Hochdurchsatzexpression und Aufreinigung humaner gelöster Träger für strukturelle und biochemische Untersuchungen
29. September 2023
Strukturelle und biochemische Untersuchungen menschlicher Membrantransporter erfordern Milligrammmengen an stabilem, intaktem und homogenem Protein. Hier beschreiben wir skalierbare Methoden zum Screening, zur Expression und zur Reinigung humaner Transporter gelöster Substanzen unter Verwendung von Codon-optimierten Genen.
Solute Carrier, kurz SLCs, sind für die Aufnahme von Nährstoffen verantwortlich und an menschlichen Krankheiten beteiligt. Es gibt jedoch nur wenige Medikamente, die auf SLCs abzielen, da sie schlecht untersucht sind. Wir haben effiziente Ansätze entwickelt, um SLCs zu klonen, zu exprimieren und zu reinigen.
Unser Arbeitsablauf liefert reine Proteine, die biochemische und strukturelle Studien ermöglichen und letztendlich Erkenntnisse für Arzneimittelforschungskampagnen liefern. Mit den zahlreichen Rollen in biologischen Prozessen, Krankheiten und der Verabreichung von Medikamenten haben SLCs zunehmend Aufmerksamkeit erhalten und sind zu attraktiven therapeutischen Zielen geworden. Die privaten, öffentlichen ReSOLUTE IMI-Projekte generierten frei zugängliche Ressourcen und Daten, um neue Entdeckungen in der SLC-Funktion, Physiologie, Pathologie und therapeutischen Ausrichtung zu ermöglichen.
Traditionell waren SLCs schwierig zu untersuchen, da es sich um integrale Membranproteine mit verschiedenen Substraten und unterschiedlichen Transportmechanismen handelt. In jüngster Zeit haben Cryo-EM, das BacMam-Expressionssystem und neue Solubilisierungsreagenzien zu einer deutlichen Veränderung ihrer Charakterisierung geführt. Für biochemische und strukturelle Untersuchungen werden reine Proteinproben benötigt.
In menschlichen gelösten Stoffen haben Träger oft eine schlechte Ausbeute, wenn sie überexprimiert werden, und instabil, wenn sie gereinigt werden. Daher brauchte in der Vergangenheit jedes Target Jahre, um individuelle Strukturen zu entwickeln, um die Proteinprobe für nachgelagerte Anwendungen herzustellen. Unsere Methode ist für die parallele und kosteneffiziente Untersuchung mehrerer Ziele oder Konstrukte eines einzelnen Ziels optimiert.
Daher werden experimentelle Flexibilität, Kosten, Zeit und Laborressourcen sorgfältig abgewogen. Darüber hinaus bieten wir in diesem Artikel und im ReSOLUTE-Webportal einen offenen Zugang zu allen unseren Protokollen und Ressourcen.
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Übersicht
Diese Studie konzentriert sich auf Solutentransporter (SLCs), die für die Nährstoffaufnahme entscheidend sind und mit verschiedenen menschlichen Erkrankungen in Verbindung stehen. Die Forschenden entwickelten effiziente Methoden zum Klonen, Expressieren und Reinigen von SLCs, wodurch weitere biochemische und strukturelle Untersuchungen ermöglicht werden.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biochemie
- Pharmakologie
Hintergrund
- Lösungsträger spielen eine entscheidende Rolle beim Transport von Nährstoffen.
- Sie sind an mehreren menschlichen Erkrankungen beteiligt.
- Trotz ihrer Bedeutung zielen nur wenige Arzneimittel auf SLCs ab, da die Forschung begrenzt ist.
- Aktuelle Initiativen zielen darauf ab, das Verständnis der Funktionen von SLCs zu verbessern.
Zweck der Studie
- Entwicklung skalierbarer Methoden zur Untersuchung menschlicher SLCs.
- Herstellung reiner Proteine für die biochemische und strukturelle Analyse.
- Unterstützung von Arzneimittelentdeckungsansätzen, die SLCs als Zielstrukturen nutzen.
Verwendete Methoden
- Klonierung kodon-optimierter Gene für SLCs.
- Expression von SLC-Proteinen in geeigneten Systemen.
- Reinigung der Proteine zur Gewinnung homogener Proben.
- Nutzung offener Ressourcen aus IMI-Projekten für den Datenzugriff.
Hauptergebnisse
- Es wurden effiziente Methoden für Klonierung und Expression etabliert.
- SLC-Proteine in hoher Reinheit wurden für weitere Untersuchungen gewonnen.
- Die Studie liefert Einblicke in die Funktionen von SLCs und deren therapeutisches Potenzial.
- Die gewonnenen Daten unterstützen laufende Forschungsarbeiten zur Physiologie und Pathologie von SLCs.
Schlussfolgerungen
- Entwickelte Methoden verbessern die Untersuchung von SLCs erheblich.
- Die gewonnenen Erkenntnisse könnten zu neuen Strategien in der Wirkstoffforschung führen.
- Ein vertieftes Verständnis von SLCs könnte die therapeutische Zielgerichtetheit verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Menschliche Solutenträger (SLCs) stellen eine große, bisher wenig genutzte Klasse von Membrantransportern mit erheblichem therapeutischem Potenzial dar; ihre strukturelle und biochemische Charakterisierung ist jedoch aufgrund von Schwierigkeiten bei der Expression und Reinigung zurückgeblieben. Dieser Hochdurchsatz-Arbeitsablauf ermöglicht die parallele, skalierbare Herstellung reiner, funktionell aktiver SLC-Proteine und behebt damit eine zentrale Engstelle bei der frühen Arzneimittelforschung und Zielvalidierung. Durch die erleichterte Bereitstellung hochwertiger SLC-Proben unterstützt das Verfahren die risikomindernde Bewertung entlang des gesamten Portfolio und beschleunigt die Prüfung dieser Zielstrukturen für pharmazeutische Eingriffe.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die systematische Untersuchung der Funktion und Substratspezifität von SLC-Transportern.
- Unterstützt die mechanistische Ent风险bewertung, indem strukturell intaktes, biochemisch aktives Protein für die Hypothesenprüfung bereitgestellt wird.
- Erleichtert die Target-Validierung durch reproduzierbare parallele Herstellung mehrerer SLC-Konstrukte.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert hochreine SLC-Proteine, die für quantitative biochemische und Transportassays geeignet sind.
- Standardisiert die Proteinzugabe für nachgeschaltete Hochdurchsatz-Screenings und Bindungsstudien.
- Verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Assays, indem eine konsistente Proteinqualität und -ausbeute sichergestellt wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht strukturelle Untersuchungen, die Einblicke in krankheitsrelevante Transporter-Mechanismen und deren Arzneistoff-Eignung liefern.
- Bietet stabile Proteinpräparationen für Studien zur Bindung und zum Transport von Wirkstoffen, die mit der Entwicklung translationaler Biomarker verknüpft sind.
- Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem Daten zur Proteinstabilität und -aktivität generiert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieser Arbeitsablauf integriert sich an der Schnittstelle zwischen früher Entdeckung und Identifizierung von Leitstrukturen und liefert grundlegende Reagenzien sowohl für mechanistische Untersuchungen als auch für Screening-Kampagnen.
- Entdeckungsbiochemie: Stellt hochwertige SLC-Proteine für hypothesengetriebene funktionelle und strukturelle Analysen bereit.
- Screening: Ermöglicht die robuste Entwicklung von Assays und die Untersuchung von Substanzen mit reproduzierbaren Proteinmengen.
- Analytik: Liefert quantitative Ergebnisse wie Protein-Konzentration, Reinheit und Monodispersität für den Vergleich zwischen verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Identifizierung krankheitsrelevanter SLCs und deren pharmakologische Modulation.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine skalierbare und wiederverwendbare Plattform zur Bewertung von SLC-Zielen in mehreren Programmen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Auswahl von SLC-Zielen und verringert mechanistische Unklarheiten.
- Operationaler Wert: Vereinfacht die Proteinproduktion durch standardisierte, hochdurchsatzfähige Protokolle.
- Strategischer Wert: Beschleunigt Go/No-Go-Entscheidungen und verbessert die Kapitalallokation, indem eine frühere Zielauswahl ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von SLC-Zielen für die Weiterentwicklung in Screening- und präklinische Pipeline.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Expression, Reinigung und analytischen Charakterisierung von Membranproteinen.
- Setzt Zugang zu eukaryotischen Expressionssystemen, chromatographischer Infrastruktur und Proteinanalytik voraus.
- Profitiert von standardisierten Protokollen und Open-Access-Ressourcen zur Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen.
- Ermöglicht die Anpassung an verschiedene Mitglieder der SLC-Familie und unterschiedliche Konstrukt-Designs, was eine breite Anwendbarkeit unterstützt.
- Die Stabilität und Ausbeute des Proteins können je nach Zielprotein variieren, was eine Optimierung von Konstrukt und Pufferbedingungen erfordert.
