Name: Erforschung der pharmakologischen Wirkung und des molekularen Mechanismus von Salidrosid bei der Hemmung der Proliferation und Migration von MCF-7-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-09T12:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Erfahren Sie die pharmakologische Wirkung von Salidrosid bei der Hemmung von Proliferation und Migration von MCF-7-Brustkrebszellen. Diese Studie untersucht den molekularen Mechanismus über den PI3K-AKT-HIF-1a-FoxO1-Signalweg.

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Diese Arbeit wurde von der Gesundheitskommission der Provinz Sichuan (120025) unterstützt.

Die für die vorliegende Studie verwendeten MCF-7-Zellen wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle).
1. Zellkultur
<ol><li>Die MCF-7-Zellen werden in einer befeuchteten 5%igen CO2 -Atmosphäre bei 37 °C mit DMEM kultiviert, das 10 % FBS und 1 % Penicillin (10.000 U/ml)/Streptomycin (10.000 μg/ml) enthält (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Die Zellen, die 90 % des Bodens der Schale bedeckten, wurden für das Experiment verwendet und in die folgenden Gruppen eingeteilt: Kontrollgruppe, Doxorubicinhydrochloridgruppe (DXR, 5 μM) und Sal-Gruppe (20 μM, 40 μM und 80 μM) oder Kontrollgruppe, LY294002 (10 μM, ein Inhibitor von PI3K), Gruppe Sal (80 μM) und LY294002 Gruppe (10 μM) + Sal (80 μM) (siehe Materialtabelle).</li>
</ol>2. Zellviabilitäts-Assay
HINWEIS: Einzelheiten zu diesem Verfahren finden Sie in einem früheren Bericht27.
<ol><li>Säen Sie MCF-7-Zellen mit einer Dichte von 8 x 104 Zellen/Well in 96-Well-Platten und inkubieren Sie mit Sal (10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM und 320 μM) für 24 h oder Sal (20, 40, 80 μM) für 12 h/24 h/36 h/48 h über Nacht, bis die Zellen adhärent sind.</li>
	<li>Nach der Behandlung werden die MCF-7-Zellen 2 h lang mit 10 μl/Well CCK-8-Lösung (siehe Materialtabelle) co-inkubiert. Messen Sie dann die optische Dichte bei 450 nm (OD450) mit einem automatischen Mikroplatten-Reader.</li>
</ol>3. Zellmigration und -invasion
HINWEIS: Einzelheiten zu diesem Verfahren finden Sie in einem früheren Bericht35.
<ol><li>Inkubieren Sie 2 ml 5 x 10 6 Zellen/ml, die in 6-Well-Platten ausgesät sind, um 90 % des Bodens der Schale zu bedecken.</li>
	<li>Führen Sie eine lineare Kratzwunde entlang der Mitte der Zellmonoschicht mit einer sterilen Pipettenspitze durch. Erfassen Sie Bilder mit einem optischen Mikroskop bei 0 h, 24 h und 48 h.</li>
	<li>Verwenden Sie die Software Image J, um die Breite der Kratzwunden zu messen.</li>
	<li>Für den Transwell-Assay werden MCF-7-Zellen ohne Serummedium suspendiert und in der oberen Transwell-Kammer mit oder ohne Matrigel vorbeschichtet (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Verwenden Sie im Boden der Transwell-Kammer das DMEM-Komplettmedium als chemischen Induktor. Nach 24 Stunden werden die Zellen in der oberen Kammer entfernt und die verbleibenden invasiven und migrantischen Zellen in Methanol35 fixiert.</li>
	<li>Färben Sie die MCF-7-Zellen mit kristallvioletter Lösung (siehe Materialtabelle). Nehmen Sie die Bilder mit einem optischen Mikroskop auf.</li>
</ol>4. Aktivitätsbewertung von Na+-K+-ATPase und Ca 2+-Mg2+-ATPase
<ol><li>Verwenden Sie ein Bicinchoninsäure-Kit (BCA), um die Proteinkonzentration in lysierten MCF-7-Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers zu messen (siehe Materialtabelle).<ol><li>Proben der lysierten Zellen in ihren entsprechenden Gruppen werden in die 96-Well-Platten gegeben. Danach wird die Arbeitslösung zugegeben, um bei 37 °C für 5 Minuten weiter zu inkubieren. Messen Sie abschließend die Werte von OD636 mit einem multifunktionalen Mikroplatten-Reader.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Durchflusszytometrische Analyse der Apoptose und des Zellzyklus
HINWEIS: Einzelheiten zu diesem Verfahren finden Sie in einem früheren Bericht31.
<ol><li>Die Zellen werden verdaut und geerntet, um sie in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für eine 20-minütige Färbung mit Annexin V-FITC und Propidiumiodid (PI) zu resuspendieren (siehe Materialtabelle), und dann die Anzahl der apoptotischen Zellen mit einem Durchflusszytometer zu bestimmen.</li>
	<li>Mischen Sie die resuspendierte Probenlösung mit PI-Lösung für eine 30-minütige Inkubation, gefolgt von der Detektion mit einem Durchflusszytometer.</li>
</ol>6. DCFH-DA und Fluo-4 AM Fluoreszenzfärbung
HINWEIS: Einzelheiten zu diesem Verfahren finden Sie in einem früheren Bericht29.
<ol><li>Inkubieren Sie die MCF-7-Zellen 20 Minuten lang mit einer 10 μM DCFH-DA-Fluoreszenzsonde (siehe Materialtabelle) bei 37 °C. Nach gründlicher Entfernung des überschüssigen DCFH-DA durch dreimaliges Waschen mit PBS wird die Fluoreszenzintensität bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 488 nm bzw. 525 nm mit einem Fluoreszenzmikroskop getestet.</li>
	<li>Inkubieren Sie die MCF-7-Zellen mit einer 5 μM Fluo-4 AM-Fluoreszenzsondenlösung (siehe Materialtabelle) für 45 Minuten bei 37 °C. Nach dreimaligem Waschen mit PBS werden die Fluoreszenzintensitätswerte bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 488 nm bzw. 516 nm mit einem Fluoreszenzmikroskop bestimmt.</li>
</ol>7. Westlicher Fleck
<ol><li>2 ml 5 x 10 6 Zellen/ml Zellsuspensionen, die verschiedene Arzneimittel enthalten, in 6-Well-Platten geben und in einem 37 °C heißen 5%igenCO2-Inkubator 24 h lang kultivieren. HINWEIS: Die Gruppen für die Western-Blot-Analyse wurden wie folgt festgelegt: Kontrollgruppe, LY294002 (10 μM) Gruppe, Sal (80 μM) Gruppe und LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) Gruppe (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Die Zellen und der Überstand werden gesammelt und bei 560 × g bei 4 °C für 3 Minuten zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie ihn zweimal mit vorgekühltem PBS. Nach jedem Waschgang zentrifugieren Sie die Zellen bei 560 × g bei 4 °C für 3 min.</li>
	<li>Geben Sie 50 μl Lysepuffer in die Zellprobe aus Schritt 7.2 für ein 15-minütiges Eisbad. Bei 8550 × g bei 4 °C für 10 min zentrifugieren, um die überstehende Proteinprobe zu entnehmen.</li>
	<li>Nach dem Nachweis der Proteinkonzentration mit einer BCA-Methode wird die Proteinprobe in Schritt 7.3 mit einem Beladungspuffer im Verhältnis 4:1 gemischt, bei 100 °C für 10 min in einem Metallbad denaturiert und auf Raumtemperatur abgekühlt.</li>
	<li>Geben Sie 20 μg der Proteinprobe aus Schritt 7.4 hinzu, trennen Sie die Proteine mit unterschiedlichen Molekulargewichten35unter Verwendung von 10 % SDS-PAGE (siehe Materialtabelle) und übertragen Sie sie dann auf 0,22 μm PVDF-Membranen. Nach Blockade mit 5% BSA werden die Membranen über Nacht bei 4 °C mit den entsprechenden Primärantikörpern inkubiert. HINWEIS: Die verdünnte Konzentration der folgenden Primärantikörper beträgt 1:1.000: gespaltene Caspase-9/7/3 (CC-9/7/3), Bim, Bax, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1 und β-Aktin (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Am nächsten Tag werden die Membranen 2 h lang bei 37 °C mit einem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper inkubiert. Entwickeln Sie die Membranen mit einer ECL-Chemilumineszenzlösung und nehmen Sie Bilder mit einem berührungslosen quantitativen Western-Blot-Bildgebungssystem auf (siehe Materialtabelle).</li>
</ol>8. qRT-PCR
<ol><li>Führen Sie eine Zentrifugation durch, um MCF-7-Zellen bei 560 x g bei 4 °C für 3 Minuten zu sammeln, und fügen Sie 500 μl Puffer RL1 in 5 × 106 Zellen hinzu. Blasen und mischen Sie wiederholt mit einer Pipette, bis keine Zellmassen mehr sichtbar sind. HINWEIS: Puffer RL1 ist eine der Komponenten im gesamten RNA-Isolierungskit (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Die Zellhomogenate in Schritt 8.1 werden in die in das Sammelröhrchen eingebettete DNA-Reinigungssäule überführt und bei 8.550 × g bei 4 °C für 2 min zentrifugiert. Entfernen Sie die DNA-Reinigungssäule und lassen Sie den Überstand im Sammelröhrchen. HINWEIS: Die DNA-Reinigungssäule und das Sammelröhrchen sind zwei der Komponenten des gesamten RNA-Isolierungskits (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>800 μl Puffer RL2 zu 500 μl des Überstandes aus Schritt 8.2 geben und vorsichtig mischen. HINWEIS: Puffer RL2 ist eine der Komponenten im gesamten RNA-Isolierungskit (siehe Materialtabelle). Vor Gebrauch 120 ml wasserfreies Ethanol zu 60 ml Puffer RL2 geben.</li>
	<li>700 μl des Gemisches aus Schritt 8.3 werden in die reine RNA-Säule überführt, die in das Sammelröhrchen eingebettet ist, und bei 8.550 × g bei 4 °C für 1 Minute zentrifugiert. Entsorgen Sie die Abfallflüssigkeit im Auffangröhrchen. HINWEIS: Die reine RNA-Säule ist eine der Komponenten des gesamten RNA-Isolierungskits (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 8.4, um das verbleibende Gemisch aus Schritt 8.3 zu verarbeiten.</li>
	<li>500 μl Puffer RW1 in die reine RNA-Säule geben und bei 8.550 × g bei 4 °C 1 min zentrifugieren. Entsorgen Sie die Abfallflüssigkeit im Auffangröhrchen. HINWEIS: Puffer RW1 ist eine der Komponenten des gesamten RNA-Isolierungskits (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>700 μl Puffer RW2 in die reine RNA-Säule geben und bei 8.550 × g bei 4 °C 1 min zentrifugieren. Entsorgen Sie die Abfallflüssigkeit im Auffangröhrchen. Wiederholen Sie Schritt 8.7 einmal. HINWEIS: Puffer RW2 ist eine der Komponenten im gesamten RNA-Isolierungskit (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Die reine RNA-Säule wieder in das Sammelröhrchen geben und bei 8550 × g bei 4 °C 2 min zentrifugieren, um den verbleibenden Puffer RW2 zu entfernen.</li>
	<li>Übertragen Sie die reine RNA-Säule in ein neues Sammelröhrchen und tropfen Sie 100 μl RNase-freiesddH2O, das bei 65 °C vorgewärmt ist, in die Mitte der Membran für die reine RNA-Säule. Bei 25 °C für 2 min aufstellen und die RNA-Lösung durch Zentrifugieren bei 8.550 × g bei 4 °C für 1 min sammeln. HINWEIS: RNase-freies ddH2O ist eine der Komponenten im gesamten RNA-Isolationskit (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>4 μl 5x Reaktionspuffer, 1 μl Oligo (dT)18-Primer , 1 μl Random-Hexamer-Primer, 1 μl genspezifischer Primer (siehe Tabelle 1), 1 μl Enzymmischung und 5 μg der RNA-Lösung aus Schritt 8.9 in einen 100 μl 8-Röhrchen-Streifen geben. Ergänzen Sie das Reaktionssystem mit RNase-freiem Wasser auf 20 μl.</li>
	<li>Stellen Sie die Reaktionsbedingungen des Systems wie folgt ein: (1): 95 °C, 30 s, 1 Zyklus; (2): 95 °C, 5 s, 50 Zyklen, 60 °C, 34 s; (3): 95 °C, 5 s, 1 Zyklus, 65 °C, 60 s, 97 °C, 1 s; und (4): 42 °C, 30 s, 1 Zyklus. Führen Sie das qRT-PCR-Verfahren aus. ANMERKUNG: Die relativen Expressionsniveaus der Zielgene wurden quantitativ mit der 2−ΔΔCT-Methode 36,37 analysiert. Die Primer-Informationen jedes Gens, das für die qRT-PCR-Analyse verwendet wird, sind in Tabelle 1 aufgeführt.</li>
</ol>9. Statistische Analyse
<ol><li>Geben Sie die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten an.</li>
	<li>Analysieren Sie die Vergleiche zwischen mehreren Gruppen mit Hilfe von Grafik- und Analysesoftware (siehe Materialtabelle) mit einer einseitigen Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von einem Tukey-Test. In dieser Arbeit wurde P < 0,05 als statistisch signifikant definiert.</li>
</ol>

Der Mechanismus von Salidrosid bei der Unterdrückung der Migration und Proliferation von MCF-7-Zellen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Brustkrebs betrifft Menschen jeden Alters und verursacht unkalkulierbare körperliche und seelische Belastungen und einen großen wirtschaftlichen Druck1. Brustkrebs mit seiner von Jahr zu Jahr steigenden Morbidität und Mortalität hat auch weltweite Aufmerksamkeit auf sich gezogen, wenn es darum geht, wirksame pflanzliche Therapien zu finden, die über herkömmliche Behandlungen hinausgehen 4,5. Vielversprechend ist, dass eine große Anzahl von...

Als eine der am häufigsten diagnostizierten Krebsarten und häufigsten bösartigen Erkrankungen zeigen die neuesten Statistiken, dass bis 2020 weltweit 2,3 Millionen Fälle von Brustkrebs aufgetreten sind, was 11,7 % aller Krebsfälle ausmacht1. Häufige Symptome von Brustkrebs sind Brustspannen und -kribbeln, Knoten und Schmerzen in der Brust, Ausfluss aus der Brustwarze, Erosion oder eingesunkene Haut und vergrößerte axilläre Lymphknoten 1,2. Noch alarmierender ist, dass die Zahl der Neuerkrankungen und die Gesamtinzidenz von Brustkrebs jedes Jahr mit einer überwältigenden Rate zunehmen und 6,9 % der krebsbedingten Todesfälle ausmachen1. Derzeit umfasst die Brustkrebsintervention noch hauptsächlich Chemotherapie, Operation, Strahlentherapie und eine umfassende Behandlung. Obwohl die Behandlung die Rezidivrate und die Mortalitätsrate der Patienten wirksam senken kann, führt die langfristige Anwendung der Behandlung häufig zu Multiresistenzen, großflächigem Haarausfall, Übelkeit und Erbrechen sowie zu schweren psychischen und psychischen Belastungen 2,3. Insbesondere das potenzielle Risiko von multiplen Organmetastasen durch Brustkrebs zwingt die Menschen auch dazu, nach neuen pflanzlichen Quellen für die medikamentöse Therapie zu suchen 4,5.
Die Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K)-vermittelte Signalübertragung ist am Wachstum, der Proliferation und dem Überleben von Brustkrebs durch Spleißen beteiligt, das die Expression mehrerer Gene beeinflusst6. Als nachgeschaltetes signalsensitives Protein von PI3K deuten zahlreiche Hinweise darauf hin, dass die Proteinkinase B (AKT) mit dem Säugetier-Target of Rapamycin (mTOR)-Protein koppeln könnte, um Brustkrebs weiter zu erhöhen 7,8,9. Darüber hinaus wurde behauptet, dass die Deaktivierung des PI3K/AKT/mTOR-Signalwegs auch eine Schlüsselkomponente in Medikamenten ist, die die maligne Proliferation hemmen und die Apoptose bei Brustkrebs stimulieren10,11,12. Es ist bekannt, dass eine extreme Hypoxie in der Mikroumgebung des Tumors zu einem massiven Anstieg des Hypoxie-induzierbaren Faktors 1 alpha (HIF-1α) führt, der das Fortschreiten von Brustkrebs weiter verschlechtert13,14,15. Parallel dazu führt die AKT-Stimulation auch zu einer übermäßigen Akkumulation von HIF-1α, wodurch die Apoptose in Brustkrebsproben eingeschränktwird 16,17. Interessanterweise wurde bestätigt, dass die Aktivierung des PI3K-AKT-HIF-1α-Signalwegs an der pathologischen Progression und Metastasierung bei einer Vielzahl von Krebsarten beteiligt ist, darunter Lungenkrebs18, Darmkrebs19, Eierstockkrebs20 und Prostatakrebs21. Neben der Orchestrierung durch HIF-1α wird die Überexpression des Transkriptionsfaktors 1 (FoxO1) auch durch die Stimulation des AKT-Signals ausgelöst, die den Zyklusstillstand und die Hemmung der Apoptose in Brustkrebszellen fördert22,23. Zusammengenommen deuten die oben genannten soliden Beweise darauf hin, dass die Hemmung der Kaskade des PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalwegs ein potenzielles neues Ziel für die medikamentöse Therapie bei Brustkrebs sein könnte.
Es wurde allgemein nachgewiesen, dass Salidrosid (Sal) krebshemmende24,25, hypoxiehemmende 26,27,28,29 und immunstärkende pharmakologische Aktivitätenausübt 30. Es ist ein hellbraunes oder braunes Pulver, das leicht in Wasser löslich ist, eine Art Phenylethanoidglykosid ist und eine chemische Strukturformel vonC14H20O7und ein Molekulargewicht von300,331,32 aufweist. Moderne pharmakologische Untersuchungen haben gezeigt, dass Sal die Apoptose von Magenkrebszellen fördern kann, indem es den PI3K-AKT-mTOR-Signalweg hemmt24. Weitere Hinweise deuten auch darauf hin, dass die Unterdrückung des PI3K-AKT-HIF-1α-Signalwegs durch die Behandlung mit Sal zur Apoptose von Krebszellen beitragen kann, indem sie deren Empfindlichkeit gegenüber Chemotherapeutika erhöht25. Es gibt auch Hinweise darauf, dass Sal die Zellmigration und -invasion einschränkt und einen Zyklusstillstand verursacht, indem es die Apoptose in den menschlichen Brustkrebs-MCF-7-Zellen fördert33,34. Es bleibt jedoch abzuwarten, ob Sal den PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalweg regulieren und die maligne Proliferation von MCF-7-Zellen hemmen kann. Daher zielte dieses Protokoll darauf ab, die Auswirkungen von Sal auf die MCF-7-Zellmigration, -invasion, den Zellzyklus und die Apoptose über den PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalweg zu untersuchen. Die integrierten Forschungsstrategien, die konventionelle, kostengünstige und unabhängige Experimente umfassen, wie z. B. Zellmigrations- und Invasionsbewertungen, Apoptose und Zellzyklusnachweis durch Durchflusszytometrie, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und Ca2+ Fluoreszenzbestimmung usw., können eine Referenz für das Gesamtdesign von Experimenten zur Krebsforschung mit traditioneller Pflanzenmedizin bieten. Der experimentelle Ablauf dieser Studie ist in Abbildung 1 dargestellt.

<table><tbody><tr><td>1% Penicillin/Streptomycin</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>AKT Antikörper</td><td>ImmunoWay Biotechnology Company</td><td>YT0185</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-FITC/PI Kit</td><td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td><td>AP101</td><td></td></tr><tr><td>Automatischer Mikroplatten-Reader</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax iD5</td><td></td></tr><tr><td>Bax Antikörper</td><td>Cell Signaling Technology, Inc.</td><td>#5023</td><td></td></tr><tr><td>BCA-Kit</td><td>Biosharp Life Sciences</td><td>BL521A</td><td></td></tr><tr><td>Bcl-2 Antikörper</td><td>Cell Signaling Technology, Inc.</td><td>#15071</td><td></td></tr><tr><td>Bim-Antikörper-Zellsignaltechnologie</td><td>, Inc.</td><td>#2933</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+– ATPase Assay Kit</td><td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td><td>A070-4-2</td><td></td></tr><tr><td>Zellzählkit-8</td><td>Biosharp Life Sciences</td><td>BS350B</td><td></td></tr><tr><td>Zellzyklus-Färbekit</td><td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td><td>CCS012</td><td></td></tr><tr><td>gespaltene Caspase-3-Zell-Signaltechnologie</td><td>, Inc.</td><td>#9661</td><td></td></tr><tr><td>gespaltene Caspase-7-Zell-Signaltechnologie</td><td>, Inc.</td><td>#8438</td><td></td></tr><tr><td>gespaltene Caspase-9-Zell-Signaltechnologie</td><td>, Inc.</td><td>#20750</td><td></td></tr><tr><td>Kristallviolette Lösung</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>C0121</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Kulturmedium mit hohem Glukosegehalt</td><td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td><td>G4510</td><td></td></tr><tr><td>Doxorubicinhydrochlorid</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-15142</td><td></td></tr><tr><td>ECL Chemilumineszenzlösung</td><td>Biosharp Life Sciences</td><td>BL520B</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Procell Life Science &amp; Verifizierter Lieferant - Technology Co., Ltd.</td><td>164210</td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>BD</td><td>FACSCanto <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/65634/65634eq01.jpg" style="margin: auto; "></td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>S1060</td><td></td></tr><tr><td>FoxO1 Antikörper</td><td>ImmunoWay Biotechnology Company</td><td>YT1758</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG Sekundärantikörper</td><td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td><td>70-GAR0072</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism Software</td><td>La Jolla</td><td>Version 6.0</td><td></td></tr><tr><td>HIF-1&amp;alpha Antikörper</td><td>Affinity Biosciences</td><td>BF8002</td><td></td></tr><tr><td>Humane Brustkrebs-Zelllinie MCF-7</td><td>Procell Life Science &amp; Verifizierter Lieferant - Technology Co., Ltd.</td><td>CL-0149</td><td></td></tr><tr><td>Ladepuffer</td><td>Biosharp Life Sciences</td><td>BL502B</td><td></td></tr><tr><td>LY294002</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10108</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Thermo </td><td></td><td></td>356234</tr><tr><td>mTOR-Antikörper</td><td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>GB11405</tr><tr><td>Na+– K+– ATPase Assay Kit</td><td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td><td>A070-2-2</td><td></td></tr><tr><td>Optisches Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX71PH</td><td></td></tr><tr><td>p-AKT Antikörper</td><td>ImmunoWay Biotechnology Company</td><td>YP0006</td><td></td></tr><tr><td>PI3K Antikörper</td><td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>GB11525</tr><tr><td>p-PI3K Antikörper</td><td>Affinity Biosciences</td><td>AF3241</td><td></td></tr><tr><td>Quantitatives Western-Blot-Bildgebungssystem</td><td>Touch Image Pro</td><td>eBlot</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Transkription Erststrang-cDNA-Synthesekit</td><td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td><td>G3330-100</td><td></td></tr><tr><td>ROS Assay Kit</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>S0033S</td><td>DCFH-DA Fluoreszenzsonde ist hier enthalten</td></tr><tr><td>Salidrosid</td><td>Chengdu Herbpurify Co., Ltd.</td><td>H-040</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Bausatz</td><td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td><td>G2003-50T</td><td></td></tr><tr><td>Gesamt-RNA-Isolationskit</td><td>Foregene</td><td>RE-03014</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>HyClone</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>β-Aktin</td><td>Affinity Biosciences</td><td>AF7018</td><td></td></tr></tbody></table>

erforschung der pharmakologischen wirkung und des molekularen mechanismus von salidrosid bei der hemmung der proliferation und migration von mcf-7-zellen

Exploring the Pharmacological Action and Molecular Mechanism of Salidroside in Inhibiting MCF-7 Cell Proliferation and Migration

Salidrosid (Sal) enthält antikarzinogene, antihypoxische und entzündungshemmende pharmakologische Aktivitäten. Die zugrundeliegenden Anti-Brustkrebs-Mechanismen sind jedoch nur unvollständig aufgeklärt. Daher sollte dieses Protokoll das Potenzial von Sal bei der Regulierung des PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalwegs bei der malignen Proliferation menschlicher Brustkrebs-MCF-7-Zellen entschlüsseln. Zunächst wurde die pharmakologische Aktivität von Sal gegen MCF-7 mittels CCK-8 und Zell-Scratch-Assays untersucht. Darüber hinaus wurde die Resistenz von MCF-7-Zellen durch Migrations- und Matrigel-Invasions-Assays gemessen. Für Zellapoptose und Zyklusassays wurden MCF-7-Zellen schrittweise mit Annexin V-FITC/PI bzw. Zellzyklus-Färbe-Detektionskits für Durchflusszytometrie-Analysen prozessiert. Die Gehalte an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und Ca2+ wurden mittels DCFH-DA und Fluo-4 AM Immunfluoreszenzfärbung untersucht. Die Aktivitäten von Na+-K+-ATPase undCa2+-ATPase wurden mit den entsprechenden kommerziellen Kits bestimmt. Die Protein- und Genexpressionsniveaus in der Apoptose und im PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalweg wurden mit Hilfe von Western-Blot- bzw. qRT-PCR-Analysen bestimmt. Wir fanden heraus, dass die Sal-Behandlung die Proliferation, Migration und Invasion von MCF-7-Zellen mit dosisabhängigen Effekten signifikant einschränkte. In der Zwischenzeit zwang die Sal-Verabreichung auch MCF-7-Zellen auf dramatische Weise dazu, Apoptose und Zellzyklus-Arrest zu durchlaufen. Die Immunfluoreszenztests zeigten, dass Sal die Produktion von ROS und Ca2+ in MCF-7-Zellen beobachtbar stimulierte. Weitere Daten bestätigten, dass Sal die Expressionsniveaus der pro-apoptotischen Proteine Bax, Bim, gespaltener Caspase-9/7/3 und der entsprechenden Gene förderte. Konsequenterweise reduzierte die Sal-Intervention die Expression der Proteine Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α und FoxO1 und ihrer entsprechenden Gene deutlich. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Sal als potenzielle pflanzliche Verbindung zur Behandlung von Brustkrebs verwendet werden kann, da es die maligne Proliferation, Migration und Invasion von MCF-7-Zellen reduzieren kann, indem es den PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalweg hemmt.

Auswirkungen von Sal auf die Hemmung der übermäßigen Proliferation und die Verzögerung der Wundheilung in MCF-7-Zellen Um das Potenzial von Sal gegen Brustkrebs zu untersuchen, testeten wir zunächst seine krebshemmenden Eigenschaften mit Hilfe von Zellproliferationstoxizität und Scratch-Assays der menschlichen Brustkrebs-MCF-7-Zelllinie. Diese Zellen wurden mit einer Konzentrationsreihe von Sal (5-320 μM) für 24 h co-inkubiert, und die Zellproliferation wurde mit einem CCK-8-Assay bewertet. Es wurde e...

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine umfassende Strategie zur Bewertung der pharmakologischen Wirkung und des Mechanismus von Salidrosid bei der Hemmung der Proliferation und Migration von MCF-7-Zellen.

Erforschung der pharmakologischen Wirkung und des molekularen Mechanismus von Salidrosid bei der Hemmung der Proliferation und Migration von MCF-7-Zellen

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer ...

Wir konzentrieren uns auf die Erforschung von Wirkstoffen aus Naturstoffen und ihrem Potenzial bei der Behandlung von Brustkrebs. Konkret wollen wir die pharmakologischen Wirkungen von Salidrosid und seine molekularen Mechanismen bei der Kombination von Brustkrebs aufklären. Derzeit fehlen zuverlässige experimentelle Techniken, um die molekularen Ziele von Salidrosid bei der Behandlung von Brustkrebs zu validieren.Eine wichtige Erkenntnis auf diesem Gebiet ist ein potenzieller molekularer Mechanismus von Salidrosid bei der Verbesserung der Proliferation und Migration von MCF7-Zellen durch die Regulation des PI3K/AKT/HIF-1 alpha/FoxO1-Signalwegs. Die zukünftige Forschung des Labors besteht direkt darin, die pathophysiologischen Mechanismen zu erforschen, die dem Beginn, der Entwicklung, der Prognose und dem Ausgang von Brustkrebs zugrunde liegen. Darüber hinaus suchen wir nach aktiven niedermolekularen Medikamenten aus natürlichen Quellen, die zur Brustkrebsprävention und -behandlung beitragen können.

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Wir beschreiben zwei komplementäre Methoden, die den Fluoreszenz-Ubiquitinations-Zellzyklus-Indikator (FUCCI) und Bildanalyse oder Durchflusszytometrie verwenden, um Zellen in den inneren G1-arretierten und äußeren proliferierenden Regionen von 3D-Sphäroiden zu identifizieren und zu isolieren.

Imaging- und Durchflusszytometrie-basierte Analyse von Zellposition und den Zellzyklus in 3D Melanoma Spheroids

Dieses Manuskript wird beschrieben, wie Schnitt-ähnliche Läsionen am kultivierten Epithelzelle Monolagen günstig Modell Heilung in-vitro-, so dass für die Bildgebung durch konfokale gewickelt oder laser-scanning-Mikroskopie, und die bieten qualitativ hochwertige quantitative und qualitative Daten für das Studium Zelle Verhalten und die Mechanismen, die bei der Migration.

Mikroskopie-basierten Methoden für die Beurteilung der Epithelzelle Migration bei der In-vitro- Wundheilung

Hier stellen wir ein Protokoll für einen In-vitro-Scratch-Assay mit primären Fibroblasten und für einen in vivo Hautwundheilungstest bei Mäusen vor. Beide Assays sind einfache Methoden zur Beurteilung der In-vitro- und In-vivo-Wundheilung.

Scratch Migration Assay und Dorsal Skinfold Kammer für In Vitro und In Vivo Analyse der Wundheilung

Die Ausweichung von natürlichen Killer (NK) zellvermittelten Ausrottungen durch Krebszellen ist wichtig für die Krebsinitiierung und Progression. Hier stellen wir zwei nicht-radioaktivitätsbasierte Protokolle zur Bewertung der mit NK zellvermittelten Zytotoxizität gegenüber lebertumorzellen vor. Darüber hinaus wird ein drittes Protokoll zur Analyse der NK-Zellmigration vorgestellt.

Messung der natürlichen Killerzell-vermittelten Zytotoxizität und Migration im Kontext von leberassoziierten Tumorzellen

In dieser Studie stellen wir ein Echtzeit-Bildgebungsverfahren unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie vor, um Zellen zu beobachten, die sich durch Ex-vivo-Inkubation mit dem Cochlea-Epithel, das das Organ von Corti enthält, in Richtung geschädigtes Gewebe bewegen.

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging zur Erforschung der Zellmigration zum Organ von Corti

Erfahren Sie die pharmakologische Wirkung von Salidrosid bei der Hemmung von Proliferation und Migration von MCF-7-Brustkrebszellen. Diese Studie untersucht den molekularen Mechanismus über den PI3K-AKT-HIF-1a-FoxO1-Signalweg.

Erforschung der pharmakologischen Wirkung und des molekularen Mechanismus von Salidrosid bei der Hemmung der Proliferation und Migration von MCF-7-Zellen (Video) | JoVE Journal

Erforschung der pharmakologischen Wirkung und des molekularen Mechanismus von Salidrosid bei der Hemmung der Proliferation und Migration von MCF-7-Zellen

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