Name: Amplitudenmodulierte Elektrodeformation zur Bewertung der mechanischen Ermüdung biologischer Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Lernen Sie die amplitudenmodulierte Elektrodeformation zur Bewertung der mechanischen Ermüdung menschlicher Erythrozyten. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Veränderungen der Zelldeformierbarkeit unter zyklischer Belastung.

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Diese Forschung wurde von NSF/CMMI Mechanobiology of Hemoglobin-Based Artificial Oxygen Carriers (#1941655) und NSF/CMMI Dynamic and Fatigue Analysis of Healthy and Diseased Red Blood Cells (#1635312) finanziert.

Deidentifiziertes menschliches Vollblut wurde kommerziell gewonnen. Die Arbeit mit den Blutproben wurde in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 unter Verwendung von Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Biosafety Committee an der Florida Atlantic University genehmigt wurden.
1. Vorbereitung des mikrofluidischen Geräts
<ol><li>Klebe den SU-8 Master-Siliziumwafer für das mikrofluidische Kanaldesign auf der Innenseite einer 14 cm großen Petrischale aus Kunststoff ab und reinige ihn mit N2 Gas.</li>
	<li>60 g Polydimethylsiloxan (PDMS) Base und 6 g PDMS-Härter in einen Pappbecher wiegen. Mischen Sie die beiden Teile mit einem Holzspatel, bis die Mischung eine trübe weiße Farbe hat.</li>
	<li>Gießen Sie die PDMS-Mischung in die Kunststoff-Petrischale, in der sich der Siliziumwafer befindet. Stellen Sie die Petrischale in einen Vakuum-Exsikkator mit einem 3-Wege-Absperrhahn. Drehen Sie das Ventil des Absperrhahns, um das Vakuum mit der Exsikkatorkammer zu verbinden und Luftblasen aus dem PDMS zu entfernen.</li>
	<li>Führen Sie wieder Luft in die Exsikkatorkammer ein, indem Sie das Absperrventil einstellen, um die Exsikkatorkammer in ca. 5-Minuten-Zyklen mit der Umgebung zu verbinden. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Luftblasen aus den Merkmalen der Kanäle entfernt sind.</li>
	<li>Die Petrischale für 4 h bei 70 °C in den Ofen stellen. Nach Ablauf der Zeit die Petrischale herausnehmen, auf Raumtemperatur abkühlen lassen und auf eine Schneidematte legen.</li>
	<li>Schneiden Sie mit einem Skalpell den Teil des PDMS über dem Siliziumwafer aus. Legen Sie das ausgeschnittene PDMS zwischen die beiden Blätter der Laborfolie. Der Spalt, der zwischen dem Einzug des Mikrokanals und der halbtransparenten Folie gebildet wird, erleichtert die Identifizierung der Position des mikrofluidischen Kanals sowie seines jeweiligen Ein- und Auslasses.</li>
	<li>Schneiden Sie mit einer Rasierklinge einen einzelnen Kanal aus dem großen PDMS heraus. Stanzen Sie ein 3 mm großes Einlassloch und ein 1,5 mm großes Auslassloch mit Biopsiestanzen entsprechend den beiden Größen (Abbildung 1A).</li>
	<li>Legen Sie den gelochten Kanal mit der Kanalseite nach oben auf einen sauberen Objektträger. Platzieren Sie ein 20 mm x 15 mm großes Glassubstrat mit interdigitierten Dünnschichtelektroden aus Indiumzinnoxid (ITO) auf demselben Objektträger mit den Elektroden nach oben.</li>
	<li>Legen Sie den Objektträger mit PDMS und Substrat vorsichtig in einen Plasmareiniger. Schließen Sie das Gasventil, schalten Sie den Pumpenschalter ein und warten Sie 2 Minuten, um einen Sensorwert von 600 - 800 mTorr zu erhalten.</li>
	<li>Schalten Sie den Netzschalter ein und warten Sie 30 Sekunden. Drehen Sie den HF-Einschaltknopf von niedrig auf hoch und warten Sie 1 Minute.</li>
	<li>Kehren Sie dann die Sequenz um, indem Sie den HF-Knopf auf Low, den Netzschalter auf OFF, den Pumpenschalter auf OFF drehen und das Gasventil öffnen.</li>
	<li>Unmittelbar nach dem Öffnen der Kammer des Plasmareinigers wird das PDMS angehoben und gedreht, so dass die Kanalseite nach unten zeigt (180°). Platzieren Sie den Kanal auf der Oberseite des ITO-Substrats. Der Klebeprozess hat begonnen.</li>
	<li>Drücken Sie mit einer Pinzette etwa 3 s lang vorsichtig auf die Ecken des PDMS. Vermeiden Sie es, auf den Kanal selbst zu drücken. HINWEIS: Der Verklebungsprozess erfolgt spontan bei physischem Kontakt zwischen den beiden behandelten Oberflächen.</li>
	<li>Geben Sie das Priming-Medium in eine 1-ml-Spritze mit einer 23-G-Nadel. Befeuchten Sie den Kanal vorsichtig, indem Sie die Nadel gerade in den Einlassschacht einführen und dann das Medium freilassen. Arbeiten Sie langsam. Führen Sie keine Luftblasen ein. Mindestens 3 Minuten inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie das Primärmedium mit einer 10-μl-Pipettenspitze. Waschen Sie den Kanal 3 Mal mit DEP-Medium, indem Sie das DEP-Medium in den Kanal einführen. Halten Sie den Kanal immer feucht.</li>
</ol>2. Prüfvorrichtung
HINWEIS: Die Prüfvorrichtung wird mit einer 3D-CAD-Software entworfen und besteht aus einem Basisgehäuse und einem Oberteil (Abbildung 1B). Anschließend wird es mit einer 3-Achsen-CNC-Fräsmaschine mit einer Standardtoleranzgrenze von etwa ± 0,005-Zoll-Abmessung der Prüfvorrichtung mit einem elektronischen Messschieber (nicht dargestellt) überprüft. Die Sterilität der Vorrichtung ist für die biomechanischen In-vitro-Tests nicht erforderlich.
<ol><li>Löten Sie Drähte in die Lötkelchenden von zwei Sätzen von Federkolbenverbindern vor.</li>
	<li>Setzen Sie die Federkolbenverbinder in die obere Einheit ein und schaffen Sie eine dauerhafte Verbindung, indem Sie einen Tropfen Epoxidkleber hinzufügen.</li>
</ol>3. Herstellung des Arbeitspuffers für die Elektroverformung
<ol><li>Zur Herstellung des DEP-Mediums werden 12,75 g Saccharose und 0,45 g Dextrose mit einer Waage abgewogen.</li>
	<li>Lösen Sie beide Pulver in einem einzigen Behälter mit 150 ml deionisiertem Wasser (DI) und 3,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf.</li>
	<li>Messen Sie die Leitfähigkeit mit einem Leitfähigkeitstester im unteren Bereich und stellen Sie sicher, dass sie 0,04 S/m beträgt (Abbildung 2). HINWEIS: Es kann ein anderer Leitfähigkeitswert verwendet werden, der das Vorzeichen und die Größe der resultierenden DEP-Kraft11 ändern kann. Die Elektroverformung erfordert jedoch eine positive DEP-Kraft.</li>
	<li>Bestätigen Sie mit einem Osmometer, dass die Osmolarität innerhalb des normalen Bereichs des Blutplasmas liegt, 275 bis 295 mOsm/kg Wasser (Abbildung 3). Bei 4 °C lagern. Das DEP-Medium ist nun vorbereitet.</li>
	<li>In einem 15-ml-Röhrchen werden 0,5 g Rinderserumalbumin (BSA) in 10 ml des DEP-Mediums gelöst. Gründlich mischen. Das Primärmedium des Gerätes ist nun vorbereitet.</li>
</ol>4. Herstellung der Zellsuspension
<ol><li>Waschen Sie 20 μl Vollblut, indem Sie das Blut mit 1 ml PBS bei 268 x g für 3 Minuten zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Erythrozyten in 1 ml PBS. Zum Mischen vorsichtig pipettieren. Waschen Sie die Erythrozyten 3 Minuten lang bei 268 x g und entsorgen Sie den Überstand.</li>
	<li>Extrahieren Sie 5 μl Erythrozytenpellet mit einer 10-μl-Mikropipettenspitze und dosieren Sie es vollständig in 1 ml des DEP-Mediums. Waschen Sie die Zellen, indem Sie sie 3 Minuten lang bei 268 x g zentrifugieren.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Erythrozyten in 1 ml DEP-Medium. Zum Mischen vorsichtig pipettieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Erythrozyten 3 Minuten lang bei 268 x g und entsorgen Sie den Überstand. Pipettieren Sie 2 μl Erythrozytenpellet in 500 μl DEP-Medium. Die Zellsuspension wird nun mit einer Konzentration im Bereich von 62 - 104 Zellen/μL12 hergestellt, die mit einem Standard-Zellzählobjektträger bestätigt werden kann.</li>
</ol>5. Elektroverformungsaufbau und Ermüdungsprüfung
<ol><li>Platzieren Sie das mikrofluidische Gerät im unteren Teil der Testvorrichtung. Richten Sie den oberen Teil der Halterung am Gerät aus und montieren Sie die beiden Teile mit zwei Sätzen Nylonschrauben und Muttern (Abbildung 4).</li>
	<li>Platzieren Sie die Prüfvorrichtung auf dem Mikroskoptisch. Lokalisieren Sie einen gewünschten Elektrodensatz unter dem Mikroskop.</li>
	<li>Verbinden Sie das entsprechende Elektrodendrahtpaar, das zum platzierten Elektrodensatz passt, mit der Ausgangsklemme des Funktionsgenerators (Abbildung 4).</li>
	<li>Entfernen Sie 5 μl des DEP-Mediums aus dem 3-mm-Einlass des mikrofluidischen Kanals. Laden Sie langsam 5 μl der Zellsuspension mit einer 10-μl-Pipettenspitze in den Einlass.</li>
	<li>Lassen Sie die Zellen 1 Minute lang ruhen. Falls erforderlich, fügen Sie dem Einlass ein zusätzliches DEP-Medium hinzu, um die Zellen in den Kanal zu drücken.</li>
	<li>Beobachten Sie den Kanal unter 20-facher Vergrößerung. Verwenden Sie einen 414/46-nm-Bandpassfilter, um den Kontrast der Abbildung zu verbessern.</li>
	<li>Drücken Sie die Sinustaste und definieren Sie eine Sinuswelle mit einerRMS-Amplitude von 2 V bei einer Frequenz von 3 MHz. Drücken Sie die Mod-Taste , um die Modulation zu aktivieren. Ändern Sie den Wellenmodus in ASK, indem Sie die Option Typ drücken.</li>
	<li>Stellen Sie die Modulationsfrequenz auf 250 mHz ein, was einer Lade- und Entladezeit von 4 s entspricht (Abbildung 5A). Schalten Sie den Ausgang des Funktionsgenerators ein.</li>
	<li>Nehmen Sie alle 10 Minuten ein 1-minütiges Video mit 30 Bildern pro Sekunde (fps) auf.</li>
</ol>6. Charakterisierung der Erythrozytenverformung
<ol><li>Öffnen Sie mit einer Videobearbeitungsanwendung .avi, die im vorherigen Schritt aufgenommen wurden, indem Sie Strg+O drücken. Verwenden Sie die Zeitachse, um einen gewünschten Frame auszuwählen, und legen Sie die Start- und Endframes der Auswahl so fest, dass sie identisch sind, indem Sie die Home-Taste und dann die Endtaste auf der Tastatur drücken.</li>
	<li>Exportieren Sie den Bildrahmen. Wählen Sie das Ausgabeformat JPEG aus und drücken Sie OK.</li>
	<li>Öffnen Sie die Anwendung ImageJ und laden Sie die im vorherigen Schritt gespeicherten Bilder. Beginnen Sie mit dem Festlegen der erforderlichen Messungen, indem Sie auf Analysieren > Maße festlegen drücken und sicherstellen, dass die Kontrollkästchen für Fläche, Umfang und Ellipse anpassen aktiviert sind. Drücken Sie OK.</li>
	<li>Konvertieren Sie als Nächstes das Bild in Graustufen, indem Sie Bild > Typ > 8-Bit auswählen.</li>
	<li>Konvertieren Sie das Bild dann mit Image > Adjust > Thresholding in eine Binärdatei. Passen Sie im Dialogfeld "Schwellenwert" die beiden Schieberegler nach Bedarf an. Klicken Sie auf Übernehmen , und schließen Sie dann das Dialogfeld Schwellenwert.</li>
	<li>Wählen Sie Analyze > Tools > ROI Manager aus. Aktivieren Sie im ROI-Manager das Kontrollkästchen "Alle anzeigen". Schließen Sie dieses Kästchen nicht.</li>
	<li>Wählen Sie das Zauberstab-Werkzeug (Nachzeichnen) aus, wählen Sie eine entsprechende Zelle im Bild aus und drücken Sie T auf der Tastatur. Die ausgewählte Zelle wird nummeriert. Eine neue Zelle kann erneut ausgewählt werden. Wählen Sie alle zutreffenden Zellen aus, die gemessen werden sollen. Die anwendbaren Zellen werden als diejenigen identifiziert, die von anderen Zellen isoliert sind. Die Anzahl dieser Zellen kann zwischen 50 und 200 in einem einzigen Sichtfeld liegen.</li>
	<li>Kehren Sie zum Feld ROI-Manager zurück, und klicken Sie auf Messen. Dadurch wird das Feld Ergebnisse geöffnet. Spalten mit den Bezeichnungen "Haupt" und "Neben" geben die Längen der angepassten Haupt- und Nebenachsen der Ellipse (in Pixeln) an. Wählen Sie Datei > Speichern unter , um die Messungen als CSV-formatierte Datei zu exportieren.</li>
	<li>Berechnen Sie mit einer geeigneten Computeranalysesoftware den Quotienten aus Major und Minor.</li>
</ol>

Mechanische Ermüdungsprüfung von Erythrozyten durch amplitudenmodulierte Elektrodeformation

<ol><li>Kim, Y., Kim, K., Park, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+techniques+for+red+blood+cell+deformability%3A+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cell%E2%80%94An+Overview+of+Studies+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances.</a> Blood Cell—An Overview of Studies in Hematology. 10, 167-194 (2012).</li>
<li>Safeukui, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+sensing+and+sequestration+of+spherocytic+erythrocytes+by+the+human+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%2C+The+Journal+of+the+American+Society+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of sensing and sequestration of spherocytic erythrocytes by the human spleen.</a> Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 120 (2), 424-430 (2012).</li>
<li>Naghedi-Baghdar, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+diet+on+blood+viscosity+in+healthy+humans%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Electronic+physician%22%5BJournal%5D)">Effect of diet on blood viscosity in healthy humans: a systematic review.</a> Electronic physician. 10 (3), 6563(2018).</li>
<li>Franco, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+red+cell+lifespan+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+Medicine+and+Hemotherapy%22%5BJournal%5D)">Measurement of red cell lifespan and aging.</a> Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 302-307 (2012).</li>
<li>Matthews, K., Lamoureux, E. S., Myrand-Lapierre, M. -E., Duffy, S. P., Ma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+for+measuring+red+blood+cell+deformability%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Technologies for measuring red blood cell deformability.</a> Lab on a Chip. 22, 1254-1274 (2022).</li>
<li>Kim, J., Lee, H., Shin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+measurement+of+red+blood+cell+deformability%3A+A+brief+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in the measurement of red blood cell deformability: A brief review.</a> Journal of Cellular Biotechnology. 1 (1), 63-79 (2015).</li>
<li>Varga, A., Matrai, A. A., Barath, B., Deak, A., Horvath, L., Nemeth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+diversity+of+osmotic+gradient+deformability+of+red+blood+cells+in+human+and+seven+vertebrate+animal+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Interspecies diversity of osmotic gradient deformability of red blood cells in human and seven vertebrate animal species.</a> Cells. 11 (8), 1351(2022).</li>
<li>Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. -H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deformation+measurement+of+individual+cells+in+large+populations+using+a+single-cell+microchamber+array+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip.</a> Applied Physics Letters. 100 (17), 173702(2012).</li>
<li>Toward digital transmitters with amplitude shift keying and quadrature amplitude modulators implementation examples. Al Safi, A., Bazuin, B. 2017 IEEE 7th Annual Computing and Communication Workshop and Conference (CCWC), , 1-7 (2017).</li>
<li>Zhang, J., Chen, K., Fan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cell+isolation+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cell isolation and analysis.</a> Advances in Clinical Chemistry. 75, 1-31 (2016).</li>
<li>Cottet, J., Fabregue, O., Berger, C., Buret, F., Renaud, P., Frénéa-Robin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyDEP%3A+a+new+computational+tool+for+dielectric+modeling+of+particles+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">MyDEP: a new computational tool for dielectric modeling of particles and cells.</a> Biophysical Journal. 116 (1), 12-18 (2019).</li>
<li>Haywood, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+full+blood+count%5BTitle%5D)+AND+%22InnovAiT%22%5BJournal%5D)">Interpreting the full blood count.</a> InnovAiT. 15 (3), 131-137 (2022).</li>
<li>Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Suresh, S., Du, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+fatigue+of+human+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mechanical fatigue of human red blood cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (40), 19828-19834 (2019).</li>
<li>Gharaibeh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+slowly+adhering+cell+fraction+containing+stem+cells+from+murine+skeletal+muscle+by+the+preplate+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique.</a> Nature Protocols. 3 (9), 1501-1509 (2008).</li>
<li>Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Du, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assay+for+single-cell+characterization+of+impaired+deformability+in+red+blood+cells+under+recurrent+episodes+of+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">In vitro assay for single-cell characterization of impaired deformability in red blood cells under recurrent episodes of hypoxia.</a> Lab on a Chip. 21 (18), 3458-3470 (2021).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die ASK OOK-Modulation einer DEP-Kraft-induzierenden Sinuswelle kann verwendet werden, um die mechanische Ermüdung von Erythrozyten über einen langen Zeitraum zu testen. In diesem Protokoll haben wir die In-vitro-Ermüdungstests auf 1 Stunde begrenzt, um mögliche nachteilige metabolische Auswirkungen auf die Verformbarkeit der Zellen zu verhindern. Umfassende Ermüdungsprüfbedingungen können mit der ASK-modulierten Elektroverformungstechnik programmiert werden. Parameter wie Belastungsfrequenz, Amplitude und Belastungsrate...

Rote Blutkörperchen (RBCs) sind die am stärksten verformbaren Zellen im menschlichen Körper1. Ihre Verformbarkeit steht in direktem Zusammenhang mit ihrer sauerstofftransportierenden Funktionalität. Es wurde festgestellt, dass eine reduzierte Verformbarkeit von Erythrozyten mit der Pathogenese verschiedener Erythrozytenerkrankungen korreliert2. Verformbarkeitsmessungen haben uns zu einem besseren Verständnis von Erythrozyten-assoziierten Erkrankungen geführt3. Die normale Lebensdauer von Erythrozyten kann zwischen 70 und 140 Tagenvariieren 4. Daher ist es wichtig zu messen, wie ihre Verformbarkeit mit dem Alterungsprozess abnimmt, z. B. ihr Ermüdungsverhalten aufgrund zyklischer Scherspannungen3.
Die Messung der Verformbarkeit von Erythrozyten bei hohem Durchsatz ist aufgrund der Piconewton-Skalenkräfte (~10-12 N), die auf die einzelnen Zellen ausgeübt werden, eine Herausforderung. In den letzten zehn Jahren wurden viele Technologien entwickelt, um die Verformbarkeit von Zellen zu messen5. Deformationsmessungen von Erythrozyten auf Einzelzellebene können durch Pipettenaspiration und optische Pinzette durchgeführt werden, während Massenanalysen durch osmotische Gradientenektazytometrie durchgeführt werden. Ektazytometrische Analysen liefern eine Fülle von Daten, die die Möglichkeit bieten, Bluterkrankungen zu diagnostizieren 6,7. Die Verformbarkeit von Erythrozyten kann auch mit Hilfe der viskoelastischen Theorie mittels Kolloidsonden-Rasterkraftmikroskopie analysiert werden. Bei dieser Methode wird eine computergestützte Analyse angewendet, um den Elastizitätsmodul von Erythrozyten zu schätzen, wobei sowohl zeitabhängige als auch stationäre Antworten berücksichtigt werden. Die Verformbarkeit einzelner Erythrozyten kann mit der Einzelzell-Mikrokammer-Array-Methode gemessen werden. Diese Methode analysiert jede Zelle durch die Membran und zytosolische Fluoreszenzmarker, um Informationen über die Verformbarkeit von Erythrozyten und die Verteilung zellulärer Eigenschaften in komplexen Erythrozytenpopulationen zu erhalten, um hämatologische Erkrankungen zu erkennen8.
Ermüdung ist ein Schlüsselfaktor für die Verschlechterung der Eigenschaften von technischen Materialien und Biomaterialien. Die Ermüdungsprüfung ermöglicht eine quantitative Analyse der Integrität und Langlebigkeit einer Struktur, die einer zyklischen Belastung ausgesetzt ist. Die Analyse der Ermüdung in biologischen Zellen wurde lange Zeit durch das Fehlen einer allgemeinen, leicht anwendbaren, quantitativen Methode für den hohen Durchsatz und die Implementierung zyklischer Deformation in Zellmembranen behindert. Dies ist durch den Einsatz von elektrischen Signalmodulations- und Elektrodeformationstechniken möglich, die in einer mikrofluidischen Umgebung implementiert sind. Die ASK-Technik (Amplitude Shift Keying) als digitale Modulation wird in diesem Artikel durch die On-Off-Keying-Modulation (OOK) angewendet. Das Konzept der Kodierung bezieht sich auf die Übertragung digitaler Signale über den Kanal, der ein Sinuswellenträgersignal benötigt, um 9zu funktionieren. Die Ein- und Ausschaltzeiten können gleich eingestellt werden. Unter EIN-Tasten treten Erythrozyten in einen verformten Zustand über, während sie einer externen Elektroformkraft (Fdep)10 ausgesetzt sind, die durch das ungleichmäßige elektrische Feld erzeugt wird. Unter OFF-Keying befinden sich RBCs in ihrem entspannten Zustand. Wir beobachten die Ermüdung von Erythrozyten, d.h. eine fortschreitende Verschlechterung ihrer Dehnungsfähigkeit mit zunehmender Belastungszyklen. Der ermüdungsbedingte Verlust der Verformbarkeit von Erythrozyten kann Einblicke in die akkumulierte Membranschädigung während der Blutzirkulation geben, so dass wir die Zusammenhänge zwischen Zellermüdung und Krankheitszuständen weiter untersuchen können.
Hier stellen wir Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Verfügung, wie die Ermüdungsprüfung von Erythrozyten in einem mikrofluidischen Gerät über ASK-modulierte Elektroverformung und die Systemeinstellungen wie mikrofluidische Vorrichtung, mechanische Belastung und mikroskopische Bildgebung zur Charakterisierung der allmählichen Degradation der mechanischen Verformbarkeit von Erythrozyten implementiert wird.

<table><tbody><tr><td>Waage</td><td>ViBRA</td><td>HT-224R</td><td></td></tr><tr><td>Bandpassfilter</td><td>BRIGHTLINE</td><td>414/46 BrightLine HC</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Einwegspritzen mit Luer-Lok&trade; Spitzen, 1 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-30</td><td></td></tr><tr><td>Biopsie-Stanzen mit Kolbensystem, 1,5 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-403</td><td></td></tr><tr><td>Biopsie-Stanzen mit Kolben-System, 3 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-407 1,5</td><td>mm und 3 mm</td></tr> Durchmesser <tr><td>stumpfe Nadel, 23-Gauge-BSTEAN</td><td></td><td>X001308N97</td><td></td></tr><tr><td>Bovin Serumalbumin</td><td>RMBIO</td><td>BSA-BSH</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>SCILOGEX</td><td>911015119999</td><td></td></tr><tr><td>konisches Röhrchen, 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher</td><td>Scientific MDX01455</td><td>MilliporeSigma&trade;</td></tr><tr><td>EC Niederleitfähigkeitsmessgerät</td><td>ecoTestr</td><td>358/03</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; &nbsp; Schnappverschluss MikrozentrifugeRöhrchen</td><td>www.eppendorf.com</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft&nbsp;</td><td></td><td>Graph Plotting</td></tr><tr><td>Function Generator</td><td>SIGLENT</td><td>SDG830</td><td></td></tr><tr><td>Glas/ITO-Elektrodensubstrat</td><td>OSSILA</td><td>S161</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>OLYMPUS</td><td>IX81 - SN9E07015</td><td></td></tr><tr><td>Laborofen</td><td>QUINCY LAB (QL)</td><td>MODEL 30GCE</td><td>Digitales Modell</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td></td><td>Graph</td></tr><tr><td>Plotting Mikroosmometer - Modell 3300</td><td>Advanced Instruments Inc.</td><td>S/N: 03050397P</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm Labor-Verpackungsfolie</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>FALCON</td><td>SKU=351006</td><td>ICSI/Biopsieschale 50*9 mm</td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>LONZA</td><td>04-479Q</td><td></td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Harrick Plasma PDCOOL</td><td>NC0301989</td><td></td></tr><tr><td>Solidworks</td><td>Dassault Systèmes</td><td></td><td>CAD-Software</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-188-2419</td><td></td></tr><tr><td>Vakuum-Exsikkator</td><td>SPBEL-ART</td><td>F42400-2121</td><td></td></tr><tr><td>Holzspatel</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0304136</td><td>Zungenspatel Holz NS 6"</td></tr></tbody></table>

amplitudenmodulierte elektrodeformation zur bewertung der mechanischen ermüdung biologischer zellen

Amplitude-Modulated Electrodeformation to Evaluate Mechanical Fatigue of Biological Cells

Rote Blutkörperchen (RBCs) sind für ihre bemerkenswerte Verformbarkeit bekannt. Sie erleiden beim Durchlaufen der Mikrozirkulation immer wieder erhebliche Verformungen. Bestehende Techniken zur Messung der Zellverformbarkeit können nicht ohne weiteres zur Messung der Ermüdung, d. h. des allmählichen Abbaus von Zellmembranen, der durch zyklische Belastungen verursacht wird, verwendet werden. Wir stellen ein Protokoll vor, um die mechanische Degradation in Erythrozyten durch zyklische Scherspannungen unter Verwendung der auf Amplitudenverschiebung (ASK) basierenden elektrodischen Verformung in einem mikrofluidischen Kanal zu bewerten. Kurz gesagt, werden die interdigitalisierten Elektroden im mikrofluidischen Kanal mit einem Niederspannungs-Wechselstrom bei Radiofrequenzen unter Verwendung eines Signalgenerators angeregt. Erythrozyten in Suspension reagieren auf das elektrische Feld und weisen eine positive Dielektrophorese (DEP) auf, die Zellen an die Elektrodenränder bewegt. Die Zellen werden dann aufgrund der elektrischen Kräfte, die auf die beiden Zellhälften ausgeübt werden, gedehnt, was zu einer einachsigen Dehnung führt, die als Elektroverformung bezeichnet wird. Die Höhe der Schubspannung und die daraus resultierende Verformung können einfach durch Änderung der Amplitude der Anregungswelle eingestellt werden. Dies ermöglicht Quantifizierungen der nichtlinearen Verformbarkeit von Erythrozyten als Reaktion auf kleine und große Verformungen bei hohem Durchsatz. Die Modifikation der Anregungswelle mit der ASK-Strategie induziert eine zyklische Elektrodeformation mit programmierbaren Belastungsraten und Frequenzen. Dies bietet eine bequeme Möglichkeit zur Charakterisierung der Erythrozytenermüdung. Unser ASK-modulierter Elektrodeformationsansatz ermöglicht erstmals eine direkte Messung der Erythrozytenermüdung durch zyklische Belastungen. Es kann als Werkzeug für allgemeine biomechanische Tests, für Analysen der Zellverformbarkeit und -ermüdung bei anderen Zelltypen und Krankheitszuständen verwendet werden und kann auch mit Strategien zur Kontrolle der Mikroumgebung von Zellen kombiniert werden, wie z. B. Sauerstoffspannung und biologische und chemische Hinweise.

Wenn die Zellsuspension in den mikrofluidischen Kanal geladen wurde, wurde eine relativ gleichmäßige Verteilung der Zellen beobachtet. Bei der Signalausgabe (z. B. einer einfachen Sinuswelle oder einer On-Keying-Phase von ASK) des Funktionsgenerators erzeugten die interdigitalen Dünnschichtelektroden ein ungleichmäßiges elektrisches Wechselstromfeld. Die suspendierten Zellen reagierten spontan auf diese elektrische Anregung und zeigten ein positives DEP-Verhalten, d.h. sie bewegten sich zu den Rändern von Elektroden mit ...

Hier wird ein Protokoll für mechanische Ermüdungstests bei menschlichen roten Blutkörperchen unter Verwendung eines amplitudenmodulierten Elektrodeformationsansatzes vorgestellt. Dieser allgemeine Ansatz kann verwendet werden, um die systematischen Veränderungen der morphologischen und biomechanischen Eigenschaften biologischer Zellen in einer Suspension aus zyklischer Verformung zu messen.

Amplitudenmodulierte Elektrodeformation zur Bewertung der mechanischen Ermüdung biologischer Zellen

Red blood cells (RBCs) are known for their remarkable deformability. They repeatedly undergo considerable deformation when passing through the ...

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Untersuchung der Zellbiomechanik zirkulierender Zellen, wie z.B. menschlicher roter Blutkörperchen. Wir nutzen Elektrokinetik, Mikrofluidik und Materialwissenschaften, um die mechanischen Ursprünge von Schäden in Zellmembranen sowie die Mechanismen zu verstehen, die der verkürzten Lebensdauer von Blutzellen bei bestimmten Krankheiten zugrunde liegen. Die Ermüdungsuntersuchung biologischer Zellen ist eine Herausforderung.Es erfordert das Aufbringen zyklischer Lasten auf Zellmembranen und die Verfolgung der Verformung in einzelnen Zellen. Mit Hilfe des Amplitudenblattschlüssels für ASK zur Modulation des Elektrodenverformungsverhaltens von roten Blutkörperchen konnten wir quantifizieren, wie sich die Zellverformbarkeit mit den Belastungszyklen ändert. Wir haben zum ersten Mal gezeigt, dass die Membranen der roten Blutkörperchen allein durch zyklisches Dehnen abgebaut werden können.Unser Protokoll nutzt die Dielektrophorese, um Zellen zur Messung der Elektrodenverformung an die Elektrodenränder zu bewegen. Es erfordert keine Stabilisierungstechnik und kann direkt zur Zellsuspension verwendet werden. Die Verwendung von interdigitalen Mikroelektroden ermöglicht es uns, Dutzende von Zellen in einem einzigen Sichtfeld zu messen.

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Dieses Papier soll den Leser in den Betrieb eines integrierten atomic force-optische Bildgebung Mikroskop für die mechanische Stimulation von lebenden Zellen in Kultur zu unterrichten. Eine Schritt-für-Schritt-Protokoll vorgestellt. Eine repräsentative Datenmenge, die Live-Zell-Antwort auf mechanische Stimulation zeigt vorgestellt.

Live Cell Reaktion auf mechanische Stimulation von Integrated Optical und Atomic Force Microscopy Studium

Eine zuverlässige Methode, um der äußeren Haarzellen (OHC) beweglich Reaktionen, einschließlich Elektromotilität, langsame Motilität und Biegen, untersuchen beschrieben. OHC Motilität wird durch die Stimulation mit einem externen elektrischen Wechselfeld, und die Methode nutzt die Highspeed-Aufnahme, LED-Beleuchtung, und die letzte Generation Bildanalyse-Software.

Die Untersuchung der äußeren Haarzellen Motilität mit einer Kombination von externen elektrischen Wechselfeld Stimulation und High-Speed-Image Analysis

Dieses Papier zeigt ein Protokoll, um die mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mittels Mikroindentation mit einem Atomic Force Microscope (AFM) zu charakterisieren.

Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Dieses Protokoll Bewertungen Elektro Zell-Substrat-Impedance Sensing, eine Methode zur Quantifizierung der Zellhaftung, Proliferation, Motilität und zellulären Antworten auf pharmakologische und toxische Stimuli erfassen und analysieren die Impedanzspektrum von adhärenten Zellen. Nachweis endothelialer Permeabilität und Bewertung der Zell-Zell-und Zell-Substrat-Kontakte sind hervorgehoben.

Elektro-Zell-Substrat-Impedance Sensing zur Quantifizierung der endothelialen Proliferation, Barrierefunktion und Beweglichkeit

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Ausbildung einer Zellpopulation, die mit elektrischen und mechanischen Reizen emuliert kardiale Physiologie. Diese elektromechanische Stimulation erhöht das Cardiomyogenic Potenzial der behandelten Zellen und ist eine vielversprechende Strategie für weitere Zelltherapie, Krankheit Modellierung und Drogen-Screening.

Gleichzeitige elektrische und mechanische Stimulation, Cells Cardiomyogenic Potenzial zu steigern

Wir präsentieren ein Protokoll zur Bewertung der elektromechanischen Wirkungen der GtACR1-Aktivierung in Kaninchen-Kardiomyozyten. Wir bieten detaillierte Informationen über Zellisolation, Kultivierung und adenovirale Transduktion sowie über funktionelle Experimente mit den Patch-Clamp- und Carbonfaser-Techniken.

Elektromechanische Bewertung der optogenetisch modulierten Kardiomyozytenaktivität

Dieses Protokoll zielt darauf ab, AFM-Messungen an Hunderten von mikrobiellen Zellen zu automatisieren. Zuerst werden Mikroben in PDMS-Stempelmikrostrukturen immobilisiert und dann werden kraftspektroskopische Messungen automatisch an Hunderten von immobilisierten Zellen durchgeführt.

Automatisierung von Bio-Rasterkraftmikroskop-Messungen an Hunderten von C. albicans-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt den schrittweisen Prozess zum Bau von elektrischen und magnetischen Stimulatoren, die zur Stimulierung biologischer Gewebe verwendet werden. Das Protokoll enthält eine Richtlinie zur Simulation von rechengestützten elektrischen und magnetischen Feldern und zur Herstellung von Stimulatoren.

Elektrische und magnetische Feldgeräte zur Stimulation biologischer Gewebe

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von Arrays von 3D-Mikrogeweben der menschlichen Skelettmuskulatur und minimalinvasiven Downstream-In-situ-Funktionsassays, einschließlich kontraktiler Kraft- und Kalziumhandhabungsanalysen.

Bewertung funktioneller Metriken der Skelettmuskelgesundheit in Mikrobeschwerden der menschlichen Skelettmuskulatur

Hier wird eine Methode zur mechanischen Phänotypisierung einzelner Zellen unter Verwendung einer elektronikbasierten mikrofluidischen Plattform namens Mechano-Node-Pore Sensing (Mechano-NPS) vorgestellt. Diese Plattform hält einen moderaten Durchsatz von 1-10 Zellen / s aufrecht und misst gleichzeitig die elastischen und viskosen biophysikalischen Eigenschaften der Zellen.

Mechano-Node-Pore Sensing: Eine schnelle, markierungsfreie Plattform für viskoelastische Multiparameter-Einzelzellmessungen

Die folgende Studie evaluiert das toxikologische Profil eines ausgewählten metallorganischen Gerüsts unter Verwendung der elektrischen Zellsubstrat-Impedanzmessung (ECIS), einer Echtzeit-Hochdurchsatz-Screening-Technik.

Elektrische Zell-Substrat-Sensorik zur Echtzeit-Bewertung von toxikologischen Profilen metallorganischer Gerüstverbindungen

Lernen Sie die amplitudenmodulierte Elektrodeformation zur Bewertung der mechanischen Ermüdung menschlicher Erythrozyten. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Veränderungen der Zelldeformierbarkeit unter zyklischer Belastung.

Amplitudenmodulierte Elektrodeformation zur Bewertung der mechanischen Ermüdung biologischer Zellen

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