Herstellung von einlagigen Graphen-beschichteten Gittern für die Kryoelektronenmikroskopie
8. September 2023
Hier beschreiben wir ein Protokoll zum Auftragen einer einzelnen Monoschicht aus Graphen auf Elektronenmikroskopie-Gitter und wie sie für die Verwendung in der KryoEM-Strukturbestimmung vorbereitet werden können.
Die optimale Konservierung biologischer Proben ist derzeit eine große Herausforderung bei der Gewinnung hochauflösender KryoEM-Strukturen. Während des Probenvorbereitungsprozesses werden die Proben einer hydrophoben Luft-Wasser-Grenzfläche ausgesetzt, die denaturierende Auswirkungen auf die Proben hat und dazu führen kann, dass stabile Proben eine bevorzugte Ausrichtung im Eis einnehmen, was eine hochauflösende Strukturbestimmung verhindert. Die Beschichtung von CryoEM-Gittern mit einer dünnen Kohlenstoffschicht aus weichem Graphenoxid wird häufig verwendet, um Probleme im Zusammenhang mit Wechselwirkungen mit der Luft-Wasser-Grenzfläche zu lösen.
Diese Schichten verstärken jedoch oft das Hintergrundrauschen in unseren Bildern, was die Auflösung unserer Struktur beeinträchtigt. Die Beschichtung des Gitters mit einer Monoschicht aus Graphen erreicht einen ähnlichen Schutz, ohne nennenswerte Hintergrundgeräusche zu erzeugen. Die Verwendung von graphenbeschichteten CryoEM-Gittern kann dazu beitragen, Probleme im Zusammenhang mit Wechselwirkungen mit der Luft-Wasser-Grenzfläche zu lösen, kommerzielle Graphengitter sind jedoch teuer und viele Labore halten Graphengitter für zu kompliziert, um sie intern herzustellen.
Forscher auf dem Gebiet der KryoEM können nun dieses Schritt-für-Schritt-Protokoll verwenden, um Dutzende von qualitativ hochwertigen Graphenen an einem Tag vollständig zu reproduzieren.
Übersicht
Diese Studie befasst sich mit der Herausforderung, biologische Proben für hochauflösende Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) optimal zu konservieren. Die Autoren stellen ein Protokoll zur Beschichtung von EM-Rastern mit einer einzelnen Monolage aus Graphen vor, um Hintergrundrauschen zu minimieren und die Probenintegrität während der Bildgebung zu verbessern.
Wichtige Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Kryo-Elektronenmikroskopie
- Probenkonservierung in der biologischen Bildgebung
- Graphen-Anwendungen in der Mikroskopie
Hintergrund
- Die Konservierung biologischer Proben ist entscheidend für hochauflösende Kryo-EM-Strukturen.
- Traditionelle Kohlenstoffbeschichtungen können Hintergrundrauschen in der Bildgebung erhöhen.
- Graphen bietet eine Schutzschicht, ohne die Bildqualität zu beeinträchtigen.
Verwendete Methoden
- Aufbringen einer Monolage aus Graphen auf EM-Raster
- Kryo-EM-Bildgebungstechniken
- Verwendung von selbstgebauten Spin Coatern und verschiedenen Reinigungsmitteln
Hauptergebnisse
- Graphen-beschichtete Raster zeigen reduziertes Hintergrundrauschen bei der Bildgebung.
- Die Methode ermöglicht die Massenproduktion hochwertiger Graphen in einem Tag.
- EM-Raster demonstrieren eine effektive Konservierung und Konzentration biologischer Proben.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet einen unkomplizierten Ansatz für Labore zur Herstellung von graphenbeschichteten EM-Rastern.
- Dieser Fortschritt erhöht das Potenzial für verbesserte Kryo-EM-Bildgebung in der biologischen Forschung.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
High-resolution cryoEM is pivotal for structural biology and drug discovery, but sample denaturation and orientation bias at the air-water interface limit data quality and throughput. Monolayer graphene-coated grids address these bottlenecks by preserving macromolecular integrity and reducing background noise, directly impacting early discovery and target validation. Scalable in-house fabrication of graphene grids enables broader adoption, supporting portfolio-wide structural studies and accelerating mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-fidelity structural interrogation of macromolecular complexes for target validation.
- Reduces denaturation and aggregation, supporting mechanistic de-risking in early discovery.
- Improves orientation diversity, enhancing predictive confidence in structural models.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of reproducible, low-background cryoEM grids for downstream screening.
- Supports quantitative imaging by minimizing noise and concentration artifacts.
- Enables reliable evaluation of protein complexes at lower sample concentrations.
Translational & Preclinical Research
- Improves continuity from discovery to preclinical validation by supporting robust structural data generation.
- Aligns with translational biomarker development through enhanced structural resolution.
- Reduces risk of late-stage failures due to ambiguous or compromised structural data.
Pipeline & Workflow Integration
Monolayer graphene-coated grids integrate into the cryoEM workflow from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis-driven structural studies and enabling reproducible, high-quality imaging.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by preserving native macromolecular conformations.
- Screening: Provides standardized, reproducible grids for quantitative cryoEM assays.
- Analytics: Delivers low-noise, high-resolution images for robust comparative analysis.
- Translational Research: Enhances preclinical continuity by enabling reliable structural characterization of therapeutic candidates.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, cost-effective platform for repeated structural studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural biology.
- Operational Value: Standardizes grid preparation, improves reproducibility, and enables batch scalability.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk through higher-quality data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryoEM grid handling and graphene manipulation.
- Needs access to spin coaters, fume hoods, and standard EM grid preparation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible grid quality and imaging results.
- Adaptation may be needed for different protein classes or sample types.
- Potential limitations include handling sensitivity and initial training for graphene transfer steps.
