Optimierte Zellkernisolierung aus frischen und gefrorenen soliden Tumorproben für die Multiom-Sequenzierung
13. Oktober 2023
Das Protokoll bietet einen zuverlässigen und optimierten Ansatz für die Isolierung von Zellkernen aus soliden Tumorproben für die Multiom-Sequenzierung mit der 10x Genomics-Plattform, einschließlich Empfehlungen für Gewebedissoziationsbedingungen, Kryokonservierung von Einzelzellsuspensionen und Bewertung isolierter Zellkerne.
Mit zunehmendem Wissen über die Tumorbiologie und dem Interesse, die Feinheiten der Interaktion von Zellen innerhalb des Tumors und der Beeinflussung der Patientenergebnisse zu verstehen, hat auch die Bedeutung der Analyse heterogener Zellen in der gesamten Tumormikroumgebung zugenommen. Die Multiom-Sequenzierung, die den Erwerb von Einzelzell-RNA und die Angriffssequenzierung aus derselben Zelle in gepaarter Zellweise ermöglicht, stellt einen bedeutenden Fortschritt in dieser Richtung dar. Die Qualität der aus diesen Experimenten gewonnenen Daten hängt jedoch stark von der Qualität der Versuchsbedingungen und des eingebrachten biologischen Materials ab.
Dieses Protokoll bietet einen zuverlässigen und optimierten Ansatz für die Isolierung von Zellkernen aus soliden Tumorproben für die Multiom-Sequenzierung mit der 10x Genomics-Plattform. Dieses Protokoll ist zuverlässig, wenn sowohl frische als auch gefrorene Einzelzellsuspensionen verwendet werden. Wir geben Empfehlungen für Gewebedissoziationsbedingungen, Kryokonservierung von Einzelzellsuspensionen und die Beurteilung isolierter Zellkerne.
In diesem Protokoll verwendeten wir duktale Adenokarzinomproben des menschlichen Pankreas, die in unserem Labor ein primärer Gewebetyp sind. Bauchspeicheldrüsenkrebs stellt einen stark desmoplastischen Tumortyp dar, der sowohl auf relativ klebriges Gewebe als auch auf Zellen hindeutet. Da auch die für die Forschung zur Verfügung stehenden Proben von Bauchspeicheldrüsentumoren in der Regel relativ klein sind, wird versucht, die Menge der erfassten Zellen zu maximieren.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige und optimierte Methode zur Isolierung von Zellkernen aus festen Tumorgewebeproben für die Multi-Om-Sequenzierung mittels der 10x Genomics-Plattform. Es enthält Empfehlungen zu den Bedingungen für die Gewebe-Dissociation sowie zur Kryokonservierung von Einzelzell-Suspensionen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Onkologie
- Genomik
Hintergrund
- Das Verständnis der Tumorbiologie ist entscheidend, um die Behandlungsergebnisse für Patienten zu verbessern.
- Die Analyse heterogener Zellen im Tumormikromilieu gewinnt zunehmend an Bedeutung.
- Mittels Multi-Om-Sequenzierung ist die gekoppelte Erfassung von Einzelzell-RNA- und ATAC-Sequenzierung möglich.
- Die Qualität der Daten hängt stark von den experimentellen Bedingungen und dem biologischen Material ab.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Protokollvorschrift zur Isolierung von Kernen aus festen Tumoren bereitstellen.
- Die Qualität von Multi-Om-Sequenzierungsdaten verbessern.
- Die Analyse von Tumormikroumgebungen erleichtern.
Verwendete Methoden
- Isolierung von Kernen aus festen Tumorgewebeproben.
- Verwendung frischer oder gefrorener Einzelzell-Suspensionen.
- Empfehlungen für die Bedingungen der Gewebe-Dissoziation.
- Kryokonservierungsverfahren für Einzelzell-Suspensionen.
Hauptergebnisse
- Ein optimierter Ansatz für die Isolierung von Kernen wurde etabliert.
- Zuverlässige Ergebnisse wurden sowohl aus frischen als auch aus gefrorenen Proben erhalten.
- Verbesserte Datengüte für die Multi-Om-Sequenzierung.
- Leitlinien für die Gewebeverarbeitung und Kryokonservierung wurden bereitgestellt.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll verbessert die Zuverlässigkeit der Isolierung von Kernen aus Tumoren.
- Es unterstützt die Weiterentwicklung von Multi-Om-Sequenzierungstechniken.
- Zukünftige Studien können von verbesserten experimentellen Bedingungen profitieren.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die optimierte Isolierung von Zellkernen aus festen Tumorgewebeproben ist entscheidend für die Erzeugung von hochwertigen Multiom-Sequenzierungsdaten und beeinflusst direkt die Zuverlässigkeit von Analysen zur Tumorheterogenität in der translationalen Onkologie. Dieses Protokoll befasst sich mit der Herausforderung, intakte Zellkerne sowohl aus frischem als auch aus gefrorenem desmoplastischem Tumorgewebe zu gewinnen, um eine robuste Einzelzell-Multiom-Profilierung zu ermöglichen. Eine zuverlässige Zellkernpräparation in diesem Schritt erhöht die Vorhersagesicherheit in nachgeschalteten Entdeckungs- und Biomarkerentwicklungs-Pipelines.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht eine hochpräzise Untersuchung der Tumorzell-Heterogenität auf Einzelzell-Ebene.
- Unterstützt die funktionelle Validierung von Zielstrukturen, indem während der Isolation verschiedene Zellpopulationen erhalten bleiben.
- Erleichtert die mechanistische Risikominimierung durch eine genaue Abbildung des Tumormikroumfelds.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert standardisierte Zellkernpräparationen für reproduzierbare Multiom-Sequenzierungsassays.
- Gewährleistet quantitative und qualitative Konsistenz des Input-Materials für nachgeschaltete Arbeitsabläufe.
- Verbessert die Assay-Bereitschaft, indem sowohl frische als auch kryokonservierte Tumormaterialproben verarbeitet werden können.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die parallele Profilierung von RNA und Chromatinzugänglichkeit und ist damit auf die translationale Biomarker-Entdeckung ausgerichtet.
- Behält die Relevanz für die Erkrankung bei, indem er die Komplexität der Mikroumgebungen solider Tumore erfasst.
- Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung durch die Standardisierung der Eingangsqualität.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Protokoll zur Isolierung von Kernen steht an der Schnittstelle zwischen der Gewebeaufbereitung und der Generierung multiomischer Daten und verbindet damit frühe Entdeckungs- mit translationsorientierten Forschungsabläufen.
- Entdeckungsbiologie: Maximiert die statistische Power der Hypothesenprüfung, indem die Zellvielfalt und -integrität erhalten bleibt.
- Screening: Liefert reproduzierbare, hochwertige Kerne für skalierbare Multiom-Sequenzierungsassays.
- Analytik: Ermöglicht robuste, quantitative Auswertungen zum Vergleich von Tumorzellzuständen und Chromatinlandschaften.
- Translationale Forschung: Erleichtert die Biomarker-Korrelierung durch die Unterstützung gepaarter Einzelzell-RNA- und ATAC-seq-Analysen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft einen standardisierten, anpassbaren Protokollablauf für verschiedene feste Tumortypen und Probenbedingungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit in Studien zur Tumorbiologie und Zielstrukturvalidierung.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit über frische und gefrorene Tumorproben hinweg.
- Strategischer Wert: Verringert das Risiko des Datenverlusts oder der Einführung von Artefakten im Stadium der Probenvorbereitung.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung onkologischer Entdeckungs- und translationsmedizinischer Programme.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Gewebe-Dissociation und im Umgang mit Zellkernen, um optimale Ausbeute und Qualität zu erzielen.
- Benötigt Zugang zu spezialisierten Reagenzien, Zellfiltern und quantitativen Analysewerkzeugen.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei Verdauungs- und Lysebedingungen, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Muss an unterschiedliche Tumortypen und Probengrößen angepasst werden, insbesondere bei desmoplastischen Geweben.
- Ein sorgfältiges Monitoring der Kernintegrität ist unerlässlich, um störende Artefakte in nachgeschalteten Sequenzierungsverfahren zu vermeiden.
