Name: Darmisolierung aus Zebrafischlarven für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Lernen Sie eine Methode zur Darmzellisolierung aus Zebrafischlarven für Einzelzell-RNA-Sequenzierung. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse gastrointestinaler Entwicklung und Erkrankungen.

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Diese Arbeit wurde von den Freunden der Sophia-Stiftung (SSWO WAR-63) finanziert.

Alle Zebrafischhaltungen und -versuche wurden nach den institutionellen Richtlinien des Erasmus MC und der Tierschutzgesetzgebung durchgeführt. Die Verwendung von Zebrafischlarven 5 Tage nach der Befruchtung fällt unter die Kategorie der Experimente, die keine formelle ethische Genehmigung erfordern, wie es in den niederländischen Vorschriften festgelegt ist.
1. Gewinnung von 5 Tagen nach der Befruchtung (dpf) Wildtyp- und tg(phox2bb:GFP)-Larven
<ol><li>Richten Sie eine Wildtyp-Zebrafischzucht ein und sammeln Sie 50 Eier in HEPES-gepuffertem E3-Medium (im Folgenden als E3 bezeichnet) in einer 15 cm großen Petrischale. Verwenden Sie diese Fische als Negativkontrolle für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACs).</li>
	<li>Richten Sie die Zucht von tg(phox2bb:GFP) Zebrafischen ein und sammeln Sie ca. 300 Eier in E3 in einer 15 cm Petrischale.</li>
	<li>Befruchtete Eier in E3 (maximal 50 Eier/Schale) in einem Hell-Dunkel-Zyklus von 14 h/10 h in einem Inkubator bei 28,5 °C aufbewahren.</li>
	<li>Bei 1 dpf entfernen Sie unbefruchtete Eier und lassen Sie die befruchteten Eier auf 5 dpf entwickeln.</li>
	<li>Selektieren Sie tg(phox2bb:GFP)-Larven bei 1 dpf.</li>
</ol>2. Dissoziation ganzer Wildtyp-Larven
<ol><li>5 dpf Larven mit 0,016% Tricain anästhesieren.</li>
	<li>Zerkleinern Sie 30 Zebrafische mit einer Rasierklinge in einer Petrischale, die 1 ml 10x Trypsin-EDTA-Lösung enthält, in kleine Stücke.</li>
	<li>Den gehackten Zebrafisch in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Gesamtvolumen von 2 ml 10x Trypsin-EDTA-Lösung überführen und 3 h auf Eis liegen lassen. Pipettieren Sie stündlich mit einer P1000-Pipette auf und ab, um die Dissoziation zu stimulieren.</li>
</ol>3. Darm-Isolierung
<ol><li>6-10 mit 0,016 % Tricain betäubte Larven mit 5 dpf hintereinander auf eine 1,8%ige Agaroseplatte (0,45 g Agarose in 25 ml E3) unter ein Präpariermikroskop legen</li>
	<li>Stecken Sie eine Insektennadel in den Kopf des Zebrafisches.</li>
	<li>Entfernen Sie alle verbleibenden E3 mit einem Taschentuch.</li>
	<li>Isolieren Sie den Darm mit einem weiteren Insektenstift, ohne andere Organe zu stören. Achten Sie darauf, dass das Eigelb entfernt wird (Ergänzende Abbildung S1A).</li>
	<li>Nach der Isolierung untersuchen Sie den Darm und entfernen Sie bei Bedarf sämtliches Nicht-Darmmaterial (z. B. Haut, Fett, Leber).</li>
	<li>Sammeln Sie den Darm mit einer Pinzette und legen Sie ihn auf Eis in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS) enthält. HINWEIS: Es sollten mindestens 244 Därme isoliert werden, wobei die Gesamtdissektionszeit bei 3 Stunden gehalten werden sollte. Dies ist möglich, wenn zwei Personen parallel arbeiten.</li>
</ol>4. Darmdissoziation
<ol><li>Unmittelbar nach der Dissektion aller Därme zentrifugieren Sie das Mikrozentrifugenröhrchen bei voller Geschwindigkeit (13.800 × g) für 30 s.</li>
	<li>Entfernen Sie das PBS/10% FCS, aber lassen Sie eine kleine Menge (~100 μl) stehen, um ein Austrocknen des Darms zu verhindern. 500 μl 2,17 mg/ml Papain in HBSS mit CaCl2 und MgCl2 zugeben, um die Zellen zu dissoziieren.</li>
	<li>Papain mit 2,5 μl Cystein (1 M) aktivieren.</li>
	<li>Den Darm in einem Wasserbad bei 37 °C für 10 min inkubieren. Pipettieren Sie auf halbem Weg (nach 5 Minuten) auf und ab, um die Verdauung des enzymatischen Gewebes zu stimulieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen in ein FACS-Röhrchen mit einem 35-μm-Zellsieb, das mit 0,5 ml PBS/10 % FCS benetzt ist.</li>
	<li>Waschen Sie das Sieb, indem Sie in 0,5-ml-Schritten insgesamt 2 ml PBS/10 % FCS hinzufügen.</li>
	<li>Bei 700 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 300 μl PBS/10% FCS.</li>
	<li>1 μg/ml 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) zur Markierung toter Zellen (1:1.000) hinzufügen und 5 Minuten lang inkubieren, um ihren Ausschluss während der FACS zu ermöglichen.</li>
</ol>5. FACS-Anreicherung
<ol><li>Verwenden Sie die Wildtyp-Probe, um die Tore der sortierten Zellpopulation zu setzen, indem Sie 3.000 Zellen auf dem Durchflusszytometer aufzeichnen (ergänzende Abbildung S1B-E).</li>
	<li>Verwenden Sie eine 100-μm-Düse, stellen Sie die Sortiergenauigkeit auf die Reinheit ein und geben Sie das Sammelröhrchen mit 200 μl PBS/5 % FCS in die FACS-Maschine.</li>
	<li>Laden Sie die Zellsuspension der Eingeweide und sortieren Sie lebende (DAPI-negative) Einzelzellen in das Sammelröhrchen (Abbildung 2C), indem Sie Dubletten (Abbildung 2B) und tote Zellen (Abbildung 2C) ausschließen. HINWEIS: Für den tg(phox2bb)-Zebrafisch wird der Anteil der GFP+ -Zellen nur als Referenz überprüft, da alle einzelnen lebenden Zellen sortiert werden.</li>
	<li>Halten Sie das Sammelröhrchen nach der Zellsortierung auf Eis.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellsuspension mit einem Hämozytometer, einschließlich einer Viabilitätsprüfung mit Trypanblau. Wenn die Lebensfähigkeit mindestens 80 % beträgt, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.</li>
	<li>Die Zellen sind nun bereit für die Verarbeitung für scRNAseq (d. h. 10x Genomics Chromium-Plattform). Verwenden Sie ca. 20.000 Zellen pro Probe.</li>
</ol>

Aufbereitung von Darmzellen aus Zebrafischlarven für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung

<ol><li>Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthy+intestinal+function+relies+on+coordinated+enteric+nervous+system%2C+immune+system%2C+and+epithelium+eesponses%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses.</a> Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).</li>
<li>Sitrin, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSitrin%2C+M+%22The+Gastrointestinal+System%22">The Gastrointestinal System</a>. , (2014).</li>
<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organisation+of+the+autonomic+nervous+system%3A+peripheral+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Neuroscience%3A+Basic+and+Clinical%22%5BJournal%5D)">The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections.</a> Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).</li>
<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system+and+neurogastroenterology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system and neurogastroenterology.</a> Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).</li>
<li>Obata, Y., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+microbiota+and+the+immune+system+on+the+development+and+organization+of+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system.</a> Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).</li>
<li>Heuckeroth, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirschsprung+disease+-+integrating+basic+science+and+clinical+medicine+to+improve+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hirschsprung disease - integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes.</a> Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).</li>
<li>Antonucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+intestinal+pseudo-obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).</li>
<li>De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+our+understanding+of+the+pathology+of+chronic+intestinal+pseudo-obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).</li>
<li>Bianco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neuromyopathies%3A+highlights+on+genetic+mechanisms+underlying+chronic+intestinal+pseudo-obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> Biomolecules. 12 (12), 1849(2022).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+growth+and+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Intestinal growth and differentiation in zebrafish.</a> Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).</li>
<li>Wallace, K. N., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+and+conserved+aspects+of+gut+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish.</a> Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).</li>
<li>Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+of+the+development+of+the+enteric+nervous+system+using+a+Tg%28-8.3bphox2b%3AKaede%29+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish.</a> Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).</li>
<li>Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+organism+for+studying+enteric+nervous+system+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073(2020).</li>
<li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Integration+of+Single-Cell+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Integration of Single-Cell Data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li>
<li>Kuil, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+characterization+of+the+larval+zebrafish+enteric+nervous+system+at+a+single+cell+transcriptomic+level%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level.</a> iScience. 26 (7), 107070(2023).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+differential+transcriptomes+and+cell+types+in+zebrafish+larvae+intestine+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver.</a> Cells. 11 (20), 3290(2022).</li>
<li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdx1b+protects+intestinal+cell+fate+by+repressing+signaling+networks+for+liver+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification.</a> Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).</li>
<li>Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+atlas+of+microbe-responsive+processes+in+the+zebrafish+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine.</a> Cell Reports. 38 (5), 110311(2022).</li>
<li>Kline, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKline%2C+M+%22Fishing+for+answers%3A+Isolating+enteric+neurons+and+identifying+putative+ENS+mutants%22">Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants</a>. , Iowa State University. https://doi.org/10.31274/etd-180810-5368 (2016).</li>
<li>Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+a+single+cell+suspension+from+zebrafish+retinal+tissue+for+flow+cytometric+cell+sorting+of+Muller+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia.</a> Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).</li>
<li>Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+zebrafish+brain-derived+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres.</a> Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617(2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Hier stellen wir eine Methode zur Isolierung und Dissoziation des Darms von 5 dpf Zebrafischlarven mittels FACS vor. Mit dieser Methode wurden verschiedene Darmzelltypen erfolgreich gesammelt und mittels scRNA-seq unter Verwendung der 10x Genomics Chromium-Plattform analysiert. Wir haben uns für die tg(phox2bb:GFP)-Zebrafischlinie entschieden, da wir einen Hinweis darauf haben wollten, dass auch lebensfähige ENS-Zellen isoliert werden (Abbildung 2D). Es ist jedoch wichtig zu beachte...

Der Magen-Darm-Trakt ist ein komplexes System, das eine wichtige Rolle für die allgemeine Gesundheit und das Wohlbefinden spielt. Es ist für die Verdauung und Aufnahme von Nährstoffen sowie für die Ausscheidung von Abfallproduktenverantwortlich 1,2. Der Magen-Darm-Trakt besteht aus mehreren Zelltypen, darunter Epithelzellen, glatte Muskelzellen, Immunzellen und das enterische Nervensystem (ENS), die eng miteinander kommunizieren, um die ordnungsgemäße Darmfunktion zu regulieren und aufrechtzuerhalten 3,4,5. Defekte in der Entwicklung des Magen-Darm-Trakts können weitreichende Auswirkungen auf verschiedene Aspekte wie die Nährstoffaufnahme, die Zusammensetzung der Mikrobiota, die Darm-Hirn-Achse und das ENS haben und zu verschiedenen enterischen neuromuskulären Erkrankungen wie Morbus Hirschsprung und chronischer intestinaler Pseudoobstruktion führen 6,7. Diese Erkrankungen sind gekennzeichnet durch eine schwere Darmdysmotilität, die durch Veränderungen in verschiedenen Schlüsselzellen verursacht wird, wie z. B. den interstitiellen Zellen des Cajal, den glatten Muskelzellen und dem ENS 6,8,9. Die molekularen Mechanismen, die der Entwicklung und Dysfunktion des Magen-Darm-Trakts zugrunde liegen, sind jedoch noch wenig verstanden.
Der Zebrafisch ist aufgrund seiner schnellen Embryonalentwicklung, seiner Transparenz während des Embryonal- und Larvenstadiums und seiner genetischen Lenkbarkeit ein wertvoller Modellorganismus für die Untersuchung der Magen-Darm-Entwicklung und -Dysfunktion 10,11,12,13,14. Es stehen zahlreiche transgene Zebrafischlinien zur Verfügung, die fluoreszierende Proteine exprimieren. Ein Beispiel für eine solche Linie ist der tg(phox2bb:GFP)-Zebrafisch, der häufig zur Untersuchung des ENS verwendet wird, da alle phox2bb+-Zellen, einschließlich enterischer Neuronen, mit15,16 markiert sind. In dieser Arbeit stellen wir unter Verwendung der tg(phox2bb:GFP)-Zebrafischlinie eine Methode zur Darmisolierung von Larven nach der Befruchtung (dpf) für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq)-Analyse vor (Abbildung 1).

<table><tbody><tr><td>10x Trypsin (0,5%)-EDTA (0,2%)</td><td>Sigma</td><td>59418C</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Rundbodenröhrchen mit Zellsiebkappe</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Rundbodenröhrchen 5 mL (FACS-Röhrchen) Schnappverschluss</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Cell Ranger v3.0.2</td><td>10X Genomics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#D-9542</td><td></td></tr><tr><td>Dissektionsmikroskop</td><td>Olympus SZX16</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSAria III Sortiermaschine</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS mit CaCl2 und MgCl2</td><td>Gibco</td><td>14025050</td><td></td></tr><tr><td>Insektenstifte</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-25</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td></td><td>Sigma C7352</td><td></td></tr><tr><td>MS-222, Tricain</td><td>Supelco</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Sigma</td><td>P4762</td><td></td></tr><tr><td>Seurat v3</td><td>Stuart et&nbsp;al. (2019)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Kat#T8154</td><td></td></tr></tbody></table>

darmisolierung aus zebrafischlarven für die einzelzell-rna-sequenzierung

Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing

Der Magen-Darm-Trakt erfüllt eine Reihe von Funktionen, die für das Leben unerlässlich sind. Angeborene Defekte, die seine Entwicklung beeinträchtigen, können zu enterischen neuromuskulären Erkrankungen führen, was unterstreicht, wie wichtig es ist, die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der Entwicklung und Dysfunktion des Magen-Darm-Trakts zugrunde liegen. In dieser Studie stellen wir eine Methode zur Darmisolierung von Zebrafischlarven 5 Tage nach der Befruchtung vor, um lebende, lebensfähige Zellen zu erhalten, die für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) verwendet werden können. Dieses Protokoll basiert auf der manuellen Dissektion des Zebrafischdarms, gefolgt von der enzymatischen Dissoziation mit Papain. Anschließend werden die Zellen einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierung unterzogen und lebensfähige Zellen für die scRNA-Sequenzierung gesammelt. Mit dieser Methode konnten wir erfolgreich verschiedene Darmzelltypen identifizieren, darunter Epithel-, Stroma-, Blut-, Muskel- und Immunzellen sowie enterische Neuronen und Gliazellen. Daher betrachten wir es als eine wertvolle Ressource, um die Zusammensetzung des Magen-Darm-Trakts bei Gesundheit und Krankheit anhand des Zebrafisches zu untersuchen.

Mit diesem Protokoll gelang es uns, den gesamten Darm von 5-dpf-Larven zu isolieren und zu dissoziieren. Durch die Verwendung von Papain als Dissoziationsenzym haben wir die Zelllebensfähigkeit signifikant verbessert und die Erfassung von 46.139 Ereignissen mit einzelnen, lebensfähigen Zellen (6,4 % aller Zellen) aus 244 isolierten Eingeweiden ermöglicht (Abbildung 2A). Als Kontrolle wurden ganze Wildtyp-Larven verwendet, um sicherzustellen, dass der Sortierprozess optimiert wurde, was eine ...

Hier beschreiben wir eine Methode zur Darmisolierung von Zebrafischlarven 5 Tage nach der Befruchtung für die Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalyse.

Darmisolierung aus Zebrafischlarven für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric ...

Unsere Forschung zielt darauf ab, die transkriptomischen Veränderungen zu untersuchen, die während der gastrointestinalen Entwicklung und Dysfunktion in Zebrafischlarven auftreten. Hier stellen wir ein neues Protokoll zur Verfügung, das die Isolierung verschiedener Zelltypen im Darm des Zebrafisches ermöglicht, was potenzielle Anwendungen für das Verständnis der Magen-Darm-Gesundheit und -Krankheit hat. In den letzten Jahren ist das Interesse an der Erforschung der Interaktion zwischen dem enterischen Nervensystem und anderen Darmzelltypen während der Entwicklung und Erkrankung gewachsen.Das Verständnis dieser komplexen Dynamik mit Hilfe fortschrittlicher Techniken wie der Einzelzell-RNA-Sequenzierung birgt das Potenzial, wichtige Einblicke in enterische Neuromyopathien zu gewinnen, was zu präziseren Diagnosen und Behandlungen führt. Mit diesem Protokoll konnten wir erfolgreich verschiedene Darmzelltypen identifizieren, darunter Epithel-, Stroma-, Blut-, Muskel-, Immunzellen und sogar enterische Neuronen und Gliazellen, die zuvor mit ähnlichen Ansätzen noch nicht in dieser Menge erfasst wurden. Somit bieten wir eine zuverlässige Technik, um die gastrointestinale Zusammensetzung wäh

gut-isolation-from-zebrafish-larvae-for-single-cell-rna-sequencing

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Die Isolierung von hoher Qualität, ist intakte RNA ein wesentlicher Schritt in vielen Labor-Protokolle. Hier zeigen wir, die RNA-Extraktion aus ganzen Zebrafisch-Embryos und cDNA-Synthese für die spätere Anwendung in verschiedenen experimentellen Verfahren, einschließlich Genexpression Microarray-Analyse.

RNA Isolation aus embryonalen Zebrafisch und cDNA-Synthese für die Genexpressionsanalyse

Dieses Video beschreibt ein Protokoll zur Isolierung von Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Zebrafischlarvengehirnen durch mechanische Zerstörung des Gehirngewebes. Die gereinigten Zellpopulationen können weiterhin für die Genomanalyse verwendet werden.

Isolierung von Gehirnzellen aus Zebrafischlarven: Eine Technik zur Gewinnung intakter Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Zebrafisch-Hirngewebe

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung einzelner Zellen aus Zebrafischembryonen, zur Anreicherung von Zellen von Interesse, zum Einfangen von Zebrafischzellen in mikrofluidisch basierten Einzelzell-Multiplexsystemen und zur Bewertung der Genexpression von einzelnen Zellen.

Isolierung und Charakterisierung von Einzelzellen aus Zebrafischembryonen

Hier präsentieren wir ein Protokoll für Gonadengewebe der Larven Zebrabärbling Isolierung, die Untersuchungen von Zebrabärbling Geschlechtsdifferenzierung und Wartung erleichtert.

Dissection von Larval Zebrabärbling Gonadal Tissue

Hier beschreiben wir eine Technik, die die Seitenpopulation Zellen aus einem Zebrabärbling Modell der myc-induzierten T-Zell-akuter lymphatischer Leukämie (T-ALL) zu isolieren. Diese Seite Bevölkerung Test ist hochempfindlich und wird für Zebrabärbling T-ALL beschrieben, aber es kann auch auf andere maligne und nicht-maligne Zebrabärbling Zelltypen anwendbar.

Die Isolierung der Seiten Bevölkerung in Myc-induzierte T-Zell akute lymphatische Leukämie in Zebrabärbling

Dieses Protokoll stellt einen Ansatz für die ganze Transkriptom-Analyse von Zebrafisch-Embryonen, Larven, oder Zellen sortiert. Wir gehören Isolierung von RNA, Pathway-Analyse von RNASeq Daten und qRT-PCR-basierte Validierung von Veränderungen der Genexpression.

Probenvorbereitung und Analyse der RNASeq-basierte Genexpressionsdaten von Zebrafisch

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll um Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirn unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu isolieren. Bei der Isolierung wird dieser Zellen zu analysieren, ihre Genexpressionsprofil RNA entzogen. Dieses Protokoll ermöglicht für die Sammlung von qualitativ hochwertigen RNA nachgelagerte Analyse wie qPCR und Transkriptom durchführen.

Isolation und RNA-Extraktion von Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirne

Wir beschreiben eine Technik zur Profilierung von microRNAs in frühen Mausembryonen. Dieses Protokoll überwindet die Herausforderung des niedrigen Zelleingangs und der kleinen RNA-Anreicherung. Dieser Assay kann verwendet werden, um Veränderungen in der miRNA-Expression im Laufe der Zeit in verschiedenen Zelllinien des frühen Mausembryons zu analysieren.

Vorbereitung kleiner RNA-Bibliotheken für die Sequenzierung von frühen Mausembryonen

Die Isolierung einzelner Kerne beruht auf der Dissoziation und der Waschmittel-basierten Permeabilisierung der Zellmembran, Schritte, die optimiert werden müssen und anfällig für die Einführung technischer Artefakte sind. Wir zeigen ein Waschmittel- und enzymfreies Protokoll zur schnellen Isolierung intakter Kerne direkt aus dem gesamten Gewebe, das Kerne liefert, die für Single-Nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) oder ATAC-seq geeignet sind.

Kernisolierung aus ganzem Gewebe mit einer Waschmittel- und enzymfreien Methode

Hier stellen wir eine Methode vor, mit der mehrere Zebrafisch-Larvenproben (Danio rerio) ausgerichtet und kryosektioniert und auf einem einzigen Objektträger für die räumliche transkriptomische Analyse gesammelt werden können.

Räumlich kompakte Anordnung von Zebrafischlarvenschnitten für die räumliche Transkriptomanalyse

Lernen Sie eine Methode zur Darmzellisolierung aus Zebrafischlarven für Einzelzell-RNA-Sequenzierung. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse gastrointestinaler Entwicklung und Erkrankungen.

Darmisolierung aus Zebrafischlarven für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung

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