Vereinfachte intrafemorale Injektionen mit lebenden Mäusen ermöglichen eine kontinuierliche Knochenmarkanalyse
10. November 2023
Dieses Protokoll beschreibt die intrafemorale Injektion einiger hämatopoetischer oder leukämischer Stammzellen, einschließlich geneditierter Zellen, in murine Xenotransplantatmodelle, die nicht nur eine schnelle und sichere Transplantation von Zellen, sondern auch serielle Analysen des Knochenmarks ermöglichen.
Diese Technik soll uns helfen, die Biologie der normalen Hämatopoese und Krankheit im Knochenmark besser zu verstehen, indem wertvolle Patientenproben sicher intraoral in die Mäuse injiziert und transplantiert werden, gefolgt von der Aspiration des Knochenmarks. Es ist seit langem bekannt, dass es effizienter ist, kleine Mengen wertvoller Proben direkt in das Knochenmark von Mäusen zu transplantieren, um Experimente durchzuführen, die durch intravenöse Injektion durchgeführt werden. Es gibt jedoch keine eigentlichen technischen Videos, so dass es allgemein als Hochhürdentechnik galt.
Unser Protokoll ermöglicht es, jede wertvolle Probe mit einer kleinen Anzahl von Zellen einfach und sicher in die Maus zu transplantieren. Es gibt eine hohe Nachfrage nach dieser Technologie, und mit Hilfe dieses Videos kann jeder sie schnell erlernen. Wir hoffen, dass jeder diese Technologie beherrschen und wesentlich zum Fortschritt der Wissenschaft beitragen kann.
Zu Beginn bereiten Sie Zellsuspensionen mit bis zu 3 Millionen Probenzellen unter Verwendung von 20 Mikrolitern FACS-Puffer oder Auftaumedium vor. Bewahren Sie diese vor der Injektion auf Eis auf. Desinfizieren Sie das Bein mit dem zu injizierenden Oberschenkelknochen mit drei abwechselnden Peelings mit einem Povidon-Jod- oder Chlorhexidin-Peeling und 70 % Ethanol-getränkten Mullschwämmen.
Stabilisieren Sie das Bein, indem Sie den Oberschenkelknochen mit Daumen und Zeigefinger einklemmen. Drücke das Schienbein entweder mit dem Ring oder dem fünften Finger, um das Schienbein vom Oberschenkelknochen weg gebogen zu halten. Stellen Sie sicher, dass die richtige Positionierung für eine erfolgreiche Injektion gewährleistet ist.
Verwende die Kante einer leeren sterilen 27G-Nadel, um die Patellasehne auf den Oberschenkelknochen zu picken. Um den besten Einführpunkt zu gewährleisten, führen Sie die 27G-Nadel mit einer aufgesetzten Spritze direkt unter der Patellasehne ein. Platzieren Sie sie sicher zwischen den beiden Kondylen des Oberschenkelknochens und schwenken Sie die Nadel nach außen und oben, um sie parallel zum Oberschenkelschaft auszurichten.
Drehen Sie die Nadel im Kreis, während Sie sie in die Oberschenkelmarkhöhle schieben. Führen Sie die Nadel so lange ein, bis der Widerstand merklich nachlässt. Bestätigen Sie die korrekte Positionierung der Nadel durch seitliche Bewegung.
Erzeugen Sie Unterdruck, indem Sie den Nadelkolben zurückziehen, während Sie die Nadel in der Knochenmarkhöhle bewegen. Überprüfen Sie, ob sich die Spritze auf Blut oder Knochenmark befindet, um sicherzustellen, dass sich die Nadel in der Knochenmarkhöhle befindet. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass die Nadel richtig platziert ist, entfernen Sie sie langsam und führen Sie die Spritze mit der Zelle durch dieselbe Wurzel ein.
Es ist wichtig, sich bei der Umstellung auf eine neue Nadel an die Wurzel und den Winkel der ersten Injektion zu erinnern. Sobald die Zellen erfolgreich in den Oberschenkelknochen injiziert wurden, entfernen Sie vorsichtig die Nadel und die Spritze und halten Sie den Druck auf die Spritze aufrecht. Nehmen Sie dann die Maus aus dem Nasenkonus und legen Sie sie auf ein sauberes Papiertuch, um ein Einbrennen von Einstreu zu verhindern.
Bewahren Sie die Maus zur Wiederherstellung auf einem Heizkissen oder einer anderen kontrollierten Oberfläche auf. Stellen Sie sicher, dass Sie sich von der Narkose erholen, bevor Sie sie wieder auf das Mausgestell legen. Beobachten Sie Mäuse in den nächsten 24 Stunden auf Anzeichen von Stress oder Infektionen.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung auf den Eingriff, bevor Sie das Knochenmark aspirieren, befeuchten Sie eine 0,5-Milliliter-27G-Spritze mit CSM, indem Sie CSM zwei- bis dreimal füllen und ausstoßen. Aspirieren Sie dann vorsichtig das Knochenmark aus der anästhesierten Maus, wodurch 20 bis 50 Mikroliter Knochenmark gewonnen werden. Entfernen Sie dann die Nadel vollständig aus dem Oberschenkelknochen und suspendieren Sie die aspirierte Probe in 500 Mikrolitern CSM.
Nehmen Sie die Maus aus dem Nasenkegel und legen Sie sie auf ein sauberes Papiertuch, um ein Einbrennen der Einstreu während der Genesung zu verhindern. Überwachen Sie alle Mäuse, um die Genesung von der Anästhesie zu überprüfen, bevor Sie sie auf die Rückseite des Mausracks legen. Pelletzellen aus dem Knochenmark mit einer fünfminütigen Drehung bei 300 G bei vier Grad Celsius.
Aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie jedem Röhrchen ACK-Lysepuffer hinzu. Wirbeln Sie die Zellen zur Resuspendierung vor und legen Sie sie für 5 bis 10 Minuten auf Eis. Filtern Sie die Zellsuspension durch das Nylonnetz in einen neuen Schlauch.
Spülen Sie das Originalrohr mit FACS-Puffer und führen Sie es durch das Nylonnetz, die Pelletzellen erneut, indem Sie es fünf Minuten lang bei 300 G bei vier Grad Celsius drehen. Aspirieren Sie den Überstand aus den pelletierten Zellen und fügen Sie die Färbelösung mit den gewünschten Antikörpern hinzu. Lassen Sie die Röhren 20 Minuten lang auf Eis.
Waschen Sie die Zellen und fahren Sie mit der Analyse gemäß dem Versuchsaufbau fort. Transplantationstechniken können mit minimaler Mausinvasion anhand eines Biolumineszenzbildes leicht und bewertet werden. Hier wurde die Transplantation einer humanen K562-Zelllinie mit Acalook in einem Xenotransplantat-Mausmodell an der Seite des injizierten Femurs beobachtet.
Die Transplantation von CD34-positiven HSPCs führte acht Wochen nach der Transplantation zu mehr als 10 bis 20 % der humanen Zelltransplantationen. In ähnlicher Weise führte die Transplantation von aus Nabelschnurblut gewonnenen HSCs acht Wochen nach der Transplantation zu einer Transplantation von bis zu 10 % beim Menschen. Mit diesem Verfahren wurde eine weitere erfolgreiche Transplantation von adulten HSPCs aus dem Knochenmark, Leukämie-Stammzellen, CRISPR Cas9-editierten HSPCs aus Nabelschnurblut und von Patienten stammenden AML-iPSCs erreicht.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Technik der intrafemoralen Injektion hämatopoetischer oder leukämischer Stammzellen in murinen Modellen. Diese Methode ermöglicht eine sichere Transplantation und erlaubt serielle Analysen des Knochenmarks.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Hämatopoese
- Stammzellbiologie
- Xenotransplantationsmodelle
Hintergrund
- Das Verständnis der normalen Hämatopoese und verwandter Erkrankungen ist entscheidend für den Fortschritt der medizinischen Wissenschaft.
- Die direkte Injektion in das Knochenmark ist effizienter als intravenöse Methoden.
- Bisherige Techniken verfügten nicht über leicht zugängliche Lehrressourcen.
- Dieses Protokoll zielt darauf ab, den Prozess für Forschende zu vereinfachen.
Zweck der Studie
- Sichere und effiziente Einpflanzung wertvoller Patientenproben in Mäuse ermöglichen.
- Forschern eine klare Anleitung bereitstellen.
- Das Verständnis hämatopoetischer Erkrankungen verbessern.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Zellsuspensionen mit FACS-Puffer.
- Desinfektion und Stabilisierung der Injektionsstelle.
- Intrafemorale Injektionstechnik unter Verwendung einer sterilen Nadel.
- Aspiration von Knochenmark zur Analyse nach der Injektion.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Einwanderung menschlich stammender Stammzellen in murinen Modellen.
- Nachgewiesene hohe Raten der Einwanderung menschlicher Zellen nach acht Wochen.
- Erfolgreiche Transplantation verschiedener Stammzelltypen, einschließlich geneditierter Zellen.
- Das Protokoll ermöglicht eine minimale Invasivität am Mäusemodell und eine effektive Überwachung.
Schlussfolgerungen
- Diese Technik bietet eine zuverlässige Methode für die Stammzelltransplantation in der Forschung.
- Sie trägt der Nachfrage nach zugänglichen Protokollen in der hämatopoetischen Forschung Rechnung.
- Zukünftige Studien können auf dieser Methode aufbauen, um verschiedene hämatologische Erkrankungen zu untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die direkte intrafemorale Injektion und serielle Knochenmarkaspiration an lebenden Mäusen ermöglichen eine kontinuierliche, minimalinvasive Analyse der Engraftment- und Funktionseigenschaften hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC). Dieser Ansatz behebt einen kritischen Engpass in der präklinischen Hämatologie, indem er eine prospektive, quantitative Beurteilung knochenmarkresidenter Zellpopulationen an begrenzten, wertvollen Proben erlaubt. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit für translationsmedizinische Studien und unterstützt risikoadjustierte Portfolioentscheidungen in der Forschung zu zellbasierten Therapien und hämatologischen Erkrankungen in frühen Entwicklungsstadien.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Untersuchung der HSPC-Engraftment und der Linienausgabe in einer physiologisch relevanten Knochenmarknische.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem sie die serielle Gewinnung und Phänotypisierung transplantierten Zellen im Zeitverlauf erlaubt.
- Erleichtert die funktionelle Validierung von geneditierten oder patientenabgeleiteten Zellpopulationen in vivo.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet ein validiertes In-vivo-System zur Beurteilung der Einwanderungseffizienz und Zellschicksale unter Verwendung geringer Probenzahlen.
- Ermöglicht reproduzierbare, quantitative Messung der Knochenmark-Chimäre und der Zellzusammensetzung nach Transplantation.
- Unterstützt die Standardisierung von Assays für Xenotransplantationen und Stammzelltransplantationsabläufe.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Modellierung hämatopoetischer Erkrankungen und therapeutischer Interventionen unter krankheitsrelevanten Bedingungen.
- Ermöglicht die langzeitliche Verfolgung der Engraftment und Persistenz menschlicher Zellen in murinen Xenotransplantationsmodellen.
- Unterstützt die translationale Entwicklung von Biomarkern durch Korrelation der Knochenmarkprodukte mit funktionellen Ergebnissen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode verbindet die frühe Entdeckung, die Identifizierung von Leitstrukturen und die präklinische Validierung, indem sie eine kontinuierliche, quantitative Analyse der Knochenmark-Engraftment in lebenden Tiermodellen ermöglicht.
- Entdeckungsbereich Biologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur Funktion von HSPC und deren Wechselwirkungen mit der Nische durch direkten Zugang zum Knochenmark.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Daten zur Engraftment-Effizienz für Kandidatenzellpopulationen.
- Analysen: Ermöglicht die serielle Bestimmung von Knochenmark-Chimärismus und Zellphänotyp für vergleichende Studien.
- Translationale Forschung: Gewährleistet einen nahtlosen Übergang von in-vitro-Ergebnissen zur in-vivo-Validierung in krankheitsrelevanten Modellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine skalierbare und wiederverwendbare Plattform für vielfältige Forschungsprogramme in der Zelltherapie und Hämatologie.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bezüglich der Engraftment- und Funktionseigenschaften von HSPCs, indem eine direkte, serielle Analyse des Knochenmarks ermöglicht wird.
- Operationaler Wert: Standardisiert minimalinvasive Verfahren für hochwertige Transplantationsstudien mit geringer Zellanzahl.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem bereits früh im Entwicklungsprozess belastbare, quantitative In-vivo-Daten bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Zelltherapie- und Hämatologie-Assets basierend auf funktionellen In-vivo-Ergebnissen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert technische Fachkenntnisse im Umgang mit Nagern, Anästhesie und intrafemoralen Injektionstechniken.
- Benötigt Zugang zu FACS-Analyse und bildgebender Infrastruktur für die nachgeschaltete Zellcharakterisierung.
- Erfordert eine strenge, übergreifende Standardisierung von Injektions- und Aspirationsprotokollen zur Reproduzierbarkeit.
- Einsatzmöglichkeiten bestehen mit verschiedenen Zellquellen, einschließlich geneditierter, patientenabgeleiteter und aus Nabelschnurblut stammender HSPCs.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit einer sorgfältigen Überwachung nach dem Eingriff, um das Wohlergehen der Tiere und die Integrität der Daten sicherzustellen.
