Name: Isolierung von Zellen mit morphologischen und räumlichen Informationen aus oralen submukösen Fibroseproben mittels Laser-Capture-Mikrodissektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: Lernen Sie die Laser-Capture-Mikrodissektion zur Isolierung von Zellen aus oralen submukösen Fibroseproben für Multi-Omics-Analysen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung maligner Transformationsmechanismen in formalinfixiertem Gewebe.

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Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendien der National Nature Science Foundation of China (81671006, 81300894), des CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-038), des National Clinical Key Discipline Construction Project (PKUSSNKP-202102) und des Innovation Fund for Outstanding Doctoral Candidates des Peking University Health Science Center (BMU2022BSS001) unterstützt.

Diese Studie wurde vom institutionellen Prüfungsausschuss der Peking University School and Hospital genehmigt. Von den Patienten wurde eine Einverständniserklärung eingeholt. Die in dieser Studie verwendeten Gewebeproben wurden deidentifiziert. Das Studienschema ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Vorbereitung der Probe
<ol><li>Schneiden Sie formalinfixiertes, paraffineingebettetes orales submuköses Fibrosegewebe in kontinuierliche Abschnitte von 3 μm und 10 μm Dicke auf einem Mikrotom.</li>
	<li>Klappen Sie die Abschnitte im Wasser auf und fischen Sie dann auf die Rutschen. Befestigen Sie die 3 μM- und 10 μm-Schnitte auf Adhäsionsobjektträgern (Objektträger A) bzw. PEN-Membranobjektträgern (Objektträger B).</li>
	<li>Legen Sie die Objektträger für 2 h bei 60 °C auf eine heiße Platte.</li>
</ol>2. Hämatoxylin-Eosin-Färbung
<ol><li>Objektträger A und B für 10 Minuten in Xylol legen (VORSICHT) und diesen Schritt dreimal wiederholen.</li>
	<li>Hydratobjektträger A und B in abgestuften Ethanollösungen in der Größenordnung von 100 %, 100 %, 90 %, 80 % und 70 % für 1 Minute in jeder Konzentration.</li>
	<li>Objektträger A und B für 30 s in hochreines destilliertes Wasser legen</li>
	<li>Objektträger A und B für 90 s in Harris-Hämatoxylin-Farbstofflösung legen.</li>
	<li>Objektträger A und B für 30 s in hochreines destilliertes Wasser legen und diesen Schritt dreimal wiederholen.</li>
	<li>Objektträger A und B 2 s lang in div-Hämatoxylin-Lösung legen (VORSICHT).</li>
	<li>Objektträger A und B für 30 s in hochreines destilliertes Wasser legen und diesen Schritt dreimal wiederholen.</li>
	<li>Objektträger in A und B 2 s lang in 1%ige Re-Blue-Lösung legen.</li>
	<li>Objektträger A und B für 30 s in hochreines destilliertes Wasser legen und diesen Schritt dreimal wiederholen.</li>
	<li>Objektträger für 2 s in Eosinlösung legen.</li>
	<li>Objektträger A und B für 30 s in hochreines destilliertes Wasser legen und diesen Schritt dreimal wiederholen.</li>
	<li>Dehydrieren Sie die Objektträger in abgestuften Ethanollösungen in der Größenordnung von 70 %, 80 %, 90 %, 100 % und 100 % für 2 s in jeder Konzentration.</li>
	<li>Objektträger A für 3 Minuten in Xylol legen und diesen Schritt zweimal wiederholen.</li>
	<li>Geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium (VORSICHT) auf den Objektträger A und decken Sie ihn mit einem Deckglas ab.</li>
</ol>3. Beobachtung der histologischen Morphologie und Laser-Capture-Mikrodissektion
<ol><li>Initiieren Sie das Laser-Mikrodissektionssystem und die Software (Abbildung 2).</li>
	<li>Platzieren Sie Objektträger A auf dem Objektträgertisch und beobachten Sie die histologische Morphologie, um den für die Lasermikrodissektion interessierenden Bereich zu identifizieren.</li>
	<li>Entfernen Sie den Objektträger A und platzieren Sie den Objektträger B umgekehrt auf dem Objektträgertisch.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Entladen (Abbildung 2), um das Sammelgerät zu verschieben. Führen Sie ein PCR-Röhrchen (Polymerase-Kettenreaktion) in das Sammelgerät ein und stellen Sie sicher, dass das Röhrchen fixiert ist. Klicken Sie auf die Schaltfläche OK (Abbildung 3).</li>
	<li>Wählen Sie eine Kappe aus, indem Sie auf den entsprechenden roten Kreis klicken, der das Kollektorgerät: Röhrchenkappen markiert. Der ausgewählte Kreis wird grün.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltflächen Zeichnen und Zeichnen + Ausschneiden und skizzieren Sie mit der Maus den gewünschten Bereich.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche "Schnitt starten ", um den gewünschten Bereich zu erfassen. Die aufgefangene Probe wird von der Kappe aufgefangen (Abbildung 4).</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Unter, um sicherzustellen, dass die erfasste Probe entnommen wird (Abbildung 5).</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Probe, um die nächste Probe zu erfassen.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Entladen, um das PCR-Röhrchen mit der entnommenen Probe zu entladen .</li>
</ol>

Erfassung von Gewebeproben der oralen submukösen Fibrose für die Spatial-Omics-Analyse

<ol><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+submucous+fibrosis%3A+A+clinicopathological+study+of+674+cases+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Pathology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oral submucous fibrosis: A clinicopathological study of 674 cases in China.</a> Journal of Oral Pathology & Medicine. 48 (4), 321-325 (2019).</li>
<li>Cai, X., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinicopathological+factors+associated+with+progression+of+oral+submucous+fibrosis%3A+A+population-based+retrospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncology%22%5BJournal%5D)">Clinicopathological factors associated with progression of oral submucous fibrosis: A population-based retrospective study.</a> Oral Oncology. 130, 105949(2022).</li>
<li>Ray, J. G., Chatterjee, R., Chaudhuri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+submucous+fibrosis%3A+A+global+challenge.+Rising+incidence%2C+risk+factors%2C+management%2C+and+research+priorities%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontology+2000%22%5BJournal%5D)">Oral submucous fibrosis: A global challenge. Rising incidence, risk factors, management, and research priorities.</a> Periodontology 2000. 80 (1), 200-212 (2019).</li>
<li>Shih, Y. H., Wang, T. H., Shieh, T. M., Tseng, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+submucous+fibrosis%3A+A+Review+on+etiopathogenesis%2C+diagnosis%2C+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Oral submucous fibrosis: A Review on etiopathogenesis, diagnosis, and therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 2940(2019).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preliminary+exploration+of+immune+microenvironment+in+oral+leukoplakia+concomitant+with+oral+submucosal+fibrosis%3A+A+comparative+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Pathology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">The preliminary exploration of immune microenvironment in oral leukoplakia concomitant with oral submucosal fibrosis: A comparative immunohistochemical study.</a> Journal of Oral Pathology & Medicine. , (2023).</li>
<li>Warnakulasuriya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+potentially+malignant+disorders%3A+A+consensus+report+from+an+international+seminar+on+nomenclature+and+classification%2C+convened+by+the+WHO+Collaborating+Centre+for+Oral+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Oral potentially malignant disorders: A consensus report from an international seminar on nomenclature and classification, convened by the WHO Collaborating Centre for Oral Cancer.</a> Oral Diseases. 27 (8), 1862-1880 (2021).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+nomogram+prediction+model+for+malignant+transformation+of+oral+potentially+malignant+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncology%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a nomogram prediction model for malignant transformation of oral potentially malignant disorders.</a> Oral Oncology. 123, 105619(2021).</li>
<li>Murthy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+transformation+rate+of+oral+submucous+fibrosis%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Malignant transformation rate of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis.</a> Journal of Clinical Medicine. 11 (7), 1793(2022).</li>
<li>Kujan, O., Mello, F. W., Warnakulasuriya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+transformation+of+oral+submucous+fibrosis%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Malignant transformation of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis.</a> Oral Diseases. 27 (8), 1936-1946 (2020).</li>
<li>Qin, X., Ning, Y., Zhou, L., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+submucous+fibrosis%3A+Etiological+mechanism%2C+malignant+transformation%2C+therapeutic+approaches+and+targets%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Oral submucous fibrosis: Etiological mechanism, malignant transformation, therapeutic approaches and targets.</a> International Journal of Molecular Sciences. 24 (5), 4992(2023).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+and+spatial+dissection+of+precancerous+lesions+underlying+the+initiation+process+of+oral+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma.</a> Cell Discovery. 9 (1), 28(2023).</li>
<li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineating+the+dynamic+evolution+from+preneoplasia+to+invasive+lung+adenocarcinoma+by+integrating+single-cell+RNA+sequencing+and+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics.</a> Experimental & Molecular Medicine. 54 (11), 2060-2076 (2022).</li>
<li>Ji, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+analysis+of+composition+and+spatial+architecture+in+human+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma.</a> Cell. 182 (2), 497-514 (2020).</li>
<li>Van den Bossche, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment-driven+intratumoral+heterogeneity+in+head+and+neck+cancers%3A+clinical+challenges+and+opportunities+for+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Resistance+Updates%22%5BJournal%5D)">Microenvironment-driven intratumoral heterogeneity in head and neck cancers: clinical challenges and opportunities for precision medicine.</a> Drug Resistance Updates. 60, 100806(2022).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+in+the+risk+assessment+of+oral+leukoplakia+through+morphology-related+copy+number+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+China.+Life+sciences%22%5BJournal%5D)">Improvement in the risk assessment of oral leukoplakia through morphology-related copy number analysis.</a> Science China. Life sciences. 64 (9), 1379-1391 (2021).</li>
<li>Watkins, T. B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pervasive+chromosomal+instability+and+karyotype+order+in+tumour+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pervasive chromosomal instability and karyotype order in tumour evolution.</a> Nature. 587 (7832), 126-132 (2020).</li>
<li>Odell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+and+loss+of+heterozygosity+as+risk+markers+for+malignant+transformation+in+oral+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy and loss of heterozygosity as risk markers for malignant transformation in oral mucosa.</a> Oral Diseases. 27 (8), 1993-2007 (2021).</li>
<li>Wood, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+road+to+invasion-examining+the+similarities+and+differences+in+the+genomes+of+associated+oral+pre-cancer+and+cancer+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">The genomic road to invasion-examining the similarities and differences in the genomes of associated oral pre-cancer and cancer samples.</a> Genome Medicine. 9 (1), 53(2017).</li>
<li>Venugopal, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+proteomics+based+on+2D+gel+electrophoresis+and+mass+spectrometry+with+validations%3A+Identification+of+a+biomarker+compendium+for+oral+submucous+fibrosis-An+indian+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Personalized+Medicine%22%5BJournal%5D)">Integrated proteomics based on 2D gel electrophoresis and mass spectrometry with validations: Identification of a biomarker compendium for oral submucous fibrosis-An indian study.</a> Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 208(2022).</li>
<li>Kundu, P., Pant, I., Jain, R., Rao, S. G., Kondaiah, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+DNA+methylation+changes+in+oral+submucous+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Genome-wide DNA methylation changes in oral submucous fibrosis.</a> Oral Diseases. 28 (4), 1094-1103 (2022).</li>
<li>Cai, X., Zhang, H., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-target+pharmacological+mechanisms+of+Salvia+miltiorrhiza+against+oral+submucous+fibrosis%3A+A+network+pharmacology+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Multi-target pharmacological mechanisms of Salvia miltiorrhiza against oral submucous fibrosis: A network pharmacology approach.</a> Archives of Oral Biology. 126, 105131(2021).</li>
<li>Xiao, X., Hu, Y., Li, C., Shi, L., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+content+abnormality+in+oral+submucous+fibrosis+concomitant+leukoplakia%3A+A+preliminary+evaluation+of+the+diagnostic+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">DNA content abnormality in oral submucous fibrosis concomitant leukoplakia: A preliminary evaluation of the diagnostic and clinical implications.</a> Diagnostic Cytopathology. 48 (11), 1111-1114 (2020).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNA+expression+profile+associated+with+malignant+progression+of+oral+submucous+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNA expression profile associated with malignant progression of oral submucous fibrosis.</a> Journal of Oncology. 2019, 6835176(2019).</li>
<li>Lunde, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+chromosomal+changes+in+potentially+malignant+and+malignant+oral+mucosal+lesions+from+South+and+Southeast+Asia+using+array-comparative+genomic+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genomics+%26+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Profiling of chromosomal changes in potentially malignant and malignant oral mucosal lesions from South and Southeast Asia using array-comparative genomic hybridization.</a> Cancer Genomics & Proteomics. 11 (3), 127-140 (2014).</li>
<li>Sun, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+resolved+metabolomics+to+discover+tumor-associated+metabolic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (1), 52-57 (2019).</li>
<li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+alteration+profiling+facilitates+differential+diagnosis+between+ossifying+fibroma+and+fibrous+dysplasia+of+the+jaws%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oral+Science%22%5BJournal%5D)">Copy number alteration profiling facilitates differential diagnosis between ossifying fibroma and fibrous dysplasia of the jaws.</a> International Journal of Oral Science. 13 (1), 21(2021).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Dieses Protokoll berichtete über eine Pipeline zur Erfassung von OSF-Gewebeproben mit morphologischen und räumlichen Informationen für weitere räumlich-omische Analysen durch Lasermikrodissektion. Aus den repräsentativen Ergebnissen identifizierten wir unterschiedliche CNA-Muster in verschiedenen morphologiebezogenen Proben.
OSF, eine Form der OPMD, ist eine häufige Krebsvorstufe des oralen Plattenepithelkarzinoms6. Es wurde berichtet, dass genomische Instabilität mit d...

Die orale submuköse Fibrose (OSF) ist eine chronische, schleichende Erkrankung, die sich vor allem in der Wangenschleimhaut entwickelt und zu einer eingeschränkten Mundöffnung führt1. Während OSF eine multifaktorielle Erkrankung ist, ist das Kauen von Arekanüssen oder Betelnüssen die Hauptursache für OSF 2,3. Aufgrund dieser geographisch spezifischen Gewohnheit ist OSF überwiegend in Populationen in Südost- und Südasien konzentriert3. Zu den häufigsten histologischen Merkmalen der OSF gehören abnorme Kollagenablagerungen im Bindegewebe unter dem oralen Schleimhautepithel, Gefäßstenose und Okklusion1. OSF-Epithelgewebe kann mit Manifestationen von Atrophie oder Hyperplasie und sogar Dysplasie auftreten, wenn es mit oraler Leukoplakie einhergeht 4,5.
OSF wird von der Weltgesundheitsorganisation als eine häufige orale potenziell maligne Erkrankung (OPMD) definiert, die das Potenzial aufweist, zu einem oralen Plattenepithelkarzinom mit einer malignen Transformationsrate von 4%-6% fortzuschreiten6,7,8,9. Der Mechanismus, der der malignen Transformation von OSF zugrunde liegt, ist komplex10. Abnormales Wachstum des Epithels, einschließlich Dysplasie und Atrophie, erhöht das Potenzial für die Karzinogenese, und seneszente Fibroblasten im Stroma können an der malignen Progression von OSF beteiligt sein, indem sie den epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und andere Moleküle induzieren10.
Technologien für räumlich-omische Analysen generierten multi-omische Daten mit morphologischen und räumlichen Informationen, die Einblicke in Krebsmechanismen lieferten11,12,13. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, mit dem morphologiebezogene Zellpopulationen aus formalinfixiertem, paraffineingebettetem OSF-Gewebe mittels Lasermikrodissektion erfasst werden können. Multi-omic-Analysen dieser Proben können Herausforderungen in Bezug auf die Heterogenität innerhalb des Gewebes überwinden und das Verständnis der molekularen Pathologie und der Mechanismen der malignen Transformation bei OSF14 verbessern.

<table><tbody><tr><td>Adhäsionsmikroskop-Objektträger</td><td>CITOTEST</td><td>REF.188105</td><td></td></tr><tr><td>Div-Hämatoxylin</td><td>YiLi</td><td>20230326</td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Lösung</td><td>BASO</td><td>BA4098</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>PEKING REAGENZ</td><td>Nr.32061</td><td></td></tr><tr><td>Harris Hämatoxylin-Farbstofflösung</td><td>YiLi</td><td>20230326</td><td></td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td>LEICA</td><td>HI1220</td><td></td></tr><tr><td>Laser-Capture-Mikrodissektionssystem</td><td>LEICA</td><td>LMD7</td><td>Maschine</td></tr><tr><td>Laser-Mikrodissektions-Mikrosystem</td><td>LEICA</td><td>8.2.3.7603</td><td>Software</td></tr><tr><td>Micromount-Montagemedium</td><td>LEICA</td><td>REF.3801731</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckglas</td><td>CITOTEST</td><td>REF.10212450C</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>LEICA</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Röhrchen</td><td>AXYGEN</td><td>16421959</td><td></td></tr><tr><td>PEN-Membran-Objektträger</td><td>LEICA</td><td>Nr.11505158</td><td></td></tr><tr><td>Re-blue-Lösung</td><td>YiLi</td><td>20230326</td><td></td></tr><tr><td>Reinstes destilliertes Wasser</td><td>Invitrogen</td><td>REF.10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Xylol-PEKING</td><td>REAGENZ</td><td>Nr.33535</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von zellen mit morphologischen und räumlichen informationen aus oralen submukösen fibroseproben mittels laser-capture-mikrodissektion

Isolation of Cells with Morphological and Spatial Information from Oral Submucous Fibrosis Samples by Laser Capture Microdissection

Die orale submuköse Fibrose (OSF) ist eine häufige Form einer potenziell bösartigen Erkrankung in der Mundhöhle. Die Atrophie des Epithels und die Fibrose der Lamina propria und der Submukosa sind häufig auf histopathologischen Objektträgern zu finden. Es wurde vorgeschlagen, dass epitheliale Dysplasie, epitheliale Atrophie und seneszente Fibroblasten mit der malignen Transformation von OSF assoziiert sind. Aufgrund der Heterogenität von potentiell malignen oralen Erkrankungen und oralen Plattenepithelkarzinomen ist es jedoch schwierig, die spezifischen molekularen Mechanismen der malignen Transformation bei OSF zu identifizieren. In dieser Arbeit stellen wir eine Methode vor, um eine kleine Anzahl von Epithel- oder Mesenchymzellen, die morphologische Daten und räumliche Informationen tragen, durch Laser-Capture-Mikrodissektion auf formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeobjektträgern zu erhalten. Mit einem Mikroskop können wir mikroskaliges (~500 Zellen) dysplastisches oder atrophisches Epithelgewebe und fibrotisches subepitheliales Gewebe präzise erfassen. Die extrahierten Zellen können durch Genom- oder Transkriptomsequenzierung ausgewertet werden, um genomische und transkriptomische Daten mit morphologischen und räumlichen Informationen zu erhalten. Dieser Ansatz beseitigt die Heterogenität der Massensequenzierung von OSF-Gewebe und die Interferenz, die durch Zellen in nicht läsionierten Bereichen verursacht wird, und ermöglicht eine präzise Spatial-Omics-Analyse von OSF-Gewebe.

Durch die Lasermikrodissektion von OSF-Geweben haben wir Proben von dysplastischem Epithel, Stroma unter dem dysplastischen Epithel, atrophischem Epithel und Stroma unter atrophischem Epithelgewebe entnommen (Abbildung 1). Durch die Extraktion von DNA und die Sequenzierung des gesamten Genoms mit geringer Tiefe waren wir in der Lage, morphologiebedingte Kopienzahlveränderungen (CNA) zu analysieren15. CNA ist eine häufige Form der genomischen Instabilität, die mit eine...

Die Laser-Capture-Mikrodissektion von oralem submukösem Fibrosegewebe ermöglicht die präzise Extraktion von Zellen aus histologischen Regionen von Interesse für die Analyse von Multi-Omics-Daten mit morphologischen und räumlichen Informationen.

Isolierung von Zellen mit morphologischen und räumlichen Informationen aus oralen submukösen Fibroseproben mittels Laser-Capture-Mikrodissektion

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina ...

Unser Hauptforschungsinteresse gilt den Mechanismen der malignen Transformation unter der Entwicklung von Vorhersagemodellen für orale, potentiell maligne Erkrankungen wie orale Leukoplakie und orale submuköse Fibrose. Genomische Transkriptomik-, Proteom- und andere Multi-Omic-Sequenzierungsanalysen unter Deep-Learning-Modellen der künstlichen Intelligenz werden verwendet, um das Fortschreiten von oralen, potenziell bösartigen Erkrankungen zu Mundkrebs zu untersuchen. Derzeitige Sequenzierungen und Multi-Omics-Analysen basieren meist auf gefrorenen Proben, aber orale, potenziell maligne Erkrankungen sind meist formell fixiertes Paraffingewebe, oft durch Biopsie, und es besteht die Notwendigkeit, experimentelle Techniken auf der Grundlage von Paraffinproben zu entwickeln.Paraffingewebeproben von oralen, potenziell bösartigen Erkrankungen und dem Plattenepithelkarzinom sind in großer Zahl und aus einer Vielzahl von Quellen verfügbar, was sie zu einer sehr wertvollen Ressource für Studien macht. Alle Protokolle können dazu beitragen, diese Ressourcen voll auszuschöpfen, um die Mechanismen der Krankheitsentwicklung und der bösartigen Transformation besser zu verstehen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Laser Capture Mikrodissektion von Säugetiergewebe

Das Video beschreibt die Laserdissektion des 3D-organotypischen Co-Kulturmodells mit Präzision im Mikrometerbereich. In organotypischen 3D-Modellen werden stromale Bestandteile wie Fibroblasten 3-dimensional mit Krebsepithelzellen kokultiviert. Das 3D-Modell dient als experimentelles Werkzeug, mit dem Invasion und Krebs-Stroma-Wechselwirkungen unter nahezu physiologischen Bedingungen untersucht werden können.

Lasermikrodissektion: Eine Technik zur Isolierung eindringender Darmkrebszellen aus einem organotypischen 3D-Kulturmodell

Molecular Profiling von Laser mikrodissektiert Zellen und Stroma aus synthetischen, Tissue-Engineering-Darmkrebs-Modelle stellt einen neuartigen Ansatz zur manipulierbaren und an der Schnittstelle zwischen Tumorzellen zu charakterisieren und zu sezieren die unverwechselbare Biologie an der invasiven Front und Krebs Stromazellen.

Molecular Profiling von der invasiven Tumor-Microenvironment in einem 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells und<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Fibroblasten

Mikrodissektion wurde ausgiebig für die Untersuchung von DNA, RNA und Protein in Gewebe eingesetzt. Laser-Capture-Mikroskopie (LCM) ist die am häufigsten verwendete Methode, aber eine neue Frästechnik mesodissection ist kürzlich verfügbar. Wir zeigen, RNA-Extraktion aus Formalin fixiert mesodissected Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten von Mycobacterium tuberculosis Granulome.

A Novel Microdissection Ansatz zur Wiederherstellung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Spezifische Transkripte aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Lung Granulome

Die Isolierung der einzelnen Dopamin-Neuronen oder der ventralen Haubengebiet mit direkter oder indirekter Immunhistochemie nutzt Laser Mikrodissektion demonstriert. Parameter für die Isolierung von Gewebe aus einem Glasobjektträger unter Verwendung eines Infrarotlasers und aus Membran Folien unter Verwendung der Kombination eines Infrarot und Ultraviolett-Lasers diskutiert.

Laser Mikrodissektion - Eine Demonstration der Isolation der einzelnen Dopamin-Neuronen und die gesamte ventrale Tegmentum

Genexpressionsanalyse einer Untergruppe von Zellen in einem spezifischen Gewebe stellt eine große Herausforderung. Dieser Artikel beschreibt, wie man qualitativ hochwertige Gesamt-RNA aus einer bestimmten Zellpopulation durch die Kombination einer schnellen Immunomarkierung Verfahren mit Laser Mikrodissektion zu isolieren.

RNA-Isolierung aus zellspezifische Subpopulationen Mit Laser-Mikrodissektion In Verbindung mit Rapid-Immunmarkierung

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die lasergestützte Mikrodissektion spezifischer Pflanzenzelltypen für die transkriptionelle Profilerstellung. Während das Protokoll für verschiedene Spezies und Zelltypen geeignet ist, liegt der Schwerpunkt bei der Kreuzblütlergattung Boechera auf schwer zugänglichen Zellen der weiblichen Keimbahn, die für die sexuelle und apomiktische Fortpflanzung wichtig sind.

Lasergestützte Mikrodissektion (LAM) als Werkzeug für die Transkriptionsprofilierung einzelner Zelltypen

Das Ziel dieses Protokolls ist, hoher Integrität RNA-Proben von enterischen Ganglien isoliert von fixierten, frisch reseziert menschlichen Darmgewebe mit Laser Capture Microdissection (LCM) zu erhalten. Dieses Protokoll beinhaltet Probenvorbereitung Blitz eingefroren menschlichen Darmgewebe, Kryoschneiden, ethanolische Färbung und Dehydrierung, LCM, und RNA-Extraktion.

Optimierung der Capture-Laser Mikrodissektion für die Isolierung der enterischen Ganglien aus menschlichem Gewebe Tiefkühlfrische

Lasermikrodissektion (LMD) ist eine empfindliche und hochreproduzierbare Technik, die verwendet werden kann, um Wege aufzudecken, die Gliomheterogenität und Invasion vermitteln. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll zur Isolierung diskreter Bereiche aus Gliomgewebe mittels Laser LMD, gefolgt von transkriptomischer Analyse.

Lasercapture Mikrodissektion von Glioma Subregionen für räumliche und molekulare Charakterisierung der intratumoralen Heterogenität, Oncostreams und Invasion

Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatz-Workflow für die künstliche Intelligenz-gesteuerte Segmentierung von pathologiebestätigten Regionen von Interesse aus gefärbten, dünnen Gewebeschnittbildern zur Anreicherung von histologieaufgelösten Zellpopulationen mittels Laser-Mikrodissektion. Diese Strategie beinhaltet einen neuartigen Algorithmus, der die Übertragung von Demarkationen, die Zellpopulationen von Interesse bezeichnen, direkt auf Lasermikroskope ermöglicht.

Industrialisierte, von künstlicher Intelligenz gesteuerte Laser-Mikrodissektion zur mikroskaligen proteomischen Analyse der Tumormikroumgebung

Lernen Sie die Laser-Capture-Mikrodissektion zur Isolierung von Zellen aus oralen submukösen Fibroseproben für Multi-Omics-Analysen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung maligner Transformationsmechanismen in formalinfixiertem Gewebe.

Isolierung von Zellen mit morphologischen und räumlichen Informationen aus oralen submukösen Fibroseproben mittels Laser-Capture-Mikrodissektion (Video) | JoVE Journal

Isolierung von Zellen mit morphologischen und räumlichen Informationen aus oralen submukösen Fibroseproben mittels Laser-Capture-Mikrodissektion

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