspektrometrie-basierte Proteomanalyse geeignet sind.

Ein Aquatic Microbial Metaproteomik Workflow: Von der Zelle zum tryptischen Peptide Geeignet für Tandem-Massenspektrometrie-basierte Analyse

Eine zweidimensionale Gaschromatographie-Flugzeit-Massenspektrometrie-Methode wird zur Charakterisierung der wässrigen Fraktion von Bioroh beschrieben, die aus der hydrothermalen Verflüssigung von Algen hergestellt wird. Dieses Protokoll kann auch zur Analyse der wässrigen Fraktion von flüssigen Produkten aus der Schnellpyrolyse, der katalytischen Schnellpyrolyse, der katalytischen Desoxygenierung und der Hydrobehandlung eingesetzt werden.

Qualitative Charakterisierung der wässrigen Fraktion von hydrothermale Verflüssigung von Algen mit Hilfe von 2D-Gaschromatographie mit Time-of-Flight Mass Spectrometry

Eine verbesserte Polymerase-Kettenreaktion-RFLP-Verfahren zur Genotypisierung Kugelfisch-Spezies durch Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie beschrieben. Eine Umkehrphasen-Silica-Monolith Säule wird zur Trennung verdaut Amplikons eingesetzt. Dieses Verfahren kann die monoisotopisch Massen von Oligonukleotiden aufzuklären, die zur Identifizierung Basenzusammensetzung nützlich ist.

Verbesserte Polymerase-Kettenreaktion-RFLP Genotypisierung von Toxic Kugelfisch durch Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie

Dieses Protokoll beschreibt die Drosophila Larven für GC-MS-basierte Metabolomic Analyse vorzubereiten.

Vorbereitung von Drosophila Larven Proben für Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS)-basierte Metabolomik

Dieses Protokoll beschreibt einen einzigen Durchsatz für ergänzende analytische und Omics Techniken, die ihren Höhepunkt in einer voll gepaart Charakterisierung von natürlichen organischen Stoffen und mikrobielle Proteomics in verschiedenen Ökosystemen. Dieser Ansatz ermöglicht die robuste Vergleiche zur Identifizierung von Stoffwechselwegen und Transformationen für Treibhausgasproduktion Beschreibung und Vorhersage Reaktionen auf Veränderungen der Umwelt wichtig.

Single-Durchsatz ergänzende hochauflösende Analysetechniken für die Charakterisierung von komplexen natürlichen organischen Substanz Mischungen

Eine Methode zur ungezielten Analyse von Weizenkornmetaboliten und Lipiden wird vorgestellt. Das Protokoll umfasst eine Acetonit-Metabolit-Extraktionsmethode und eine umgekehrte Phase-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Methodik mit Erfassung in positiven und negativen Elektrospray-Ionisationsmodi.

Ungezielte Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierte Metabolomik-Analyse von Weizengetreide

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Vor-Ort-Probenahme und Extraktion von Hirntumoren für die Metabolomik- und Lipidomik-Analyse

Eine Methode zur metabolomischen Analyse von Gerste wird vorgestellt. Das Verfahren beinhaltet die Fraktionierung und Derivatisierung von Metaboliten und deren Analyse mittels Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC/MS). Die metabolomische Analyse kann verwendet werden, um die Auswirkungen von Zwischenfruchtanbau und Trockenstress auf das Getreide zu bestimmen.

Metabolomische Analyse von Gerste mittels Gaschromatographie/Massenspektrometrie

Erfahren Sie die gezielte Metabolomik von Hartkorallenproben mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Stoffwechselinteraktionen zwischen Korallengewebe und Symbiodiniaceae für Forschung zur Korallenresilienz.

Gaschromatographie-Massenspektrometrie-basierte gezielte Metabolomik von Hartkorallenproben

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