Optimierte Zellkernisolierung aus frischen und gefrorenen soliden Tumorproben für die Multiom-Sequenzierung
October 13th, 2023
Das Protokoll bietet einen zuverlässigen und optimierten Ansatz für die Isolierung von Zellkernen aus soliden Tumorproben für die Multiom-Sequenzierung mit der 10x Genomics-Plattform, einschließlich Empfehlungen für Gewebedissoziationsbedingungen, Kryokonservierung von Einzelzellsuspensionen und Bewertung isolierter Zellkerne.
Mit zunehmendem Wissen über die Tumorbiologie und dem Interesse, die Feinheiten der Interaktion von Zellen innerhalb des Tumors und der Beeinflussung der Patientenergebnisse zu verstehen, hat auch die Bedeutung der Analyse heterogener Zellen in der gesamten Tumormikroumgebung zugenommen. Die Multiom-Sequenzierung, die den Erwerb von Einzelzell-RNA und die Angriffssequenzierung aus derselben Zelle in gepaarter Zellweise ermöglicht, stellt einen bedeutenden Fortschritt in dieser Richtung dar. Die Qualität der aus diesen Experimenten gewonnenen Daten hängt jedoch stark von der Qualität der Versuchsbedingungen und des eingebrachten biologischen Materials ab.
Dieses Protokoll bietet einen zuverlässigen und optimierten Ansatz für die Isolierung von Zellkernen aus soliden Tumorproben für die Multiom-Sequenzierung mit der 10x Genomics-Plattform. Dieses Protokoll ist zuverlässig, wenn sowohl frische als auch gefrorene Einzelzellsuspensionen verwendet werden. Wir geben Empfehlungen für Gewebedissoziationsbedingungen, Kryokonservierung von Einzelzellsuspensionen und die Beurteilung isolierter Zellkerne.
In diesem Protokoll verwendeten wir duktale Adenokarzinomproben des menschlichen Pankreas, die in unserem Labor ein primärer Gewebetyp sind. Bauchspeicheldrüsenkrebs stellt einen stark desmoplastischen Tumortyp dar, der sowohl auf relativ klebriges Gewebe als auch auf Zellen hindeutet. Da auch die für die Forschung zur Verfügung stehenden Proben von Bauchspeicheldrüsentumoren in der Regel relativ klein sind, wird versucht, die Menge der erfassten Zellen zu maximieren.
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Überblick
Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige und optimierte Methode zur Isolierung von Kernen aus festen Tumorproben für Multi-om-Sequenzierung unter Verwendung der 10x Genomics Plattform. Es enthält Empfehlungen für Gewebedissoziationsbedingungen und Kryokonservierung von Einzelzellsuspensionen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Onkologie
- Genomik
Hintergrund
- Das Verständnis der Tumorbiologie ist entscheidend für die Verbesserung der Patientenergebnisse.
- Die Analyse heterogener Zellen in der Tumormikroumgebung ist zunehmend wichtig.
- Multi-om-Sequenzierung ermöglicht die gekoppelte Erfassung von Einzelzell-RNA und ATAC-Sequenzierung.
- Die Qualität der Daten hängt stark von den experimentellen Bedingungen und dem biologischen Material ab.
Zweck der Studie
- Ein zuverlässiges Protokoll zur Isolierung von Kernen aus festen Tumoren bereitstellen.
- Die Qualität der Multi-om-Sequenzierungsdaten verbessern.
- Die Analyse von Tumormikroumgebungen erleichtern.
Verwendete Methoden
- Isolierung von Kernen aus festen Tumorproben.
- Verwendung von frischen oder gefrorenen Einzelzellsuspensionen.
- Empfehlungen für Gewebedissoziationsbedingungen.
- Kryokonservierungstechniken für Einzelzellsuspensionen.
Hauptergebnisse
- Optimierter Ansatz für die Kernisolation wurde etabliert.
- Zuverlässige Ergebnisse aus frischen und gefrorenen Proben erhalten.
- Verbesserte Datenqualität für Multi-om-Sequenzierung.
- Richtlinien für Gewebeverarbeitung und Kryokonservierung wurden bereitgestellt.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll erhöht die Zuverlässigkeit der Kernisolation aus Tumoren.
- Es unterstützt den Fortschritt der Multi-om-Sequenzierungstechniken.
- Zukünftige Studien können von verbesserten experimentellen Bedingungen profitieren.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Optimized nuclei isolation from solid tumor specimens is critical for generating high-quality multiome sequencing data, directly impacting the reliability of tumor heterogeneity analyses in translational oncology. This protocol addresses the challenge of extracting intact nuclei from both fresh and frozen desmoplastic tumor tissues, supporting robust single-cell multiomic profiling. Reliable nuclei preparation at this stage enhances predictive confidence in downstream discovery and biomarker development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-fidelity interrogation of tumor cell heterogeneity at the single-cell level.
- Supports functional target validation by preserving diverse cell populations during isolation.
- Facilitates mechanistic de-risking through accurate representation of the tumor microenvironment.
Screening & Assay Development
- Provides standardized nuclei preparations for reproducible multiome sequencing assays.
- Ensures quantitative and qualitative consistency in input material for downstream workflows.
- Improves assay readiness by accommodating both fresh and cryopreserved tumor samples.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker discovery by enabling paired RNA and chromatin accessibility profiling.
- Maintains disease relevance by capturing the complexity of solid tumor microenvironments.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by standardizing input quality.
Pipeline & Workflow Integration
This nuclei isolation protocol is positioned at the interface of tissue processing and multiomic data generation, bridging early discovery and translational research workflows.
- Discovery Biology: Maximizes hypothesis testing power by preserving cell diversity and integrity.
- Screening: Delivers reproducible, high-quality nuclei for scalable multiome sequencing assays.
- Analytics: Enables robust quantitative readouts for comparing tumor cell states and chromatin landscapes.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment by supporting paired single-cell RNA and ATAC-seq analyses.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, adaptable protocol for diverse solid tumor types and sample conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in tumor biology and target validation studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability across fresh and frozen tumor samples.
- Strategic Value: Reduces risk of data loss or artifact introduction at the sample preparation stage.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement of oncology discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissociation and nuclei handling for optimal yield and quality.
- Demands access to specialized reagents, cell strainers, and quantitative assessment tools.
- Necessitates cross-team standardization of digestion and lysis conditions for reproducibility.
- Must be adapted for varying tumor types and sample sizes, especially for desmoplastic tissues.
- Careful monitoring of nuclear integrity is essential to avoid downstream sequencing artifacts.
