Name: Runde Maus-Spermatiden-Injektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Lernen Sie die runde Spermatiden-Injektion (ROSI) bei Mäusen zur Verbesserung der embryonalen Entwicklungseffizienz. Diese Methode bietet klinische Anwendungspotenziale für Patienten mit nicht-obstruktiver Azoospermie.

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<meta charset="utf8"></head><body>Verfahren zur Injektion von runden Spermatiden an der Maus zur Untersuchung der Embryonalentwicklung

<ol><li>Redgrove, K. A., McLaughlin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+immune+response+in+Chlamydia+trachomatis+infection+of+the+male+genital+tract%3A+A+double-edged+sword%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of the immune response in Chlamydia trachomatis infection of the male genital tract: A double-edged sword.</a> Front Immunol. 5, 534(2014).</li>
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<li>Hirabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+regimens+for+full-term+development+of+rabbit+oocytes+injected+with+round+spermatids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Activation regimens for full-term development of rabbit oocytes injected with round spermatids.</a> Mol Reprod Dev. 76 (6), 573-579 (2009).</li>
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<li>Gross, K. X., Hanson, B. M., Hotaling, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Round+spermatid+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Urol+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Round spermatid injection.</a> Urol Clin North Am. 47 (2), 175-183 (2020).</li>
<li>Hanson, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Round+spermatid+injection+into+human+oocytes%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">Round spermatid injection into human oocytes: a systematic review and meta-analysis.</a> Asian J Androl. 23 (4), 363-369 (2021).</li>
<li>Tekayev, M., Vuruskan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+values+and+advances+in+round+spermatid+injection+%28ROSI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol%22%5BJournal%5D)">Clinical values and advances in round spermatid injection (ROSI).</a> Reprod Biol. 21 (3), 100530(2021).</li>
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<li>Yang, H., Shi, L., Chen, C. D., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+generated+after+round+spermatid+injection+into+haploid+two-cell+blastomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Mice generated after round spermatid injection into haploid two-cell blastomeres.</a> Cell Res. 21 (5), 854-858 (2011).</li>
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<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiomics+sequencing+reveals+the+reprogramming+defects+in+embryos+generated+by+round+spermatid+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiomics sequencing reveals the reprogramming defects in embryos generated by round spermatid injection.</a> Sci Adv. 8, (2022).</li>
<li>Ward, M. A., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracytoplasmic+sperm+injection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Intracytoplasmic sperm injection in mice.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2018 (1), (2018).</li>
<li>Yoshida, N., Perry, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo-actuated+mouse+intracytoplasmic+sperm+injection+%28ICSI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Piezo-actuated mouse intracytoplasmic sperm injection (ICSI).</a> Nat Protoc. 2 (2), 296-304 (2007).</li>
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<li>Kong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+histone+deacetylase+inhibitor+%27Scriptaid%27+on+the+developmental+competence+of+mouse+embryos+generated+through+round+spermatid+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effects of the histone deacetylase inhibitor 'Scriptaid' on the developmental competence of mouse embryos generated through round spermatid injection.</a> Hum Reprod. 32 (1), 76-87 (2017).</li>
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<li>Kimura, Y., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracytoplasmic+sperm+injection+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Intracytoplasmic sperm injection in the mouse.</a> Biol Reprod. 52 (4), 709-720 (1995).</li>
<li>Ogonuki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-speed+congenic+strategy+using+first-wave+male+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A high-speed congenic strategy using first-wave male germ cells.</a> PLoS One. 4 (3), e4943(2009).</li>
<li>Abdelaal, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertility+preservation+for+pediatric+male+cancer+patients%3A+illustrating+contemporary+and+future+options%3B+a+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Androl+Urol%22%5BJournal%5D)">Fertility preservation for pediatric male cancer patients: illustrating contemporary and future options; a case report.</a> Transl Androl Urol. 10 (1), 520-526 (2021).</li>
<li>Eyni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+bioengineering+of+male+germ+stem+cells+to+preserve+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Advanced bioengineering of male germ stem cells to preserve fertility.</a> J Tissue Eng. 12, (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>CaCl22H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C7902&nbsp;</td><td>Vorbereitung der CZB</td></tr><tr><td>Glukose&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G6152&nbsp;</td><td>Vorbereitung der CZB</td></tr><tr><td>HEPES-Na (basisch)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3784&nbsp;</td><td>Vorbereitung der CZB</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Beyotime&nbsp;</td><td>C1025</td><td>FACS</td></tr><tr><td>humanes Choriongonadotropin (HCG)</td><td>Ningbo Second Hormone Company</td><td>HCG</td><td>Ovulation fördernde Medikamente</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td>Entfernung von Granulosazellen um die Eizelle</td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Vorbereitung von CZB</td></tr><tr><td>KH2PO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5655&nbsp;</td><td>Vorbereitung der CZB</td></tr><tr><td>KSOMaa</td><td>Caisson Labs</td><td>IVL04-100ML</td><td>Kalium-simplex-optimiertes Medium, ergänzt mit Aminosäuren</td></tr><tr><td>L-Glutamin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G8540&nbsp;</td><td>Vorbereitung der CZB</td></tr><tr><td>M2</td><td>Sigma</td><td>M7167-50ML</td><td>Betriebsmittel</td></tr><tr><td>MgSO47H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M1880&nbsp;</td><td>Vorbereitung der CZB</td></tr><tr><td>Na2-EDTA2H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E5134&nbsp;</td><td>Vorbereitung der CZB</td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>Vorbereitung von CZB</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761&nbsp;</td><td>Vorbereitung der CZB</td></tr><tr><td>Na-Laktat 60% Sirup d = 1,32 g/L</td><td>Sigma</td><td>L7900&nbsp;</td><td>Vorbereitung der CZB</td></tr><tr><td>Na-pyruvat&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4562&nbsp;</td><td>Vorbereitung der CZB</td></tr><tr><td>Piezo-Bohrspitzen (ICSI)</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>piezoXpert</td><td>Piezoelektrische Membranruptur</td></tr><tr><td>trächtige Stute Serum Gonadotropin (PMSG)</td><td>Ningbo Second Hormone Company</td><td>PMSG</td><td>Ovulation fördernde Medikamente</td></tr><tr><td>PVA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8136</td><td>Vorbereitung von CZB</td></tr></tbody></table>

runde maus-spermatiden-injektion

Mouse Round Spermatid Injection

Wir begannen unsere Untersuchung mit der Untersuchung der Auswirkungen von AOA auf die Entwicklungsfähigkeit von Embryonen. Eine schematische Darstellung des Versuchsaufbaus ist in Abbildung 1A dargestellt. Vor der Spermieninjektion wurden die Eizellen entweder einer AOA (A-ICSI) unterzogen oder blieben unbehandelt (ICSI). Detaillierte Daten zur Embryonalentwicklung sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Ergebnisse zeigten keine signifikanten Unterschiede in der Spaltung, der Blastozyste oder der Geburtenrate zwischen der A-ICSI- und der ICSI-Gruppe (P &gt; 0,05; Abbildung 1B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass AOA mit 10 mM SrCl2 für 20 min das Entwicklungspotenzial der Embryonen nicht beeinflusste.
Zuvor wurde berichtet, dass es keine erkennbaren Unterschiede in der Entwicklungseffizienz von ROSI-Embryonen gab, die entweder durch FACS oder durch direkte visuelle Untersuchung unter einem Mikroskop ausgewählt wurden22. Unsere Experimente verwendeten die FACS-Technologie, um RS zu identifizieren (Abbildungen 2A, B). Unter dem Mikroskop hatten die runden Spermatiden der Maus einen Durchmesser von etwa 10 μm und wiesen in der Mitte eine protrusionsartige Nukleolusstruktur auf (Abbildung 2C). Wir gehen davon aus, dass die Selektion durch FACS genauer ist als die direkte visuelle Untersuchung unter dem Mikroskop. Darüber hinaus unterstützt die Literatur die direkte Erforschung von RS durch morphologische Unterschiede. ROSI-Embryonen wurden mit zwei unterschiedlichen Methoden erzeugt: der A-ROSI-Gruppe, bei der die Eizellen vor der runden Spermatideninjektion einer AOA unterzogen wurden, und der ROSI-A-Gruppe, bei der die Eizellen nach der runden Spermatideninjektion einer AOA unterzogen wurden. Das schematische Diagramm des Versuchsaufbaus ist in Abbildung 1C dargestellt. Bemerkenswert ist, dass keine signifikanten Unterschiede in den Spaltungs- und Blastozystenraten zwischen den Gruppen A-ROSI, ROSI-A und ICSI gefunden wurden (P &gt; 0,05; Abbildung 1D). Die Blastozystenraten der A-ROSI-, ROSI-A- und ICSI-Gruppen waren signifikant höher als die der Aktivierungsgruppe (P &lt; 0,05; Abbildung 1D). Die Geburtenrate der ROSI-Gruppe war jedoch niedriger als die der ICSI-Gruppe, unabhängig davon, ob die Eizellen vor oder nach der Injektion aktiviert wurden (P &lt; 0,05; Abbildung 1D). Wichtig ist, dass die Geburtenrate der A-ROSI-Gruppe etwas höher war als die der ROSI-A-Gruppe (Abbildung 1D). Weitere Einzelheiten zu den Daten zur Embryonalentwicklung sind in Tabelle 1 aufgeführt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65898/65958fig01.jpg"> 
Abbildung 1: ROSI-Embryonen zeigten im Vergleich zu ICSI-Embryonen eine geringere Entwicklungseffizienz. (A) Schematische Darstellung des Versuchsprotokolls zur Bewertung des Effekts der Aktivierung auf die ICSI-Embryonalentwicklung. Blau = Eizellen wurden nicht aktiviert; Gelb = Eizellen wurden aktiviert. (B) Entwicklungseffizienz von Embryonen aus A-ICSI und ICSI. (C) Schematische Darstellung des Versuchsprotokolls zur Erzeugung verschiedener Arten von Embryonen. (D) Entwicklungseffizienz von Embryonen, die von A-ROSI, ROSI-A, A und ICSI abstammen. **, P &lt; 0,01. Abkürzungen: A= Aktivierung E= Embryonaler Tag; ROSI = Runde Spermatiden-Injektion; ICSI = Intrazytoplasmatische Spermieninjektion. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. Der Vergleich der Raten erfolgt mit Hilfe des Chi-Quadrat-Tests. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65898/65958fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65898/65958fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Runde Spermatiden wurden mittels durchflusszytometrischer Sortierung selektiert. (A) Für die Selektion der runden Spermatiden wurde ein durchflusszytometrisches Sortierdiagramm verwendet. (B) Repräsentative Bilder, die die Auswahl runder Spermatiden zeigen. Maßstab: 10 μm. Abkürzungen: FSC = Forward scatter; SSC = seitliche Streuung; 355 ist die Anregungswellenlänge; 460/50 und 670/30 sind zwei Detektionskanäle unter einem Laser mit 355 Wellenlängen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65898/65958fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Gruppen</td>
			<td colspan="3">Entwicklung vor der Implantation</td>
			<td colspan="2">Entwicklung nach der Implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repliziert</td>
			<td>Spaltungsrate (%)</td>
			<td>Blastozystenrate (%)</td>
			<td>2-zellige Embryonen übertragen/ Nr. der Empfänger</td>
			<td>Geburtenrate (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-ICSI</td>
			<td>5</td>
			<td>99.33 (149/150)</td>
			<td>75.17 (112/149)</td>
			<td>49/5</td>
			<td>48.98 (24/49)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-ROSI</td>
			<td>5</td>
			<td>99.33 (149/150)</td>
			<td>73.83 (110/149)</td>
			<td>44/5</td>
			<td>18.18 (8/44) **</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROSI-A</td>
			<td>5</td>
			<td>98.00 (147/150)</td>
			<td>64.63 (95/147)</td>
			<td>45/5</td>
			<td>13.33 (6/45) **</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aktivierung</td>
			<td>5</td>
			<td>100.00 (150/150)</td>
			<td>12.00 (18/150) **</td>
			<td>51/5</td>
			<td>0.00 (0/51) **</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICSI (Englisch)</td>
			<td>5</td>
			<td>98.00 (147/150)</td>
			<td>73.47 (108/147)</td>
			<td>46/5</td>
			<td>52.17 (24/46)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1. Die Entwicklungseffizienz von Embryonen, die aus verschiedenen Gruppen stammen.
Ergänzende Tabelle 1. Der Anteil verschiedener Zellpopulationen, die mittels Durchflusszytometrie sortiert werden. Der P3-Teil besteht aus runden Spermatiden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65898/Supplementary%20Table%201_RE.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Protokoll zeigt Methoden zur Gewinnung von Spermien aus den Hoden der Männchen und dann Besamung weiblichen Mäusen. Dieses Verfahren ist nützlich, wenn die genaue Zeit in entwicklungspsychologischen Studien sowie transgene Arbeit benötigt wird.

Harvesting Sperma und künstliche Besamung von Mice

De-novo-Mutationen in der männlichen Keimbahn können zu nachteiligen gesundheitlichen Folgen in nachfolgenden Generationen beitragen. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Verwendung eines transgenen Nagetiermodells zur Quantifizierung von Mutationen in männlichen Keimzellen, die durch Umwelteinflüsse induziert werden.

Transgenen Nager Assay zur Quantifizierung von männlichen Keimzellmutantenhäufigkeit

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In-vivo-Mikroinjektion und Elektroporation von Maus-Hoden

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Vorbereitung der meiotischen Chromosom erstreckt sich von Maus Spermatozyten

Diese Röhrchen-Squash-Technik soll rasch zytologischen Merkmale entwickeln Maus Spermatozyten unter Beibehaltung der zellulären Integrität zu beurteilen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von allen Stufen der Spermatogenese und neben anderen biochemischen und molekularen biologischen Ansätze zur Erforschung der Maus Meiose leicht umgesetzt werden kann.

Eine Seminiferous Röhrchen-Squash-Technik für die zytologische Analyse der Spermatogenese mit dem Maus-Modell

Dieses Protokoll beschreibt die transilluminationsunterstützte Mikrodissektion von Segmenten von erwachsenen Mausseminiferous Tubuli, die bestimmte Stadien des seminiferen Epithelzyklus darstellen, und Zelltypen darin und anschließende Immunostainierung von Squashpräparaten und intakten Tubulisegmenten.

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Dieser Artikel zielt darauf ab, die Verwendung von parthenogenetischen haploiden embryonalen Stammzellen als Ersatz für Spermien für den Aufbau von halbgeklonten Embryonen zu demonstrieren.

Anwendung von Maus parthenogenetischen Haploid embryonalen Stammzellen als Ersatz für Sperma

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Funktionelle Bewertung von Kinesin-7 CENP-E in Spermatozyten mittels In-vivo-Inhibition , Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie

Die vorgestellte Methode zur Manipulation des Gebärmutterhalses kann bei Mäusen eine Pseudoschwangerschaft induzieren, ohne dass Weibchen mit vasektomierten Männchen verpaart werden müssen. Die Induktion einer Pseudoschwangerschaft ist Voraussetzung für den Erfolg des nicht-chirurgischen Embryotransfers und der nicht-chirurgischen künstlichen Befruchtung, die beide ebenfalls vorgestellt werden.

Induktion einer Pseudoschwangerschaft bei weiblichen Mäusen, ohne dass vasektomierte Männchen vor einem nicht-chirurgischen Embryotransfer oder einer künstlichen Befruchtung erforderlich sind

Das hier beschriebene AcroSensE-Mausmodell und die hier beschriebenen Live-Cell-Imaging-Methoden bieten einen neuen Ansatz zur Untersuchung der Kalziumdynamik im subzellulären Kompartiment des Spermienakrosoms und wie sie Zwischenschritte regulieren, die zur Membranfusion und Akrosomen-Exozytose führen.

Echtzeit-Bildgebung der akrosomalen Kalziumdynamik und Exozytose in lebenden Mäusespermien

Hier stellen wir ein Protokoll zur Etablierung eines Mausmodells für intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) vor, das es uns ermöglicht, altersbedingte Veränderungen im Glukosestoffwechsel zu beobachten, die auf ICSI zurückzuführen sind, und Einblicke in ihre potenziellen langfristigen Auswirkungen auf die menschliche Entwicklung zu geben.

Überwachung des Blutzuckers bei Mäusenachkommen nach intrazytoplasmatischer Spermieninjektion

Lernen Sie die runde Spermatiden-Injektion (ROSI) bei Mäusen zur Verbesserung der embryonalen Entwicklungseffizienz. Diese Methode bietet klinische Anwendungspotenziale für Patienten mit nicht-obstruktiver Azoospermie.

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

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