Name: Herstellung von einlagigen Graphen-beschichteten Gittern für die Kryoelektronenmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von einlagigen Graphen-beschichteten Gittern für die Kryoelektronenmikroskopie. Diese Methode reduziert Hintergrundrauschen und verbessert die Probenerhaltung bei hochauflösenden Strukturanalysen biologischer Proben.

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Wir danken Dr. Xiao Fan für die hilfreichen Gespräche bei der Etablierung dieser Methoden bei Scripps Research. B.B. wurde durch ein Postdoktoranden-Forschungsstipendium der Hewitt Foundation for Medical Research unterstützt. W.C. wird durch ein Prädoktorandenstipendium der National Science Foundation unterstützt. D.E.P wird von den National Institutes of Health (NIH) unterstützt, die NS095892 an G.C.L. Dieses Projekt wurde auch durch NIH-Zuschüsse GM142196, GM143805 und S10OD032467 an G.C.L.

Beschichtung von TEM-Gittern mit einer Graphen-Monoschicht

<ol><li>Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+electron+dose+rate+on+electron+counting+images+recorded+with+the+K2+camera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Influence of electron dose rate on electron counting images recorded with the K2 camera.</a> Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).</li>
<li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN2%3A+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li>
<li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, 1-22 (2018).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoSPARC%3A+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-atomic+resolution+reconstructions+of+icosahedral+viruses+from+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 21 (2), 265-273 (2011).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li>
<li>Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+individual+atoms+of+protein+complex+by+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Resolving individual atoms of protein complex by cryo-electron microscopy.</a> Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).</li>
<li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).</li>
<li>Schultz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).</li>
<li>Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+blot-and-plunge+freezing+of+biological+specimens+for+single-particle+cryogenic+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. 2022 (180), 1-16 (2022).</li>
<li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins%2C+interfaces%2C+and+cryo-em+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Colloid+%26+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Proteins, interfaces, and cryo-em grids.</a> Current Opinion in Colloid & Interface Science. 25 (3), 289-313 (2016).</li>
<li>Glaeser, R. M., Han, B. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opinion%3A+hazards+faced+by+macromolecules+when+confined+to+thin+aqueous+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Opinion: hazards faced by macromolecules when confined to thin aqueous films.</a> Biophysics Reports. 3 (1-3), 1-7 (2017).</li>
<li>Han, B. G., Watson, Z., Cate, J. H. D., Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer-crystal+streptavidin+support+films+provide+an+internal+standard+of+cryo-EM+image+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Monolayer-crystal streptavidin support films provide an internal standard of cryo-EM image quality.</a> Journal of Structural Biology. 200 (3), 307-313 (2017).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> eLife. 7, 1-42 (2018).</li>
<li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).</li>
<li>Liu, N., Wang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+cryo-EM+specimen+preparation%3A+how+to+deal+with+the+air-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Better cryo-EM specimen preparation: how to deal with the air-water interface.</a> Journal of Molecular Biology. 435 (9), 167926(2022).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+effects+of+particle+adsorption+to+the+air-water+interface+in+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM.</a> Nature Methods. 15 (10), 793-795 (2018).</li>
<li>Palovcak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+robust+procedure+for+preparing+graphene-oxide+cryo-EM+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).</li>
<li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+carbon+films+with+%7E500nm+holes+for+cryo-EM+with+a+direct+detector+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Fabrication of carbon films with ~500nm holes for cryo-EM with a direct detector device.</a> Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).</li>
<li>Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+oxide%3A+A+substrate+for+optimizing+preparations+of+frozen-hydrated+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples.</a> Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).</li>
<li>Pantelic, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene%3A+substrate+preparation+and+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Graphene: substrate preparation and introduction.</a> Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).</li>
<li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+towards+an+optimal+specimen+support+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Progress towards an optimal specimen support for electron cryomicroscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 37, 81-89 (2016).</li>
<li>Passmore, L. A., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specimen+preparation+for+high-resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Specimen preparation for high-resolution cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+monolayer+graphene+grids+for+near-atomic+resolution+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+ultraclean+atomically+thin+membranes+for+atomic-resolution+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Robust ultraclean atomically thin membranes for atomic-resolution electron microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 541(2020).</li>
<li>Ahn, E., Kim, B., Cho, U. -S. Batch production of high-quality graphene grids for cryo-EM: cryo-EM structure of Methylococcus capsulatus soluble methane monooxygenase hydroxylase. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhn%2C+E+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. (Cvd), (2021).</li>
<li>Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li>
<li>Fan, H., Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+graphene+grids+for+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Developing graphene grids for cryoelectron microscopy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 937253(2022).</li>
<li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> eLife. 8, e42747(2019).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+copper+step+beams+during+graphene+growth+by+CVD+method%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Surface+Science%22%5BJournal%5D)">Evolution of copper step beams during graphene growth by CVD method.</a> Applied Surface Science. 610, 155518(2023).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+thin+ice+on+ultraflat+graphene+for+high-resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM.</a> Nature Methods. 20 (1), 123-130 (2023).</li>
<li>Fujita, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epoxidized+graphene+grid+for+highly+efficient+high-resolution+cryoEM+structural+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis.</a> Scientific Reports. 13, 2279(2023).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+graphene+grids+with+various+charges+for+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM.</a> Nature Communications. 13, 6718(2022).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Die Konservierung biologischer Proben in einer dünnen Schicht Glaseis ist ein entscheidender Schritt für die hochauflösende KryoEM-Strukturbestimmung. Die Forscher stoßen jedoch häufig auf Probleme, die sich aus der Interaktion mit dem AWI ergeben, was zu bevorzugter Orientierung, komplexer Zerlegung, Denaturierung und Aggregation führt. Darüber hinaus können die Proben nicht immer ausreichend konzentriert werden, um das dünne Eis zu besiedeln, das über den Löchern einer gefensterten Folie hängt. Mehrere Forschungsgruppen haben Methoden entwickelt, um EM-Gitter mit einer Monoschicht aus Graphen zu beschichten, um einige dieser Einschränkungen zu überwinden 24,25,26,27,28,29,30, und Graphengitter wurden mit großem Erfolg eingesetzt. Hier stellen wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Verfügung, wie Sie Chargen von Graphengittern effektiv im eigenen Haus vorbereiten und die Qualität der Graphengitter mittels TEM untersuchen können. Wir betonen, dass bei einigen der kritischen Schritte, die wir im Folgenden skizzieren, besondere Vorsicht geboten ist.
Graphen hat eine starke Tendenz, Luftschadstoffe anzuziehen. Daher ist es wichtig, während des Herstellungsprozesses des Graphengitters sicherzustellen, dass alle Werkzeuge, die mit der Graphen-/Cu-Folie oder den Gittern in Kontakt kommen, sauber und staubfrei sind. Deckgläser, die zum Transfer von Graphen verwendet werden, können durch Spülen mit Ethanol und DI-Wasser oder mit einem Staubwedel gereinigt werden. Es wird auch empfohlen, unter einem Abzug zu arbeiten und Graphenplatten und -gitter immer mit Folie oder einer sauberen Glasplatte bedeckt zu halten. Staub oder Verunreinigungen auf den Gittern können verhindern, dass Graphen vollständig an den EM-Gittern haftet. Bei der Handhabung von Graphen oder graphenbeschichteten Gittern ist es wichtig, elektrisch geerdet zu sein, um eine Beschädigung der Graphenfolie durch statische Entladung zu vermeiden. Statische Entladungen können vermieden werden, indem ein Erdungsband am Handgelenk verwendet wird, ein geerdetes Metallobjekt jedes Mal berührt wird, wenn Graphen oder Graphengitter gehandhabt werden, und/oder kein Handschuh an der Hand getragen wird, die die Pinzette24 hält.
Da eine Monolage aus Graphen sehr dünn ist (die Breite eines Kohlenstoffatoms), ist es wichtig, Graphen bei der Übertragung von Graphen auf Gitter mit einer organischen Schicht wie MMA oder Poly-MMA (PMMA) zu unterstützen. PMMA ist das am weitesten verbreitete Material für den Graphentransfer. PMMA hat jedoch eine starke Affinität zu Graphen und kann oft zu Polymerverunreinigungen auf dem Graphenfilm führen. In diesem Protokoll wird MMA verwendet, da es weniger Restkontamination hinterlässt25. Sowohl PMMA als auch MMA haben jedoch den Nachteil, dass sich Falten und Risse bilden, die in einigen Bereichen des Graphenfilms zu beobachten sind (Abbildung 3B). Es kann schwierig sein, diese Falten zu vermeiden, da sie häufig während des Graphenwachstums mit der CVD-Methodeauftreten 31. Kürzlich wurde ein Verfahren entwickelt, um ultraflaches Graphen faltenfrei zu züchten, wobei die Kupferfolie durch einen Cu(111)/Saphir-Wafer als Wachstumssubstrat32 ersetzt wird.
Unserer Erfahrung nach ist es besser, Graphen/Cu-Platten zu kaufen und das Graphen mit MMA im eigenen Haus zu unterstützen, als polymerummantelte Cu-Graphen-Platten von Herstellern zu kaufen, die nach dem Kupferätzen spröde werden und in nachfolgenden Schritten nur schwer zu handhaben sind. Der Spin Coater, den wir für die MMA-Beschichtung verwendet haben, kann kostengünstig mit Teilen aus einem lokalen Computer-/Baumarkt gebaut werden, wie zuvor beschrieben25.
Während des Schritts der MMA-Beschichtung ist es wichtig, die gesamte Graphenoberfläche auf der Cu-Graphen-Folie mit MMA zu bedecken. Nachdem das Cu weggeätzt wurde, wird MMA-Graphen halbtransparent, und Bereiche, die keine MMA-Abdeckung haben, sehen wie leere Löcher aus. Um eine MMA-Beschichtung auf der Kupferseite zu verhindern, ist es wichtig, während der Beschichtung ein kleines Stück Löschpapier darunter zu legen, damit es überschüssiges MMA, das sich aus der CVD-Folie herausdreht, aufsaugt.
Nach dem Ätzen und Spülen kann die MMA/Graphen-Folie mit einem kommerziellen oder selbstgebauten Trogsystem mit einer Spritze oder einer Peristaltikpumpe zur Kontrolle des Wasserstands auf EM-Gitter übertragen werden. Vor dem Transfer ist es wichtig, die Gitter in aufeinanderfolgenden Bädern mit Chloroform, Aceton und IPA gründlich vorzuspülen. Das Einbrennen von graphenbeschichteten Gittern bei 65 °C trägt dazu bei, die Integrität des Graphens zu erhalten und die Adsorption von Graphen an die Gitter zu fördern. Um eine MMA-Kontamination auf den Gittern zu vermeiden, ist es wichtig, MMA gründlich in einem Acetonbad zu entfernen und die Gitter in IPA zu reinigen. Alle ungewaschenen MMA-Rückstände werden auf EM-Gittern beobachtet und verringern das Signal-Rausch-Verhältnis der Bilder (Abbildung 3C). Der Aceton-IPA-Waschvorgang kann wiederholt werden, um die Graphenoberflächen weiter zu reinigen.
Um die Graphengitter hydrophil zu machen, haben wir die Gitter UV/Ozon ausgesetzt. Verschiedene Modelle von UV/Ozon-Reinigern müssen möglicherweise optimiert werden, um die Graphenschicht für die KryoEM-Probenvorbereitung ausreichend mit Sauerstoff anzureichern, ohne das Graphen zu beschädigen. Unabhängig vom System ist es wichtig, diese Gitter unmittelbar nach der UV/Ozon-Behandlung für die Anwendung von KryoEM-Proben zu verwenden. Alternative Methoden, um Graphengitter hydrophil zu machen, werden in anderen Studien beschrieben33,34.

Die kryogene Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie (KryoEM) ist eine zunehmend anwendbare Technologie zur Untersuchung der 3D-Strukturen von Biomakromolekülen. Technologische Fortschritte in der Elektronenmikroskopoptik, der direkten Elektronendetektion1 und Computeralgorithmen 2,3,4 haben es in den letzten zehn Jahren ermöglicht, KryoEM-Anwender in die Lage zu versetzen, die Strukturen biochemisch stabiler makromolekularer Komplexe mit nahezu atomarer Auflösung zu bestimmen 5,6,7,8 . Trotz dieser Fortschritte gibt es nach wie vor erhebliche Hindernisse für die Konservierung von Proben für die KryoEM-Bildgebung, die verhindern, dass die meisten biologischen Proben mit so hohen Auflösungen aufgelöst werden können.
Bei der Probenvorbereitung für die hochauflösende KryoEM-Analyse werden Makromoleküle, die gleichmäßig in einer Vielzahl von Orientierungen verteilt sind, in einer dünnen Schicht aus verglastem Eis eingefangen. Die "Blot-and-Plunge"-Methoden des Einfrierens sind die am weitesten verbreiteten Methoden, um dünne Schichten biologischer Proben auf Gittern für KryoEM-Studien zu erzeugen 9,10. Bei diesen Verfahren werden einige Mikroliter Probenlösung auf ein EM-Gitter aufgebracht, das einen gefensterten Film enthält, der hydrophil gemacht wurde, und anschließend wird der größte Teil der Probe mit Filterpapier abgetupft, bevor das Gitter schnell in ein Kryogen aus flüssigem Ethan oder Ethan-Propan-Gemisch9 getaucht wird.
Während diese Methode erfolgreich zur Strukturbestimmung eines breiten Spektrums biologischer Proben eingesetzt wurde, setzen alle gängigen KryoEM-Probenvorbereitungsmethoden die Proben der hydrophoben Luft-Wasser-Grenzfläche (AWI) aus, was häufig Probleme mit sich bringt, die die hochauflösende Strukturbestimmung einschränken. Es ist erwiesen, dass biologische Proben eine hohe Neigung zur Denaturierung aufweisen, wenn sie dem AWI ausgesetzt sind, was zu einer komplexen Aggregation und Zerlegung führen kann11,12,13,14. Darüber hinaus bewirken hydrophobe Flecken auf den Oberflächen biologischer Proben, dass Partikel bevorzugte Orientierungen im Eis einnehmen12. In vielen Szenarien zwingt eine einzige hydrophobe Region der Probe alle Partikel dazu, eine singuläre Orientierung im Eis einzunehmen, wodurch die Fähigkeit, eine zuverlässige Rekonstruktion zu erzeugen, aufgehoben wird. Zusätzlich zu den Problemen mit dem AWI können die Proben eine Affinität zur Oberfläche der gefensterten Filmschicht aufweisen, wodurch die Anzahl der im Eis suspendierten Partikel innerhalb der Löcher15 begrenzt wird.
Es wurden verschiedene methodische und technologische Lösungen entwickelt, um diese Probleme, die sich aus Interaktionen mit dem AWI oder den Filmen ergeben, zu verringern16,17. Ein beliebter Ansatz besteht darin, die gefensterte Folie der EM-Gitter mit einer dünnen (zehn Nanometer) Schicht aus amorphem Kohlenstoff zu beschichten. Diese Beschichtung bietet eine durchgehende Oberfläche über die Löcher, an die Partikel adsorbieren können, mit dem Vorteil, dass die Probe teilweise vor Wechselwirkungen mit dem AWIabgeschirmt wird 15,18,19,20. Die zusätzliche Kohlenstoffschicht erhöht jedoch die Menge des Hintergrundsignals in den abgebildeten Bereichen und führt zu Rauschen, das die erreichbare Auflösung beeinträchtigen kann, insbesondere bei kleinen (<150 kDa) Proben. In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass die Verwendung von Graphenoxid (GO)-Flocken zur Herstellung von Trägerfilmen auf KryoEM-Gittern Vorteile gegenüber herkömmlichem amorphem Kohlenstoff hat. GO-Flocken werden durch die Oxidation von Graphitschichten hergestellt, was zu pseudokristallinen Schichten aus einschichtigem Graphit führt, die aufgrund ihres hohen Sauerstoffgehalts in Form von Carboxyl-, Hydroxyl- und Epoxidgruppen an den Oberflächen und Kanten hydrophil sind. Kommerzielle GO-Flocken in wässrigen Suspensionen sind kostengünstig, und es gibt zahlreiche veröffentlichte Verfahren zum Auftragen von GO-Flocken auf EM-Gitter18,21. Diese Methoden führen jedoch häufig zu Gittern, die nur teilweise mit GO-Flocken bedeckt sind, sowie zu Bereichen, die mehrere Schichten von GO-Flocken enthalten. Darüber hinaus tragen GO-Flocken zu KryoEM-Bildern ein wahrnehmbares Hintergrundsignal bei, das dem von dünnem amorphem Kohlenstoff22,23 nahe kommt.
Reines einschichtiges Graphen, das aus einem einzigen kristallinen 2D-Array von Kohlenstoffatomen besteht, unterscheidet sich von GO dadurch, dass es im Elektronenmikroskop keinen Phasenkontrast erzeugt. Monolagiges Graphen kann somit verwendet werden, um eine unsichtbare Trägerschicht für die Abbildung biologischer Proben zu erzeugen. Monolayer-Graphen ist auch stärker als GO und kann als einzelne Monoschicht auf ein EM-Gitter aufgetragen werden, und die jüngsten Fortschritte bei der Herstellung von Graphen-beschichteten EM-Gittern haben es ermöglicht, einschichtige Graphengitter mit hoher Abdeckung im eigenen Haus herzustellen 24,25,26,27,28,29,30. Trotz der Vorteile der Verwendung von graphenbeschichteten Gittern für die Bestimmung der KryoEM-Struktur sind sie aufgrund der unerschwinglichen Kosten kommerzieller Optionen und der Komplexität der internen Produktion nicht weit verbreitet. Hier beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur effektiven Herstellung von EM-Gittern, die mit einer Monoschicht aus Graphen bedeckt sind, für die KryoEM-Strukturbestimmung biologischer Proben (Abbildung 1). Durch die Befolgung dieses detaillierten Protokolls können KryoEM-Forscher an einem einzigen Tag Dutzende von hochwertigen Graphen-Trägergittern reproduzierbar herstellen. Die Qualität der graphenbeschichteten Gitter kann mit einem Low-End-Transmissionselektronenmikroskop (TEM), das mit einem LaB6-Filament ausgestattet ist, leicht untersucht werden.

<table><tbody><tr><td>70% EtOH</td><td>Pharmco (190 pf EtOH)</td><td>241000190CSGL</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501-4L</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat (APS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>215589-500g</td><td>Gefährlich; äußerste Vorsicht walten lassen</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2432-1L</td><td></td></tr><tr><td>Klemm-TEM-Gitterhalterblock für 45 Gitter</td><td>PELCO</td><td>16830-45</td><td></td></tr><tr><td>Computer Lüfter</td><td>Amazon (Noctua)</td><td>B07CG2PGY6</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Bellco Glas</td><td>1203J71</td><td>Standard Deckgläser</td></tr><tr><td>Kristallisationsschale</td><td>Pyrex</td><td>3140-100</td><td></td></tr><tr><td>Elektronik Staubwedel</td><td>Falcon Sicherheitsprodukte</td><td>75-37-6</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Staubtuch</td><td>Heftklammern</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapiere</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette mit feiner Spitze</td><td>Dumont</td><td>0508-L4-PO</td><td></td></tr><tr><td>Flasche</td><td>Pyrex</td><td>4980-500</td><td></td></tr><tr><td>Gabel</td><td>Supermarkt</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glaspasteurpipette</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>Graphen/Cu</td><td>Graphenea</td><td>N/A</td><td>CVD Monoschicht Graphen cu</td></tr><tr><td>Gitterbeschichtung Trog</td><td>Ladd Research Industries</td><td>10840</td><td>Zerbrechliches</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>Kaptonband</td><td>Amazon (MYJOR)</td><td>MY-RZY001</td><td>Polyimidband</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Langer Zwerg</td><td>Cole Parmer Essentials</td><td>UX-07387-15</td><td></td></tr><tr><td>Gitterhalter aus Metall</td><td>Ted Pella</td><td>16820-81</td><td></td></tr><tr><td>MMA(8.5)MMA EL 6</td><td>KAYAKU Advanced Materials</td><td>M31006 0500L 1GL</td><td>Entflammbares</td></tr><tr><td>Modell 10 Laborofen</td><td>Quincy Lab, Inc.</td><td></td><td></td>FO19013</tr><tr><td>Petrischale</td><td>Pyrex</td><td>3610-102</td><td></td></tr><tr><td>Plasmareiniger (Solarus 950)</td><td>Gatan, Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>Fiskars</td><td>194813-1010</td><td></td></tr><tr><td>Standard Analog Orbital Shaker</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr><tr><td>UltrAuFoil R1.2/1.3 - Au300</td><td>Quantifoil</td><td>N/A</td><td>Holey Gold Gitter</td></tr><tr><td>Ultraviolett Ozon Reinigungssysteme</td><td>UVOCS</td><td>Modell T10X10/OES</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von einlagigen graphen-beschichteten gittern für die kryoelektronenmikroskopie

Fabrication of Monolayer Graphene-Coated Grids for Cryoelectron Microscopy

Die kryogene Elektronenmikroskopie (KryoEM) hat sich als leistungsfähige Technik zur Untersuchung der atomaren Struktur makromolekularer Komplexe erwiesen. Die Probenvorbereitung für die KryoEM erfordert die Konservierung der Proben in einer dünnen Schicht aus glasartigem Eis, die in der Regel in den Löchern einer gefensterten Trägerfolie aufgehängt ist. Alle gängigen Probenvorbereitungsansätze für KryoEM-Studien setzen die Probe jedoch der Luft-Wasser-Grenzfläche aus, was zu einem starken hydrophoben Effekt auf die Probe führt, der häufig zu Denaturierung, Aggregation und komplexer Dissoziation führt. Darüber hinaus beeinflussen bevorzugte hydrophobe Wechselwirkungen zwischen Regionen der Probe und der Luft-Wasser-Grenzfläche die Orientierungen der Makromoleküle, was zu 3D-Rekonstruktionen mit anisotroper Richtungsauflösung führt. 
Es hat sich gezeigt, dass die Adsorption von KryoEM-Proben an einer Monoschicht aus Graphen dazu beiträgt, Wechselwirkungen mit der Luft-Wasser-Grenzfläche zu mildern und gleichzeitig die Einführung von Hintergrundrauschen zu minimieren. Graphenträger bieten auch den Vorteil, dass sie die erforderliche Konzentration von Proteinen, die für die KryoEM-Bildgebung erforderlich sind, erheblich senken. Trotz der Vorteile dieser Stützen werden graphenbeschichtete Gitter aufgrund der unerschwinglichen Kosten für kommerzielle Optionen und der Herausforderungen, die mit der hauseigenen Produktion in großem Maßstab verbunden sind, von der KryoEM-Community nicht häufig verwendet. In diesem Artikel wird eine effiziente Methode zur Herstellung von Chargen von KryoEM-Gittern beschrieben, die eine nahezu vollständige Abdeckung mit einlagigem Graphen aufweisen.

Die erfolgreiche Ausführung des hier beschriebenen Protokolls zur Herstellung von Graphengittern führt zu EM-Gittern, die vollständig mit einer einzigen Monoschicht aus Graphen beschichtet sind. Die Graphenbedeckung der Gitter kann mit jedem TEM überprüft werden. Da eine Monolage aus reinem Graphen im TEM nahezu unsichtbar ist, muss man sie mit dem Beugungsmodus des Mikroskops untersuchen und Bragg-Punkte beobachten, die der hexagonalen Anordnung der Kohlenstoffatome entsprechen, aus denen das Graphen besteht (Abbildung 3A). Es ist normal, gelegentlich einige Falten von einlagigem Graphen zu beobachten, die während der MMA-Beschichtung auftreten (Abbildung 3B). Man kann auch den Grad der Kontamination des Graphens überprüfen, indem man ein Bild mit hoher Vergrößerung in der Mitte eines der mit Graphen bedeckten Löcher aufnimmt (Abbildung 3C). Wenn es mit einem hochauflösenden Detektor aufgenommen wird, sollte eine Fourier-Transformation dieses Bildes Bragg-Punkte enthalten, die einem Kohlenstoff-Kohlenstoff-Abstand bei 2,14 Å entsprechen (Abbildung 4C). Eine Monolage aus Kohlenstoffatomen erzeugt nicht genügend Elektronenstreuung, um einen Phasenkontrast zu erzeugen, und daher zeigt ein Bild von sauberem Graphen keine Thon-Ringe, die mit der Kontrastübertragungsfunktion in einer Fourier-Transformation des Bildes verbunden sind. Es ist jedoch sehr schwierig, eine Kontamination der Graphengitter nach ihrer Herstellung zu verhindern, und ein unzureichendes Waschen der EM-Gitter oder das Entfernen von MMA nach der Graphenbeschichtung führt zu bemerkenswerten Verunreinigungen auf den Gittern, die in den Realraumbildern sichtbar sind (Abbildung 3C). Wie in Abbildung 4 gezeigt, haben Graphengitter eine konzentrierende Wirkung auf eine Probe, wie beim Vergleich von 0,5 mg/ml Apoferritin beobachtet wird, die auf löchrige Goldgitter mit (Abbildung 4A) und ohne Graphenträger (Abbildung 4B) aufgetragen werden. Ähnliche Graphen-Herstellungsprotokolle wurden bereits beschrieben, um KryoEM-Strukturen von Proteinen wie Apoferritin mit hoher Auflösungzu lösen 25,27.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung zur Herstellung von graphenbeschichteten KryoEM-Gittern. Die wichtigsten Schritte im Prozess der Herstellung von Graphengittern werden veranschaulicht. Abkürzungen: cryoEM = kryogene Elektronenmikroskopie; MMA = Methylmethacrylat; APS = Ammoniumpersulfat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig02.jpg"> Abbildung 2: Benötigte Materialien für die Herstellung von Graphengittern . (A) Notwendige Materialien für die Beschichtung von Kryo-EM-Gittern sind entsprechend gekennzeichnet. (B) Nahaufnahme des Coaters mit Graphen/Cu-Folie, die auf ein Löschpapier auf einem Objektträger geklebt ist. Der Spin Coater kann durch den Kauf von Teilen in einem lokalen Computer-/Baumarkt zusammengebaut werden. (C) Nahaufnahme der Gitterbeschichtungswanne, die an einer Spritze befestigt ist, mit der der Wasserstand kontrolliert werden kann. Die Gitter werden auf ein Löschpapier auf einem Edelstahlgeflecht gelegt. Das Löschpapier hilft dabei, die Position der Gitter so zu manövrieren, dass die Graphenschicht darauf abgestimmt werden kann. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig03.jpg"> Abbildung 3: Ein repräsentatives Beugungsmusterbild und Hellfeldbilder eines Graphengitters mit Falten oder MMA-Kontamination . (A) EM-Gitter, die mit einer Monolage aus Graphen bedeckt sind, zeigen Bragg-Peaks, die dem hexagonalen Gitter des Graphens entsprechen, wenn sie in einem TEM im Beugungsmodus abgebildet werden. Der Bragg-Peak, der dem Kohlenstoff-Kohlenstoff-Abstand von 2,14 Å entspricht, ist eingekreist und mit einem Pfeil gekennzeichnet. (B) Ein Hellfeldbild eines einlagigen Graphengitters mit einigen Falten (gekennzeichnet durch einen Pfeil) in der Graphen-Monoschicht. (C) Ein Hellfeldbild von einlagigem Graphen mit MMA-Kontamination (gekennzeichnet mit einem Pfeil). Maßstabsbalken = 100 nm (B,C). Abkürzungen: EM = Elektronenmikroskopie; MMA = Methylmethacrylat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig04.jpg"> Abbildung 4: Apoferritin auf mit Graphen bedeckten Goldgittern: (A) KryoEM-Aufnahme von 0,5 mg/ml Apoferritin auf mit Graphen bedeckten Goldgittern. (B) Apoferritin, das in der gleichen Konzentration abgebildet wurde, ist in wesentlich geringerer Konzentration sichtbar, wenn es unter Verwendung von löchrigen Goldgittern ohne Graphen hergestellt wird. (C) FFT der KryoEM-Aufnahme von 0,5 mg/ml Apoferritin auf mit Graphen bedeckten Goldgittern, wobei die Bragg-Peaks dem hexagonalen Graphengitter entsprechen. Maßstabsbalken = 100 nm (A,B). Abkürzungen: cryoEM = kryogene Elektronenmikroskopie; FFT = schnelle Fourier-Transformation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Hier beschreiben wir ein Protokoll zum Auftragen einer einzelnen Monoschicht aus Graphen auf Elektronenmikroskopie-Gitter und wie sie für die Verwendung in der KryoEM-Strukturbestimmung vorbereitet werden können.

Herstellung von einlagigen Graphen-beschichteten Gittern für die Kryoelektronenmikroskopie

Cryogenic electron microscopy (cryoEM) has emerged as a powerful technique for probing the atomic structure of macromolecular complexes. Sample ...

Die optimale Konservierung biologischer Proben ist derzeit eine große Herausforderung bei der Gewinnung hochauflösender KryoEM-Strukturen. Während des Probenvorbereitungsprozesses werden die Proben einer hydrophoben Luft-Wasser-Grenzfläche ausgesetzt, die denaturierende Auswirkungen auf die Proben hat und dazu führen kann, dass stabile Proben eine bevorzugte Ausrichtung im Eis einnehmen, was eine hochauflösende Strukturbestimmung verhindert. Die Beschichtung von CryoEM-Gittern mit einer dünnen Kohlenstoffschicht aus weichem Graphenoxid wird häufig verwendet, um Probleme im Zusammenhang mit Wechselwirkungen mit der Luft-Wasser-Grenzfläche zu lösen.Diese Schichten verstärken jedoch oft das Hintergrundrauschen in unseren Bildern, was die Auflösung unserer Struktur beeinträchtigt. Die Beschichtung des Gitters mit einer Monoschicht aus Graphen erreicht einen ähnlichen Schutz, ohne nennenswerte Hintergrundgeräusche zu erzeugen. Die Verwendung von graphenbeschichteten CryoEM-Gittern kann dazu beitragen, Probleme im Zusammenhang mit Wechselwirkungen mit der Luft-Wasser-Grenzfläche zu lösen, kommerzielle Graphengitter sind jedoch teuer und viele Labore halten Graphengitter für zu kompliziert, um sie intern herzustellen.Forscher auf dem Gebiet der KryoEM können nun dieses Schritt-für-Schritt-Protokoll verwenden, um Dutzende von qualitativ hochwertigen Graphenen an einem Tag vollständig zu reproduzieren.

fabrication-monolayer-graphene-coated-grids-for-cryoelectron

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Anwendung von Trägerschichten auf kryogene Elektronenmikroskopie-Gitter (KryoEM) kann die Partikeldichte erhöhen, Wechselwirkungen mit der Luft-Wasser-Grenzfläche begrenzen, strahlinduzierte Bewegungen reduzieren und die Verteilung der Partikelorientierungen verbessern. In diesem Artikel wird ein robustes Protokoll für die Beschichtung von KryoEM-Gittern mit einer Monoschicht aus Graphen beschrieben, um die Vorbereitung von Kryoproben zu verbessern.

Anwendung von Monolayer-Graphen auf Kryo-Elektronenmikroskopie-Gitter zur hochauflösenden Strukturbestimmung

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Tandem-Hochdruck-Schnell Einfrieren und Gefriersubstitution von Pflanzengeweben für die Transmissionselektronenmikroskopie

Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll für die Kombination von zwei Probe-Verarbeitungstechniken, Hochdruck, Einfrieren und Mikrowellen-gestützte Probenverarbeitung, gefolgt von minimal Harz für die Datenerfassung mit fokussierten Ion Beam Rasterelektronenmikroskop (FIB-SEM) einbetten. Dies wird gezeigt, mit einer Maus tibiale Nerven Probe und Caenorhabditis Elegans.

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Hier beschreiben wir die Herstellung von humanen Organoid-abgeleiteten intestinalen Epithel-Monolayern zur Untersuchung der Darmbarrierefunktion, Permeabilität und des Transports. Da Organoide die ursprüngliche Reaktion des Epithelgewebes auf äußere Reize darstellen, kombinieren diese Modelle die Vorteile der Erweiterbarkeit von Zelllinien und die Relevanz und Komplexität von Primärgewebe.

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Erfahren Sie die Herstellung von einlagigen Graphen-beschichteten Gittern für die Kryoelektronenmikroskopie. Diese Methode reduziert Hintergrundrauschen und verbessert die Probenerhaltung bei hochauflösenden Strukturanalysen biologischer Proben.

Herstellung von einlagigen Graphen-beschichteten Gittern für die Kryoelektronenmikroskopie

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