Name: Immunhistochemische Multiplex-Analyse der räumlichen Immunzelllandschaft der Tumormikroumgebung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Lernen Sie die multiplexe Immunhistochemie zur Analyse der räumlichen Immunzelllandschaft in Tumorgeweben. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Visualisierung mehrerer Marker für präzise Krebsforschung.

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Der PhenoImager HT wurde mit Mitteln des Radboud University Medical Center und des Radboud Technology Center for Microscopy erworben. CF wird finanziell unterstützt durch ein Stipendium der Dutch Cancer Society (10673) und ein ERC Adv Grant ARTimmune (834618). JT wird finanziell unterstützt durch einen NWO Vidi Zuschuss (VI.Vidi.192.084). Die Autoren danken Eric van Dinther und Ankur Ankan für ihre Unterstützung bei der Erstellung von Workflows zum Speichern von Multiplex-IHC-Daten, und Bengt Phung wird für Anweisungen zur Implementierung von Multiplex-IHC-Daten in QuPath für die ROI-Zeichnung gedankt.

Kartierung der Tumorimmunlandschaft: Ein detailliertes Multiplex-IHC-Analyseprotokoll

<ol><li>Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunoediting%3A+from+immunosurveillance+to+tumor+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape.</a> Nature Immunology. 3 (11), 991-998 (2002).</li>
<li>van der Woude, L. L., Gorris, M. A. J., Halilovic, A., Figdor, C. G., de Vries, I. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migrating+into+the+tumor%3A+a+roadmap+for+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Migrating into the tumor: a roadmap for T cells.</a> Trends in Cancer. 3 (11), 797-808 (2017).</li>
<li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+contexture+in+human+tumours%3A+impact+on+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nature Reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li>
<li>Fridman, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+microenvironment+of+human+tumors%3A+general+significance+and+clinical+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenvironment%22%5BJournal%5D)">The immune microenvironment of human tumors: general significance and clinical impact.</a> Cancer Microenvironment. 6 (2), 117-122 (2013).</li>
<li>Pages, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+validation+of+the+consensus+Immunoscore+for+the+classification+of+colon+cancer%3A+a+prognostic+and+accuracy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study.</a> Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).</li>
<li>Angell, H. K., Bruni, D., Barrett, J. C., Herbst, R., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Immunoscore%3A+colon+cancer+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The Immunoscore: colon cancer and beyond.</a> Clinical Cancer Research. 26 (2), 332-339 (2020).</li>
<li>Angell, H., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+immune+contexture+to+the+Immunoscore%3A+the+role+of+prognostic+and+predictive+immune+markers+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">From the immune contexture to the Immunoscore: the role of prognostic and predictive immune markers in cancer.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (2), 261-267 (2013).</li>
<li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+classification+using+the+Immunoscore%3A+a+worldwide+task+force%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer classification using the Immunoscore: a worldwide task force.</a> Journal of Translational Medicine. 10, 205(2012).</li>
<li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World-wide+Immunoscore+Task+Force%3A+meeting+report+from+the+34%3BMelanoma+Bridge%26%2334%2C+Napoli%2C+November+30th-December+3rd%2C+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">World-wide Immunoscore Task Force: meeting report from the 34;Melanoma Bridge&#34, Napoli, November 30th-December 3rd, 2016.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 212(2017).</li>
<li>Tumeh, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+blockade+induces+responses+by+inhibiting+adaptive+immune+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance.</a> Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).</li>
<li>Creemers, J. H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tipping+point+in+cancer-immune+dynamics+leads+to+divergent+immunotherapy+responses+and+hampers+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A tipping point in cancer-immune dynamics leads to divergent immunotherapy responses and hampers biomarker discovery.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002032(2021).</li>
<li>Blank, C. U., Haanen, J. B., Ribas, A., Schumacher, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CANCER+IMMUNOLOGY.+The+%26%2334%3Bcancer+immunogram%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CANCER IMMUNOLOGY. The &#34;cancer immunogram&#34;.</a> Science. 352 (6286), 658-660 (2016).</li>
<li>Teruya-Feldstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunohistochemistry+laboratory+looking+at+molecules+and+preparing+for+tomorrow%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">The immunohistochemistry laboratory looking at molecules and preparing for tomorrow.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (11), 1659-1665 (2010).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+tissue+antigens+and+antibodies+get+along%3A+revisiting+the+technical+aspects+of+immunohistochemistry--the+red%2C+brown%2C+and+blue+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).</li>
<li>Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+where%2C+the+when%2C+and+the+how+of+immune+monitoring+for+cancer+immunotherapies+in+the+era+of+checkpoint+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition.</a> Clinical Cancer Research. 22 (8), 1865-1874 (2016).</li>
<li>Parra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+platforms+of+multiplexed+immunofluorescence+for+study+of+paraffin+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Treatment+and+Diagnosis%22%5BJournal%5D)">Novel platforms of multiplexed immunofluorescence for study of paraffin tumor tissues.</a> Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).</li>
<li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eight-color+multiplex+immunohistochemistry+for+simultaneous+detection+of+multiple+immune+checkpoint+molecules+within+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).</li>
<li>Roelofsen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+regression+of+ovarian+carcinoma+after+septic+peritonitis%3B+a+unique+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous regression of ovarian carcinoma after septic peritonitis; a unique case report.</a> Frontiers in Oncology. 8, 562(2018).</li>
<li>van den Brand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-mediated+delivery+of+therapeutic+mRNA+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Peptide-mediated delivery of therapeutic mRNA in ovarian cancer.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 141, 180-190 (2019).</li>
<li>van den Brand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpCAM-binding+DARPins+for+targeted+photodynamic+therapy+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">EpCAM-binding DARPins for targeted photodynamic therapy of ovarian cancer.</a> Cancers. 12 (7), 1762(2020).</li>
<li>Di Blasio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumour+microenvironment+shapes+dendritic+cell+plasticity+in+a+human+organotypic+melanoma+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The tumour microenvironment shapes dendritic cell plasticity in a human organotypic melanoma culture.</a> Nature Communications. 11 (1), 2749(2020).</li>
<li>van Beek, J. J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pDCs+are+superior+to+cDC2s+in+attracting+cytolytic+lymphocytes+in+melanoma+patients+receiving+DC+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human pDCs are superior to cDC2s in attracting cytolytic lymphocytes in melanoma patients receiving DC vaccination.</a> Cell Reports. 30 (4), 1027-1038 (2020).</li>
<li>Rodriguez-Rosales, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+aged+neutrophils+are+augmented+in+blood+and+skin+of+psoriasis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory aged neutrophils are augmented in blood and skin of psoriasis patients.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 148 (4), 1030-1040 (2021).</li>
<li>Hoeijmakers, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+composition+in+the+endometrium+of+patients+with+a+complete+molar+pregnancy%3A+Effects+on+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Immune cell composition in the endometrium of patients with a complete molar pregnancy: Effects on outcome.</a> Gynecologic Oncology. 160 (2), 450-456 (2021).</li>
<li>van Ravensteijn, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+and+genomic+analysis+reveals+clinically+relevant+distinctions+between+angiosarcoma+subgroups%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Immunological and genomic analysis reveals clinically relevant distinctions between angiosarcoma subgroups.</a> Cancers. 14 (23), 5938(2022).</li>
<li>van der Woude, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+shows+an+immunological+abscopal+effect+in+patients+with+NSCLC+treated+with+pembrolizumab-radiotherapy+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment shows an immunological abscopal effect in patients with NSCLC treated with pembrolizumab-radiotherapy combination.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (10), e005248(2022).</li>
<li>Graham Martinez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+microenvironment+landscape+shows+treatment-specific+differences+in+rectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The immune microenvironment landscape shows treatment-specific differences in rectal cancer patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 1011498(2022).</li>
<li>Cortenbach, K. R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+of+immune+cell+infiltration+in+different+stages+of+coronary+atherosclerosis+revealed+by+multiplex+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology.+Heart+%26+Vasculature%22%5BJournal%5D)">Topography of immune cell infiltration in different stages of coronary atherosclerosis revealed by multiplex immunohistochemistry.</a> International Journal of Cardiology. Heart & Vasculature. 44, 101111(2023).</li>
<li>van Wilpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+repair+deficient+prostate+cancer+represents+an+immunologically+distinct+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination repair deficient prostate cancer represents an immunologically distinct subtype.</a> Oncoimmunology. 11 (1), 2094133(2022).</li>
<li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+primary+and+metastatic+lesions+of+patients+with+ipilimumab-treated+melanoma%3A+high+variation+in+lymphocyte+infiltration+and+HLA-ABC+expression+whereas+tumor+mutational+load+is+similar+and+correlates+with+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paired primary and metastatic lesions of patients with ipilimumab-treated melanoma: high variation in lymphocyte infiltration and HLA-ABC expression whereas tumor mutational load is similar and correlates with clinical outcome.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (5), e004329(2022).</li>
<li>van Wilpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+T+cell+depletion+following+neoadjuvant+chemotherapy+in+patients+with+muscle-invasive+bladder+cancer+is+associated+with+poor+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Intratumoral T cell depletion following neoadjuvant chemotherapy in patients with muscle-invasive bladder cancer is associated with poor clinical outcome.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 72 (1), 137-149 (2023).</li>
<li>Sultan, S., Gorris, M. A. J., Buytenhuijs, F., Lvan de Woude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Segmentation-free+machine+learning+architecture+for+immune+land-scape+phenotyping+in+solid+tumors+by+multichannel+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A Segmentation-free machine learning architecture for immune land-scape phenotyping in solid tumors by multichannel imaging.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-profiling+and+cellular+spatial+analysis+using+five+immune+oncology+multiplex+immunofluorescence+panels+for+paraffin+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Immuno-profiling and cellular spatial analysis using five immune oncology multiplex immunofluorescence panels for paraffin tumor tissue.</a> Scientific Reports. 11 (1), 8511(2021).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).</li>
<li>Sun, Z., Nyberg, R., Wu, Y., Bernard, B., Redmond, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+an+enhanced+7-color+multiplex+IHC+protocol+to+dissect+immune+infiltration+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Developing an enhanced 7-color multiplex IHC protocol to dissect immune infiltration in human cancers.</a> PLoS One. 16 (2), e0247238(2021).</li>
<li>LeicaBiosystems. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BOND+RX+Fully+Automated+Research+Stainer+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">BOND RX Fully Automated Research Stainer Protocols.</a> , https://www.leicabiosystems.com/en-nl/ihc-ish/ihc-ish-instruments/bond-rx/ (2022).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Die räumliche Analyse der TME ist eine gefragte Technik, um mehr über das Kompartiment der Immunzellen zu erfahren und neue prognostische und prädiktive Biomarker zu entdecken, insbesondere im Bereich der Immunonkologie16. Zu diesem Zweck werden viele verschiedene Techniken entwickelt, die den Nachweis von Proteinen, mRNA-Transkripten oder einer Kombination aus beidem beinhalten, mit Schätzungen von bis zu 100-1.000 Zielen. Ein höheres Multiplexing geht jedoch auf Kosten von weniger Experimenten mit hohem Durchsatz, höheren experimentellen Kosten und technischen Herausforderungen, und oft kann nur ein kleiner Teil der TME analysiert werden. Multiplex IHC mit der TSA-basierten Methode, die wir hier beschreiben, detektiert sechs verschiedene Marker + DAPI gleichzeitig, ist relativ kostengünstig durchzuführen und ganze Gewebeschnitte werden in weniger als 20 Minuten abgebildet und können vollständig analysiert werden. Diese Technik ist durch die Automatisierung des Färbeverfahrens weniger komplex geworden. Verbesserungen am Multispektralmikroskop, zu denen auch das Hinzufügen von zwei zusätzlichen Filtern gehört, haben die spektrale Entmischung und die Scanzeiten enorm verbessert. Es ist möglich, bis zu acht verschiedene Marker + DAPI gleichzeitig zu erkennen. Durch die Erweiterung des Multiplexings um mehr Marker verschwinden die oben genannten Vorteile jedoch, da die spektrale Entmischung schwieriger wird und die Scanzeiten für ganze Objektträger erheblich zunehmen. Es werden Anstrengungen unternommen, um die Multiplex-IHC zwischen verschiedenen Institutionen zu standardisieren, um die Implementierung im diagnostischen Umfeld zu erleichtern. Für diese Standardisierung von Multiplex-IHC empfehlen wir den Anwendern, sich an das leichter zugängliche Protokoll mit sechs verschiedenen Markern + DAPI zu halten. Nichtsdestotrotz ist noch einiges an technischem Know-how notwendig und die nachgelagerte Analyse kann eine Herausforderung darstellen, für die wir Methoden entwickelt haben, die in diesem Protokoll beschrieben werden.
Die Standardisierung beginnt mit der Entwicklung von Multiplex-IHC-Panels. Die Bedeutung der Auswahl von Primärantikörpern zum Nachweis bestimmter Proteinziele wurde bereits vor17 Jahren betont. Unsere Multiplex-IHC-Panels werden meist mit primären Antikörperklonen entwickelt, die auch in unserer Diagnostikabteilung für IHC verwendet und validiert werden. Im Fall des dendritischen Zellmultiplex-IHC-Panels wurden die meisten Antikörper jedoch nicht im diagnostischen Setting verwendet (van der Hoorn et al., Manuskript in der Einreichung). Um die Spezifität zu gewährleisten und Chargenunterschiede zu minimieren, haben wir uns für die Verwendung von monoklonalen Antikörpern anstelle von polyklonalen Antikörpern entschieden und die meisten Antikörper auch mit transfizierten Zelllinien und Primärzellen validiert. Im Laufe der Jahre wurden verschiedene Versionen von Multiplex-IHC-Paneelen in zahlreichen Studien mit dem Vectra 3-System 18,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32 verwendet . Um diese Multiplex-IHC-Panels optimal auf dem PhenoImager HT-System zu implementieren, mussten einige Anpassungen in den Kombinationen von primären Antikörpern und Fluorophoren vorgenommen werden. Um von einer besseren spektralen Entmischung und schnelleren Scanzeiten ganzer Gewebeschnitte zu profitieren, ist die Implementierung der neuesten Opal480- und Opal780-Fluorophore und die Vermeidung der Verwendung von Opal540- und Opal650-Fluorophoren in siebenfarbigen Multiplex-IHC-Panels erforderlich. Die Scanzeiten sind je nach Größe des Gewebeschnitts ~3-10 Mal schneller. Die Anpassung des Multiplex-IHC-Panels war recht einfach zu bewerkstelligen, aber einige Überlegungen müssen im Auge behalten werden. Das Fluoreszenzspektrum von Opal480 überlappt sich stark mit dem Autofluoreszenzspektrum und stört daher die spektrale Entmischung von Erythrozyten und anderen autofluoreszierenden Strukturen. Die Verwendung einer erhöhten Konzentration des primären Antikörpers in Kombination mit Opal480 löste dieses Problem in den meisten Fällen. Die Implementierung des proprietären Sample AF-Filters auf dem PhenoImager HT erleichtert die Entmischung von Opal480 und Autofluoreszenz. Es ist jedoch am besten, einen Primärantikörper zu verwenden, der bei Verwendung mit Opal480 ein klares Signal liefert, so dass sein Signal höher ist als die Autofluoreszenz.
Auch wenn diese Multiplex-IHC-Panels etabliert sind, muss eine Variation von Charge zu Charge berücksichtigt werden. Durch die Durchführung von Monoplex-IHC-Kontrollen vor Beginn des vollständigen Multiplex-IHC-Experiments beobachteten wir manchmal, dass primäre Antikörper von Experiment zu Experiment entweder stärker oder schwächer abschnitten. Die Gründe dafür können Pipettierfehler, suboptimale Lagerbedingungen für Reagenzien und die Haltbarkeit sein. Wir haben dieses Problem gelöst, indem wir die primäre Antikörperlösung auf der Grundlage unserer Erfahrungen angepasst haben. Auch wenn keine der oben genannten Anpassungen vorgenommen werden musste, ist es bei jedem Multiplex-IHC-Batch-Experiment wichtig, die Belichtungszeiten auf Basis von Monoplex-IHC-gefärbten Kontrollobjektträgern einzustellen.
Da sich unsere Forschung ursprünglich auf verschiedene Arten von Karzinomen und Melanomen konzentrierte, mussten Multiplex-IHC-Panels mit minimalen Anpassungen zwischen Tumorarten austauschbar sein. Daher haben wir immer mehrere (Tumor-)Gewebetypen in den Optimierungsprozess einbezogen und beobachtet, dass die Verdünnungen für primäre Antikörper für Immunzellmarker zwischen verschiedenen Tumorarten ähnlich gehalten werden können. Für die Detektion von Tumorgewebe zwischen Karzinomen und Melanomen werden jedoch unterschiedliche Tumormarker benötigt. Dementsprechend wurde der Tumormarker immer so optimiert, dass er am Ende eines jeden Multiplex-IHC-Panels arbeitet und wird derzeit immer in Verbindung mit Opal780 verwendet, das zufälligerweise auch bei einem Multiplex-IHC-Färbeverfahren am letzten Fluorophor sein muss. Durch die konsequente Verwendung des Tumormarkers am Ende des Multiplex-IHC können diese Multiplex-IHC-Panels leicht gegen andere Tumorarten wie das Glioblastom (d.h. GFAP) und das Hodgkin-Lymphom (d.h. CD30) ausgetauscht werden. Für das Angiosarkom verwendeten wir dieses Lymphozyten-Multiplex-IHC-Panel mit dem Erythroblast transformation-specific-related Gen (ERG) als Tumormarker mit nur zwei Optimierungsexperimenten25. Die Optimierung umfasste die Titration des ERG-Primärantikörpers und das Testen des Multiplex-IHC-Panels mit ERG am Ende.
Weitere Anpassungen an diesen Multiplex-IHC-Panels können auch vorgenommen werden, indem ein bestimmter Immunzellmarker gegen einen anderen Immun- oder Funktionsmarker ausgetauscht wird. Jede Änderung erfordert eine Optimierung. Das Protokoll zur Optimierung konnte wie zuvor beschrieben befolgt werden17. Bestimmte Änderungen an den vorgeschlagenen Multiplex-IHC-Panels werden die von uns erstellten ImmuNet-Algorithmen beeinträchtigen. Es müssen ausreichend Daten generiert werden und es muss Zeit aufgewendet werden, um diese Änderungen in den Algorithmus zu implementieren (mindestens 750 Annotationen für jeden neuen Marker und/oder Zellphänotyp und 150 Annotationen für die Validierung zuvor trainierter Marker). Die hier vorgestellten Panels enthalten keine funktionellen Marker, obwohl die Implementierung von Immun-Checkpoint-Markern wie PD-1 und PD-L1 in Multiplex-IHC-Panels in unserem Labor durchgeführt wird. Die Analyse von Markern, die in negativen und positiven Signalen weniger binär sind, hat sich jedoch als schwieriger erwiesen und ist ein Bereich aktiver Forschung in unserer Gruppe.
Die Anzahl der Marker, die gleichzeitig mit Multiplex-IHC beurteilt werden können, ist im Vergleich zu anderen neuartigen Techniken begrenzt. Dies kann zwar umgangen werden, indem verschiedene Paneele auf aufeinanderfolgenden Schichten eines FFPE-Blocks analysiert werden, aber es wird schwierig sein, diese Schichten räumlich zu vergleichen. Ausrichtung und gefaltete Artefakte sind nach der Vorbereitung der Folie wahrscheinlich nicht mehr dieselben. Nichtsdestotrotz ist die Multiplex-IHC leicht zugänglich, was sie zu einem attraktiven Werkzeug für mehr Institutionen und Forscher macht und daher besser für die zukünftige Implementierung in einem diagnostischen Umfeld geeignet ist. Mit der Standardisierung von Multiplex-IHC-Immunzellpanels für mehrere Tumorarten und nachgelagerten Analysepipelines konnten mehr Erkenntnisse über die Unterschiede in der TME zwischen Patienten und Tumorarten gewonnen werden. Dies kann zum Beispiel zu mehr Erkenntnissen über die Rolle der TME bei der Reaktion auf bestimmte Behandlungen gegen Tumore führen. Dies kann sogar zu neuen Biomarkern führen, um Faktoren wie das Ansprechen auf die Behandlung und das erwartete Überleben vorherzusagen. Insgesamt kann dies dazu führen, dass die Multiplex-IHC zu einem klinischen Instrument wird, das die klinische Entscheidungsfindung in einem personalisierten Medizinansatz unterstützt. Zugegebenermaßen sollten wahrscheinlich mehr Schritte des Analyseverfahrens automatisiert und standardisiert werden, damit es für den Einsatz in einer täglichen diagnostischen Umgebung machbar ist, so dass es sich bisher hauptsächlich um eine futuristische Perspektive handelt.
Die Analyse mehrerer Marker auf einem einzigen Objektträger kann trotz ihrer technischen Herausforderungen ein sehr leistungsfähiges Werkzeug sein. Mit standardisierten experimentellen Protokollen und einer robusten Analysemethode, wie wir hier mit ImmuNet beschrieben haben, ist die Quantifizierung mehrerer Marker informativer als die klassische IHC, während die Multiplex-IHC im Vergleich zu neuartigen experimentellen Methoden mit höherem Plex einen relativ hohen Durchsatz aufweist.

Immunzellen spielen eine entscheidende Rolle beim Schutz vor Krankheitserregern wie Viren und Bakterien, aber auch vor Krebszellen1. Daher ist das Immunsystem in der Tumormikroumgebung (TME) vielversprechend für die Entdeckung prognostischer und prädiktiver Biomarker2. Immunzellinfiltrate wurden mit der Prognose bei verschiedenen Krebsarten korreliert, obwohl dies in der klinischen Versorgung noch nicht implementiert wurde 3,4. Bei den meisten Tumorarten sind eine hohe Anzahl von zytotoxischen T-Zellen und T-Helfer-1-Zellen und/oder eine geringe Anzahl von regulatorischen T-Zellen mit guten Prognosen verbunden. Es gibt Bestrebungen, einen sogenannten "Immunoscore" in das TNM-Staging von Darmkrebs einzubauen und daraus ein TNM-I-Staging zu machen 5,6. Der Immunoscore ergibt sich aus der Gesamtzahl der T-Zellen (nachgewiesen mit CD3) und zytotoxischen T-Zellen (nachgewiesen mit CD8) in zwei verschiedenen Tumorregionen: dem Tumorkern und dem invasiven Rand (IM) von Tumoren. Es wurde vorgeschlagen, dass der Immunoscore auch bei anderen Krebsarten wie Melanom, Lungenkrebs und Brustkrebs von prognostischem Wert ist 6,7,8,9. Darüber hinaus können Immunzellinfiltrate auch mit dem Ansprechen auf eine Checkpoint-Blockade-Immuntherapie korrelieren10. Diese prädiktiven Biomarker müssen jedoch in prospektiven Studien validiert werden, bevor sie routinemäßig in der klinischen Praxis eingesetzt werden können. Darüber hinaus wurde auch vorgeschlagen, dass ein einzelner Biomarker für eine aussagekräftige Vorhersage nicht ausreicht11. Daher wurde die Erstellung einer vollständigen Karte einer Patientenprobe durch die Kombination verschiedener Biomarker als umfassenderer prädiktiver Biomarker in einem sogenannten "Krebsimmunogramm" vorgeschlagen12.
Unter den Methoden zur Untersuchung von Immunzellen im Rahmen der TME ist die Immunhistochemie (IHC) die älteste und bekannteste Technik, die routinemäßig für diagnostische Tests bei verschiedenen Krankheiten, insbesondere Krebs, eingesetzt wird13. Diese Technik war lange Zeit auf die Verwendung eines oder nur einiger weniger Marker14 beschränkt und wurde daher in Forschungsumgebungen von anderen Techniken wie der Durchflusszytometrie und dem Genexpressionsprofiling (GEP) verdrängt. Die in der Routinediagnostik und -forschung typischerweise verwendeten formalinfixierten und paraffineingebetteten (FFPE) Tumorgewebe sind jedoch nicht (optimal) für die Durchflusszytometrie und GEP geeignet. Obwohl GEP und Durchflusszytometrie viele Einblicke in den Phänotyp und die Funktion von Zellen bieten, ist der Mangel an räumlichen Informationen ein großer Nachteil. Daher könnten Heterogenitäten innerhalb einer Probe, wie z. B. Unterschiede zwischen Immunzell-infiltrierten und Immunzell-ausgeschlossenen Bereichen eines Tumors, unentdeckt bleiben15. Für die Multiplex-Analyse von FFPE-Geweben wurden neuartige Plattformen entwickelt, wie z. B. Multiplex-IHC, bildgebende Massenzytometrie und CO-Detection by indEXing (CODEX), die zum gleichzeitigen Nachweis mehrerer Marker innerhalb eines Gewebeschnittsverwendet werden können 16. Immunzellen in der TME werden umfassend untersucht, um die besten Biomarker für die Immuntherapie zu finden. Multiplex-Techniken und automatisierte Bildanalyse stellen jedoch ihre eigenen Hürden dar.
Unser Labor verfügt über umfangreiche Erfahrung in der Multiplex-IHC-Färbung mit der Opal/Tyramid-Signalverstärkungsmethode (TSA) und hat diese auf einer IHC-Plattform automatisiert (siehe Materialtabelle)17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31. Wir haben Immunzell-Panels für den Nachweis verschiedener Untergruppen von Lymphozyten, myeloischen Zellen und dendritischen Zellen (DCs) optimiert. Gewebe, die dichte Immunzellbereiche enthalten - für Lymphozyten oder komplexe Zellmorphologien (d. h. myeloische Zellen und DCs) - sind besonders schwierig zu analysieren, da die Gefahr besteht, dass die Anzahl der vorhandenen Immunzellen über- oder unterschätzt wird. Um dieses Problem zu lösen, wurde von unserer Gruppe32 die Analysesoftware ImmuNet entwickelt, die die Qualität der Erkennung dieser verschiedenen Arten von Immunzellen immens verbesserte. Ein detailliertes Protokoll von der Gewinnung des FFPE-Materials bis zur Analyse der Immunzelldichten in verschiedenen Gewebekompartimenten und Abständen zwischen Immunzelltypen wird hier beschrieben.
Dieses Protokoll beschreibt, wie die Multiplex-IHC-Panels am Radboud University Medical Center seit der Implementierung des digitalen Pathologie-Imagers im Jahr 2022 durchgeführt werden. Die beschriebenen Multiplex-IHC-Panels können für verschiedene Karzinome (z.B. Lunge, Prostata, Darm, Blase, Brust) unter Verwendung eines Pan-Cytokeratin-Antikörpers als Tumormarker oder für Melanome unter Verwendung von Melanozyten-assoziierten Antikörpern als Tumormarker verwendet werden. Diese Multiplex-IHC-Protokolle wurden in Bezug auf die Primärantikörperkonzentration, die Fluorophor-Kombinationen und die Reihenfolge des Färbeverfahrens sorgfältig optimiert. Wir und andere haben die Multiplex-IHC-Panel-Optimierung bereits beschrieben 17,33,34,35. Multiplex-IHC-Panels können angepasst werden, aber die beschriebenen Analyse-Pipelines müssen evaluiert und möglicherweise entsprechend angepasst oder neu trainiert werden. Die beschriebenen siebenfarbigen Multiplex-IHC-Protokolle verwenden die Opalfluorophore Opal480, Opal520, Opal570, Opal620, Opal690, Opal780 und 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), so dass mit "Multispectral One Touch ImmunoFluorescence" (MOTiF) ein einfaches Entmischen und schnelles Scannen auf dem Imager ermöglicht wird. Neunfarbiges Färben und Scannen wird in diesem Protokoll nicht beschrieben, da dies eine noch feinere Abstimmung des Versuchsaufbaus und einen anderen Scanmodus auf dem Imager erfordert, der den abstimmbaren Flüssigkristallfilter verwendet.

<table><tbody><tr><td>Anti-CD14-Zellmarke</td><td>&nbsp;</td><td>114R-16</td><td>Sektion 3, Klon EPR3653</td></tr><tr><td>Anti-CD163-Zellmarke</td><td>&nbsp;</td><td>163M-15</td><td>Abschnitt 3, Klon MRQ-26</td></tr><tr><td>Anti-CD19</td><td>Abcam</td><td>ab134114</td><td>Abschnitt 3, Klon EPR5906</td></tr><tr><td>Anti-CD1c (BDCA1)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TA505411</td><td>Abschnitt 3, Klon OTI2F4</td></tr><tr><td>Anti-CD20</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-340-S</td><td>Abschnitt 3, Klon L26</td></tr><tr><td>Anti-CD3</td><td>Thermo Scientific</td><td>RM-9107</td><td>Abschnitt 3, Klon sp7</td></tr><tr><td>Anti-CD303/ BDCA2-Dendritika</td><td>über Enzo Lifesciences/Axxora</td><td>DDX0043</td><td>Sektion 3, Klon 124B3.13</td></tr><tr><td>anti-CD56-Zellmarke</td><td>&nbsp;</td><td>156R-94</td><td>Abschnitt 3, Klon MRQ-42</td></tr><tr><td>Anti-CD66b</td><td>BD Biosciences</td><td>555723</td><td>Abschnitt 3, Klon G10F5</td></tr><tr><td>Anti-CD68</td><td>Dako Agilent</td><td>M087601</td><td>Abschnitt 3, Klon PG-M1</td></tr><tr><td>Anti-CD8</td><td>Dako Agilent</td><td>M7103</td><td>Abschnitt 3, Klon C8/144B</td></tr><tr><td>Anti-Foxp3</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-4777</td><td>Abschnitt 3, Klon 236A/E7</td></tr><tr><td>Anti-Gp100</td><td>Dako Agilent</td><td>M063401</td><td>Abschnitt 3, Klon HMB45</td></tr><tr><td>Anti-HLA-DR, DP, DQ</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-53302</td><td>Abschnitt 3, Klon CR3/43</td></tr><tr><td>Anti-MART-1</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-799</td><td>Abschnitt 3, Klon A103</td></tr><tr><td>Anti-Pan-Cytokeratin</td><td>Abcam</td><td>ab86734</td><td>Abschnitt 3, Klon AE1/AE3 + 5D3</td></tr><tr><td>Anti-SOX10</td><td>Sigma Aldrich</td><td>383R</td><td>Abschnitt 3, Klon EP268</td></tr><tr><td>Anti-Tyrosinase</td><td>Sanbio</td><td>MONX10591</td><td>Sektion 3, Klonierung von T311</td></tr><tr><td>anti-XCR1</td><td>Zellsignaltechnologien über Biok&eacute;</td><td>44665S</td><td>Abschnitt 3, Klon D2F8T</td></tr><tr><td>Antikörperverdünnungsmittel</td><td>Akoya BioSciences</td><td>SKU&nbsp; ARD1001EA</td><td>Sektion 3, aus Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 Schlitten (kann optional auch durch TBST mit 10% BSA ersetzt werden)</td></tr><tr><td>Bond Aspirating Probe</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.0605</td><td>Sektion 3</td></tr><tr><td>Bond Aspirating Probe Reinigung</td><td>Leica Biosciences</td><td>CS9100</td><td>Sektion 3</td></tr><tr><td>Bond Dewax Solution</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9222</td><td>Sektion 3</td></tr><tr><td>Bond Objectglas Etikett + Druck Flusen</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.4564.A</td><td>Abschnitt 3</td></tr><tr><td>Bond Research Detection System 2</td><td>Leica Biosciences</td><td>DS9777</td><td>Abschnitt 3</td></tr><tr><td>Bond RX Autostainer&nbsp;</td><td>Leica Biosciences-Sektion</td><td></td> <td>3, automatisierte</td></tr><tr><td>Plattform Bond TM Epitope Retrieval 1 - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9961</td><td>Sektion 3</td></tr><tr><td>Bond TM Epitope Retrieval 2 - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9640</td><td>Sektion 3</td></tr><tr><td>Bond TM Wash Solution 10x - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9590</td><td>Sektion 3</td></tr><tr><td>BOND Universal Covertile</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.4611</td><td>Sektion 3</td></tr><tr><td>Bond(TM) Titration Kit</td><td>Leica Biosciences</td><td>OPT9049</td><td>Sektion 3</td></tr><tr><td>Deckglas 24 x 32 mm #1 (0,13-0,16 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15717592</td><td>Sektion 2</td></tr><tr><td>Deckglas 24 x 50 mm</td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td>Sektion 2</td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G</td><td>VWR</td><td>0100-20</td><td>Abschnitt 3, wann immer Monoplex-Objektträger schnell überprüft werden müssen, nicht für die offizielle Analyse, dann wird DAPI separat gefärbt, um bessere Ergebnisse zu erzielen</td></tr><tr><td>Eosin</td><td></td><td></td><td>Abschnitt 2, hausgemachtes</td></tr><tr><td>Ethanol 99,5%</td><td>VWR</td><td>4099.9005</td><td>Abschnitt 2</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>VWR</td><td>0100-01</td><td>Abschnitt 3&nbsp;</td></tr><tr><td>Hämatoxylin-Sektion</td><td></td><td></td> <td>2, hausgemachte</td></tr><tr><td>ImmuNet-Immunzellnachweis</td><td></td><td></td><td>- und Phänotypisierungspipeline</td></tr><tr><td>inForm software 2.4.10</td><td>Akoya BioSciences-Sektion</td><td></td> <td>4 & 6</td></tr><tr><td>OPAL 480 Reagenzienpackung</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1500001KT</td><td>Sektion 3</td></tr><tr><td>OPAL 520 Reagenzienpackung</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1487001KT</td><td>Sektion 3</td></tr><tr><td>OPAL 570 Reagenzienpackung</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1488001KT</td><td>Sektion 3</td></tr><tr><td>OPAL 620 Reagenzienpackung</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1495001KT</td><td>Sektion 3</td></tr><tr><td>OPAL 690 Reagenzienpackung</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1497001KT</td><td>Sektion 3</td></tr><tr><td>OPAL 780 Reagenzienpackung</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1501001KT</td><td>Sektion 3</td></tr><tr><td>Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 Objektträger</td><td>Akoya BioSciences</td><td>NEL821001KT</td><td>Abschnitt 3</td></tr><tr><td>PhenoChart 1.1.0</td><td>Akoya BioSciences-Abschnitt</td><td></td> <td>5</td></tr><tr><td>PhenoImagerHT</td><td>Akoya BioSciences</td><td>CLS143455</td><td>Abschnitt 4, digitaler Pathologie-Imager mit Objektträgerbetrachter und Bildgebungssoftware (früher bekannt als Vectra Polaris)</td></tr><tr><td>Quick-D Eindeckmedium</td><td>Klinipath</td><td>7280</td><td>Abschnitt 2</td></tr><tr><td>QuPath 0.3.2</td><td></td><td></td><td>Softwareplattform für die Analyse ganzer Objektträger</td></tr><tr><td>R 4.1.1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objektträgerkästen</td><td>VWR</td><td>631-0737</td><td>Abschnitt 1</td></tr><tr><td>SuperFrost Plus</td><td>Thermo Scientific bis VWR</td><td>631-9483</td><td>Abschnitt 1</td></tr><tr><td>Vectra Polaris Software 1.0.13</td><td>Akoya BioSciences-Abschnitt</td><td></td> <td>4</td></tr><tr><td>Xylol</td><td>VWR</td><td>4055-9005</td><td>Abschnitt 2</td></tr></tbody></table>

immunhistochemische multiplex-analyse der räumlichen immunzelllandschaft der tumormikroumgebung

Multiplex Immunohistochemical Analysis of the Spatial Immune Cell Landscape of the Tumor Microenvironment

Die Immunzelllandschaft der Tumormikroumgebung enthält potenziell Informationen für die Entdeckung von prognostischen und prädiktiven Biomarkern. Die Multiplex-Immunhistochemie ist ein wertvolles Werkzeug, um verschiedene Arten von Immunzellen in Tumorgeweben unter Beibehaltung ihrer räumlichen Informationen zu visualisieren und zu identifizieren. Hier stellen wir detaillierte Protokolle zur Analyse von Lymphozyten-, myeloischen und dendritischen Zellpopulationen in Gewebeschnitten zur Verfügung. Angefangen beim Schneiden von formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Schnitten, über automatische Multiplex-Färbeverfahren auf einer automatisierten Plattform, das Scannen der Objektträger auf einem multispektralen Bildgebungsmikroskop bis hin zur Analyse der Bilder mit einem eigens entwickelten maschinellen Lernalgorithmus ImmuNet. Diese Protokolle können auf eine Vielzahl von Tumorproben angewendet werden, indem einfach Tumormarker ausgetauscht werden, um Immunzellen in verschiedenen Kompartimenten der Probe (Tumor versus invasiver Rand) zu analysieren und die Nearest-Neighbor-Analyse anzuwenden. Diese Analyse ist nicht nur auf Tumorproben beschränkt, sondern kann auch auf andere (nicht-)pathogene Gewebe angewendet werden. Durch Verbesserungen der Ausstattung und des Arbeitsablaufs in den letzten Jahren konnten die Durchlaufzeiten deutlich verkürzt werden, was die zukünftige Anwendung dieses Verfahrens in der Diagnostik erleichtert.

Dieses Protokoll beschreibt detailliert, wie die Immunzellcharakterisierung der Tumormikroumgebung mittels Multiplex-Immunhistochemie durchgeführt wird.

Immunhistochemische Multiplex-Analyse der räumlichen Immunzelllandschaft der Tumormikroumgebung

The immune cell landscape of the tumor microenvironment potentially contains information for the discovery of prognostic and predictive biomarkers. ...

Unser Ziel ist es, die Menge, Art und Lage von Immunzellen in den Mikroumgebungen des Tumors zu identifizieren. Im Bereich der Immunchemie gab es in den letzten Jahren große technologische Fortschritte. Fortschritte in der Multiplex-Immunchemie ermöglichen es, mehr Marker zuverlässig zu untersuchen.Aktuelle experimentelle Herausforderungen sind die Visualisierung spezifischer Arten von Immunzellen in Tumorproben, die mit Hilfe der Multiplex-Immunchemie überwunden wurden. Die genaue automatische Analyse dieser Bilder ist jedoch immer noch eine Herausforderung, an der wir arbeiten. Die Unterschiede zwischen der Immunzelllandschaft zwischen primären und metastasierten Tumoren werfen Fragen auf wie: Welche tumorintrinsischen Eigenschaften treiben diese Unterschiede hervor und was bedeuten diese Unterschiede für Therapien, die auf das Immunsystem abzielen?Neben unserer explorativen Arbeit werden wir uns auch auf klinisch relevante Fragen konzentrieren, wie z.B. wie die Immunzelllandschaft des Tumors durch verschiedene Arten von Krebstherapien beeinflusst wird und ob die Immunzelllandschaft das Ergebnis der Therapie vorhersagen kann.

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Dieses Video demonstriert eine in-situ Fluoreszenz-Multispektral-Bildgebungstechnik zur Analyse verschiedener Subpopulationen von infiltrierenden T-Zellen im Tumorgewebe. Eine Kryosektion des Nierenzellkarzinoms wird mit Antikörpern behandelt, um CD8+ T-Zellen zu markieren, die spezifische inhibitorische Rezeptoren exprimieren und einen immuntherapieresistenten Phänotyp aufweisen. Der markierte Schnitt wird mit einem Multispektralmikroskop visualisiert, um die unterschiedlichen CD8+...

Multiplex-Immunfluoreszenz-Bildgebung zur Analyse immuntherapieresistenter T-Zell-Subpopulationen

Studium der Tumor Mikroumgebung kann prognostische und prädiktive Biomarker des klinischen Ansprechens auf Immuntherapie identifizieren. Hier präsentiert, ist eine innovative Methode basierend auf in Situ Fluoreszenz multispektralen imaging, zu analysieren und automatisch verschiedene Subpopulationen von CD8 zählen+ T Zellen. Diese reproduzierbare und zuverlässige Technik eignet sich für große Kohorte Analysen.

Gemultiplext Immunfluoreszenz Analyse und Quantifizierung der intratumorale PD-1+ Tim-3+ CD8+ T-Zellen

Hier beschreiben wir eine einfache und zugängliche Strategie zur Visualisierung, Quantifizierung und Kartierung von Immunzellen in formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Tumorgewebeabschnitten. Diese Methode kombiniert vorhandene Bildgebungs- und digitale Analysetechniken mit dem Ziel, die Multiplexing-Fähigkeit und die Multiparameteranalyse von Imaging-Assays zu erweitern.

Visualisierung, Quantifizierung und Kartierung von Immunzellpopulationen in der Tumormikroumgebung

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