Name: T4-Bakteriophagen- und E. coli-Interaktion im murinen Darm: Ein prototypisches Modell zur Untersuchung der Wirt-Bakteriophagen-Dynamik in vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T13:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Erfahren Sie die Interaktion von T4-Bakteriophagen und E. coli im murinen Darm. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Wirt-Bakteriophagen-Dynamik in vivo und liefert Einblicke in das Darmmikrobiom.

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Die Autoren erkennen an, dass das Land, an dem sie diese Forschung durchgeführt haben, das traditionelle, angestammte und nicht abgetretene Territorium der xwməθkwəy̓əm (Musqueam) Nation ist. Das Land, auf dem es sich befindet, war schon immer ein Ort des Lernens für das Volk der Musqueam, das seit Jahrtausenden seine Kultur, Geschichte und Traditionen an diesem Ort von einer Generation zur nächsten weitergegeben hat. Wir ermutigen andere, mehr über die Heimatländer zu erfahren, in denen sie bei https://native-land.ca leben und arbeiten. Die Autoren danken der Unterstützung durch die Canadian Graduate Scholarships - Master (N.P.), den Michael Smith Health Research BC Trainee Award (RT-2023-3174, an MH), das Discovery Grants Program des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (RGPIN-2019-04591 bis C.T., RGPIN-2016-04282 bis LCO), das Canadian Institute for Advanced Research / Humans and the Microbiome (FL-001253 Appt 3362, an C.T.), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (18239, an C.T.), Canadian Institutes for Health Research (PJT-159458 an LCO) und die Canadian Foundation for Innovation (34673 an LCO und 38277 an CT). Wir sind dankbar für die technische Unterstützung durch das UBC Centre for Disease Modelling und ubcFLOW, das von der UBC GREx Biological Resilience Initiative unterstützt wird, sowie für die Mitglieder der Labore Osborne und Tropini für kritische Diskussionen und die Bewertung des Manuskripts. Abbildung 1A und Abbildung 2A wurden mit Biorender.com erstellt.

Erforschung der Dynamik von Phagen-Bakterien im Darm in Mausmodellen unter Verwendung von T4-Phagen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Bakteriophagen oder Phagen sind Viren, die Bakterien mit Spezies- und Stammspezifität infizieren und abtöten1. Phagen spielen eine wichtige Rolle in komplexen Bakteriengemeinschaften wie der Darmmikrobiota, wo sie an der Regulierung der Populationsdynamik und der Förderung der bakteriellen Fitness beteiligt sind2. In den letzten zehn Jahren ist das Interesse an der Phagenforschung aufgrund des Aufkommens antimikrobiell resistenter Krankheitserreger3 und des Potenzials der Phagentherapie als alternative Behandlungsstrategie wieder gestiegen. In den letzten Jahren wurden lytische Phagencocktails mit einigem Erfolg bei schweren, antibiotikaresistenten bakteriellen septischen Infektionen beim Menschen intravenös eingesetzt 3,4. Die orale Phagentherapie wurde auch als potenzielle Alternative zu Antibiotika zur Behandlung von Darminfektionen und Entzündungen vorgeschlagen. Darüber hinaus wurden Phagen mit dem Erfolg von fäkalen Filtrattransplantationen (FFT) in Verbindung gebracht, bei denen es sich um fäkale Mikrobiota-Präparate handelt, die gefiltert wurden, um Bakterien zu entfernen, bei der Behandlung von rezidivierenden Clostridioides difficile-Infektionen (rCDI)5,6, entzündlichen Darmerkrankungen (IBD)7,8 und nekrotisierender Enterokolitis bei Frühgeborenen9. Angesichts dieser Ergebnisse ist es wichtig, Wechselwirkungen sowohl zwischen Phagen und der Darmmikrobiota als auch zwischen Phagen und dem Säugetierwirt zu berücksichtigen, da die Hinzufügung neuer Phagen in eine bereits bestehende Gemeinschaft indirekte Auswirkungen auf die Gemeinschaft als Ganzes und nicht nur auf ihre Zielbakterien haben kann 2,10.
Die Untersuchung von Phageninteraktionen mit ihren Zielbakterien in vitro hat sich als nützlich erwiesen, um die Mechanismen und Auswirkungen von Phagen- und Bakterieninteraktionen im Darm zu verstehen. In diesem Setting wurde gezeigt, dass Escherichia coli-spezifische T4-Phagen der Ordnung Caudovirales Immunglobulin (Ig)-ähnliche Domänen benötigen, die sich in hochantigenen äußeren Kapsidproteinen (Hoc) auf der Virionoberfläche befinden, um am Darmschleimzu haften 11. Darüber hinaus haben Transwell-Assays gezeigt, dass T4-Phagen in der Lage sind, mit Epithelzellkulturen zu interagieren und durch Makropinozytose durch Zellschichten zu translozieren12,13. Diese Ergebnisse stützen die Hypothese, dass Phagen mit ihrem metazoischen Wirt interagieren können, obwohl sie nicht in der Lage sind, eukaryotische Zellen zu infizieren. Diese Modelle sind zwar nützlich, aber es fehlt ihnen die gesamte Bandbreite komplexer Interaktionen, die in einem Darmökosystem auftreten und für eine umfassende Untersuchung der dreigliedrigen Interaktion zwischen Phagen, Bakterien und dem Metazoenwirt erforderlich sind.
Mausmodelle sind ein wichtiges Werkzeug, um Phagen in komplexen Umgebungen zu untersuchen. Eine wünschenswerte Anwendung der Phagenverabreichung ist eine alternative Strategie zur Behandlung von antibiotikaresistenten Infektionen oder Pathobionten, die mit chronischen entzündlichen Erkrankungen, einschließlich CED, assoziiert sind. Neue Literatur deutet jedoch darauf hin, dass das Verhalten von Phagen in vitro die Funktionen in vivo nicht vollständig abbildet. Buttimer et al.14 zeigten, dass ein Phagencocktail in der Lage war, die Zielbakterien in einem vereinfachten menschlichen Mikrobiota-Konsortium in vitro zu depletieren, aber nicht in vivo in gnotobiotischen Mäusen repliziert werden konnte, die mit demselben Bakterien-Phagen-Konsortium besiedelt waren. Darüber hinaus führte der T7-Phage in einem konventionellen Mausmikrobiom zu einer selektiven Erschöpfung seiner Zieldarmbakterien, obwohl im Laufe der Zeit eine allmähliche Erholung beobachtet wurde, was auf eine entwickelte Resistenz hinweist15. Andere Studien haben die Koexistenz von oral verabreichten Phagen und ihren Zielbakterienstämmen in vivo nachgewiesen 2,16. Tatsächlich führte die Phagenverabreichung über die Koexistenz von Phagen und Bakterien hinaus zu weitreichenden Veränderungen in der Gesamtzusammensetzung und -funktion der Mikrobiota-Gemeinschaft 2,16. Dies ist für Krankheitssituationen relevant, da mehrere Studien Assoziationen zwischen einer erhöhten relativen Abundanz von Caudovirales und IBD gefunden haben 7,8,17, die unabhängig von Veränderungen der bakteriellen Abundanz waren7. Es ist nicht bekannt, ob dies ein Treiber oder eine Folge der Krankheitspathogenese ist.
Der historische Schwerpunkt der Phagenforschung lag auf der Beziehung zwischen einem Phagen und seinem Zielbakterium. Es ist jedoch auch wichtig, mögliche Wechselwirkungen zwischen Phagen und der Schleimhaut, dem Epithel und dem Immunsystem des Metazoenwirts zu berücksichtigen. Diese Wechselwirkungen spielen alle eine wichtige Rolle bei der Gesamtreaktion auf Darmphageninfektionen. Um dies zu demonstrieren, wurden Phagen mit keimfreien (GF) Mäusen untersucht, um ihre Auswirkungen auf das Immunsystem ohne Eingriffe der Mikrobiota aufzuklären8. In diesem System wurden Phagen-Nukleinsäuren durch Toll-like-Rezeptoren (TLRs) nachgewiesen, die sich in Endosomen phagozytärer Immunzellen (Makrophagen und dendritische Zellen) befinden. Dies aktivierte die nachgeschaltete Signalübertragung und stimulierte die T-Zell-abhängige Produktion von Interferon (IFN)-γ8 oder Typ I IFNs18. Darüber hinaus implizierten Flückiger et al.19 Gedächtnis-CD8+ T-Zellen bei der Erkennung von Phagen-kodierten (Prophagen-) Antigenen, was zu einer T-Zell-Kreuzreaktivität mit Tumorantigenen führte, was zu einer verringerten Tumorlast führte. Schließlich wurde die Phagen-spezifische Antikörperproduktion in Mausstudien dokumentiert, in denen Phagen kontinuierlich über Trinkwasser 8,20 oder durch wiederholte orale Sonde über mehrere Monate hinweg an Tiermodelle abgegeben wurden20, was die Fähigkeit von Phagenproteinen zur Förderung humoraler Immunantworten zeigt. Obwohl diese Arten der Phageninokulation eine optimale und kontinuierliche Vorbereitung des Immunsystems ermöglichen, repräsentieren sie möglicherweise nicht die natürlich vorkommenden Wechselwirkungen zwischen Phagen und der Darmumgebung oder die Kinetik der oral angewendeten Phagentherapie. Bisher hat eine begrenzte Anzahl von Studien die Interaktionen von Phagen mit einer einzigen Bakterienart in monokolonisierten Mausmodellen untersucht21. Monokolonisierte Mäuse erwiesen sich jedoch als entscheidend für die Entschlüsselung mikrobenspezifischer Effekte einzelner Spezies auf den Magen-Darm-Trakt und die Immunentwicklung 22,23,24, und sie könnten sich noch als nützlich erweisen, um dreigliedrige Interaktionen zwischen Phagen, ihren Zielbakterien und dem Metazoenwirt zu verstehen.
Spannenderweise gibt es noch viel über die Wechselwirkungen zwischen Darmphagen und Darmkommensalbakterien sowie über die Wechselwirkungen zwischen dem Metazoen-Wirt und den darin befindlichen Phagen zu lernen. Dieses Protokoll bietet eine Reihe von Verfahren zur Untersuchung von isolierten T4-Phagen und seinem bakteriellen Gegenstück, E. coli (K-12, BW25113), unter Verwendung eines gnotobiotischen Mausmodells. Diese standardisierten Verfahren bieten auch eine Grundlage für die Optimierung anderer Phagen/Bakterien-Dyaden, indem die Wachstumsparameter an die interessierenden Paare angepasst werden. Die hier beschriebenen Methoden skizzieren: (1) Herstellung von T4-Phagen- und Vehikellysaten für orale Sonden von Mäusen; (2) Orale Verabreichung von T4-Phagen an monokolonisierte gnotobiotische Mäuse von E. coli ; (3) Überwachung der T4-Phagenspiegel in Mäusekot und -gewebe im Laufe der Zeit.
Für die hier vorgestellten repräsentativen Ergebnisse wurden gereinigte T4-Phagenlysate aus Phagenbankbeständen des Rohwer Lab vermehrt. Die Phagen-on-Tap-Methode zur Vermehrung von T4-Phagen wurde angepasst25, wie in diesem Protokoll referenziert. Die Methode liefert innerhalb von drei Tagen Phagenbestände mit hohem Titer und niedrigem Endotoxingehalt. Mit diesem Ansatz wurden routinemäßig 10 ml ≥ 1010 plaquebildende Einheiten (pfu)/ml T4-Phagen mit < 0,5 Endotoxineinheiten (EU)/ml gesammelt. Die empfohlenen Endotoxingehalte für die orale oder intravenöse Verabreichung an Mäuse liegen bei ≤ 20 EU/ml bzw. ≤ 5 EU/kg/h (bzw. 0,1 EU über 1 h für eine 20-g-Maus), was dies zu einer geeigneten Methode der Phagenpräparation für die In-vivo-Inokulation macht. Alle Phagenbestände wurden bei 4 °C in salzhaltigem Magnesium (SM)-Phagenpuffer gelagert (Rezeptur in Schritt 1.1.5.1). E. coli wurde in LB-Medien kultiviert. Für verschiedene Phagen-Bakterien-Paare können verschiedene Nährmedien und Wachstumsbedingungen aus diesem Protokoll angepasst werden. Phagen können auch aus der Umwelt wie Abwasser, Meerwasser, Boden und Darminhalt stammen und können gemäß Sambrook und Russell26 vor der Herstellung unter den geeigneten Wachstums- und Vermehrungsbedingungen für jedes Phagen-Wirt-Paarvon Interesse 25 isoliert und gereinigt werden. Alternativ können Phagen aus kommerziellen Quellen (siehe Materialtabelle) oder aus Phagenbanken bezogen werden.

<table><tbody><tr><td>1-Oktanol (99%)</td><td>Thermofisher</td><td>CAAAA15977-AP</td><td></td></tr><tr><td>50 ml PES Steriflip Sterile Einweg-Vakuumfiltereinheiten</td><td>Millipore Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>SCGP00525</tr><tr><td>Agarose (Low-EEO/Mehrzweck/Molekularbiologie</td>)<td>Fisher BioReagents&nbsp;</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Amicon&reg; 100kDa Ultra-15 Zentrifugalfiltergerät, Ultracel-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>BD Microtainer&reg; Schläuche, SST</td><td>BD Medical</td><td>365967</td><td></td></tr><tr><td>Bioexclusion luftdichte Käfige (ISO-Käfige)</td><td>Techiplast</td><td>1245ISOCAGE</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Berühren & Handeln Thermocycler mit 96-Well-Schnellreaktionsmodul</td><td>BioRad</td><td>1851196</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat (weiße Kristalle zu Pulver)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP510-500</td><td></td></tr><tr><td>Cap Locks für 1,5 ml Tube 100/Packung</td><td>Andwin Scientific</td><td></td><td></td>16812612</tr><tr><td>Chloroform (Ethanol als Konservierungsmittel/ACS-zertifiziert)</td><td>Fisher</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Kupferbeschichtete Stahlperlen (4,5 mm)</td><td>Crosman Corporation</td><td>0767</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blut & Taschentuch-Set (50)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Dinatriumsalzlösung, für die Molekularbiologie, 0,5 M in H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents&trade; Agar, Pulver / Flocken, Fisher BioReagents & Handel; &nbsp;</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents&Handel; Mikrobiologische Medien: LB Bouillon (Pulver) - Lennox&nbsp;</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp DNA Leiter</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0241</td><td></td></tr><tr><td>Green FastMix&reg; qPCR-Mix, 1250 rxns</td><td>QuantaBio</td><td>95072-012</td><td></td></tr><tr><td>HEPA-Filter für Isokäfigdeckel, AUTOKLAVIERBARE H14-FILTER FÜR ISO-LINIEN-BESTRAHLT</td><td>Techiplast</td><td>UISOHEPAXTBOX-300</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 6000 Inkubationsschüttler</td><td>Thermo Scientific</td><td>8354-30-0009</td><td></td></tr><tr><td>Mikrobiologische Medien: LB Bouillon (Pulver) - Lennox</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen mit verriegelnder Schnappkappe, 2ml</td><td>Fisher</td><td>14-666-315</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm-Siegelfolie</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Phagenaktien</td><td>Carolina Biological Supply&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>PicoLab&reg; Maus Diät 20 EXT</td><td>LabDiet</td><td>5R58</td><td></td></tr><tr><td>Pierce&Handel; Chromogenes Endotoxin Quant Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td>A39552S</tr><tr><td>RNase A (17.500 U)</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>RNase-freies DNase-Set</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat (feines weißes Pulver)</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (kristallin/ACS-zertifiziert)</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallgerät (Sonde Modell CL-18; Stromquelle Modell FB50)</td><td>Fisher parfüm&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Steriler flexibler Filmisolator&nbsp;</td><td>Klasse biologisch sauber&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&trade; Sicherer DNA-Gel-Farbstoff</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermocycler&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>T4 Phagen-Primer, vorwärts (CCACACATAGCGCGAGTATAA)</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>T4 Phagen-Primer, vorwärts (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, 1M-Lösung, pH 8,0, molekularbiologische Qualität, hochreines</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>AAJ22638AE</tr><tr><td>Wasser, (DNASE, RNASE-frei)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2484100</td><td></td></tr></tbody></table>

t4-bakteriophagen- und e. coli-interaktion im murinen darm: ein prototypisches modell zur untersuchung der wirt-bakteriophagen-dynamik in vivo

T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo

Bakteriophagen (Phagen) sind Viren, die Bakterien mit Spezies- und Stammspezifität infizieren und die am häufigsten vorkommenden biologischen Einheiten in allen bekannten Ökosystemen sind. Innerhalb von Bakteriengemeinschaften, wie sie in der Darmmikrobiota vorkommen, sind Phagen an der Regulierung der Populationsdynamik der Mikrobiota und der Förderung der bakteriellen Evolution beteiligt. In den letzten zehn Jahren ist das Interesse an der Phagenforschung wieder gestiegen, zum Teil aufgrund der wirtsspezifischen Abtötungsfähigkeiten lytischer Phagen, die ein vielversprechendes Instrument bieten, um der zunehmenden Bedrohung durch antibiotikaresistente Bakterien entgegenzuwirken. Darüber hinaus deuten neuere Studien, die zeigen, dass Phagen am Darmschleim haften, darauf hin, dass sie eine schützende Rolle bei der Verhinderung des bakteriellen Eindringens in das darunter liegende Epithel spielen könnten. Wichtig ist, dass gestörte Phageome wie bakterielle Mikrobiome mit verschlechterten Ergebnissen bei Krankheiten wie entzündlichen Darmerkrankungen in Verbindung gebracht wurden. Frühere Studien haben gezeigt, dass Phagen das Mikrobiom von Tieren und Menschen durch Stuhlfiltrattransplantationen modulieren können, was der Gesundheit des Wirts zugute kommt. Mit dieser jüngsten Forschungswelle geht die Notwendigkeit einher, Protokolle für die Untersuchung von Phagen im Kontext des Darmmikrobioms zu erstellen und zu standardisieren. Dieses Protokoll bietet eine Reihe von Verfahren zur Untersuchung isolierter T4-Phagen und ihres bakteriellen Wirts, Escherichia coli, im Kontext des murinen Magen-Darm-Trakts. Die hier beschriebenen Methoden beschreiben, wie man von einem Phagenlysat ausgeht, es Mäusen verabreicht und die Auswirkungen auf bakterielle Wirts- und Phagenspiegel bewertet. Dieses Protokoll kann modifiziert und auf andere Phagen-Bakterien-Paare angewendet werden und bietet einen Ausgangspunkt für die Untersuchung der Wirt-Phagen-Dynamik in vivo.

Um die Wechselwirkungen zwischen der T4-Phagen/E. coli-Dyade im murinen Darm zu untersuchen, wurden T4-Phagen- und Vehikellysate hergestellt, gereinigt und gereinigt (Abbildung 1A). T4-Phagenlysate wurden mittels Plaque-Assay titeriert und in SM-Puffer auf 2 x 107 pfu/ml (2 x 106 pfu/m) verdünnt. Vehikellysate wurden ebenfalls titerisiert, um zu bestätigen, dass keine lebensfähigen Phagen vorhanden sind, und in der gleichen Menge SM-Puffer wie das T4-Phagenlysat verdünnt. Die Endotoxingehalte wurden in verdünnten Lysaten mit einem chromogenen Endotoxin-Quantifizierungskit quantifiziert. T4-Phagen, hitzeinaktivierte Phagen und Vehikellysate wiesen Endotoxinwerte auf, die unter den für Trinkwasser akzeptablen Werten (&lt;20 EU/ml)25 lagen (Abbildung 1B). Da das Vehikellysat eine ähnliche Menge an Endotoxin wie das T4-Phagenlysat enthielt, wurde es als geeignete Kontrolle angesehen. Das hitzeinaktivierte Phagenlysat (2 x 107 pfu/ml vor der Wärmebehandlung) enthielt weniger Endotoxin als sowohl das Vehikel als auch das T4-Phagenlysat. Gemäß den Kit-Anweisungen wurden Proben, die mit 1-Octanol behandelt worden waren, auf Assay-Hemmung getestet, indem dem Vehikelysat ein Endotoxinstandard zugesetzt wurde (Spike-Vehikel), um eine Endkonzentration von 0,5 EU/ml zu erhalten. Die Endotoxinwerte des Fahrzeugs mit Spikes abzüglich der Endotoxingehalte des Fahrzeugs betrugen 0,5 EU/ml ±25 % gemäß den Empfehlungen des Herstellers (Abbildung 1B). Dies zeigte, dass 1-Octanol erfolgreich entfernt wurde und dass es keine durch die Lysate verursachte Assay-Hemmung gab, die die Ergebnisse des Assays beeinträchtigen könnte.
E. coli K-12 (BW25113) monokolonisierte C57BL/6-Mäuse wurden in einem sterilen flexiblen Vinylisolator unter gnotobiotischen Bedingungen gezüchtet (Abbildung 2A). Mäuse der F0-Generation wurden mit E. coli besiedelt, indem es sich in ihre Umgebung eingliederte und in Co-Housing lebte. Für Experimente wurden nur die Nachkommen (F1- und F2-Generation) verwendet, die von Geburt an über vertikale Übertragung und Co-Housing mit E. coli besiedelt waren. Diese Strategie kontrollierte die Veränderungen des Immunsystems, der Schleimproduktion und der Entwicklung des Magen-Darm-Trakts, die als Reaktion auf die bakterielle Inokulation auftreten22,37, und ermöglichte somit die Messung von Veränderungen, die nur aufgrund der Phageneinführung auftreten. Nach der Reifung wurden die Versuchsmäuse in sterile Isokäfige überführt, wo sie im Alter von 6-8 Wochen jeweils 2 x 106 pfu T4-Phagen oder ein gleiches Volumen Vehikellysat durch orale Sonde erhielten. Die Häufigkeit von T4-Phagen und E. coli wurde über vier Wochen durch Entnahme von Kotpellets und Spot-Plattierungstests an 0,5 % (weichem) Agar bzw. 1,5 % Agar überwacht. Im Verlauf dieses Experiments konnten T4-Phagen und E. coli koexistieren, ohne dass eine der beiden Populationen erschöpft war (Abbildung 2B, C). Die orale Verabreichung von T4-Phagen in niedrigeren Dosen von 2 x 102 und 2 x 104 pfu/Maus verringerte die Fähigkeit des T4-Phagen, den Darm zu besiedeln, im Vergleich zu 2 x 106 pfu nicht (Abbildung 2D). Ebenso wurde kein dosisabhängiger Effekt der T4-Inokulation auf die E. coli-Spiegel beobachtet (Abbildung 2E).
Wichtig ist, dass die Konsistenz der Beschichtung zwischen den Proben entscheidend für die Plaquezahl ist. So wurde beispielsweise bei der Zugabe von Bakterien in den Weichagar festgestellt, dass die Bakteriendichte das Ergebnis des Assays stark beeinflusst. Die Zugabe von E. coli , die 1 h, 1,5 h oder 2 h subkultiviert wurde, führte zu niedrigeren Plaquezahlen als die Zugabe von E. coli , die 2,8 h oder länger subkultiviert wurden. Darüber hinaus stabilisierte sich die Plaque-Quantifizierung bei ~1 x 109 pfu/ml, wenn E. coli für 2,8 h bis 16 h (über Nacht) subkultiviert wurde, was ungefähr einem 5-fachen Anstieg im Vergleich zu dem aus einer 1-h-Subkultur berechneten Wert (~2 x 108 pfu/ml) entsprach (Abbildung 3A). Anstatt eine Subkultivierung durchzuführen, können Zielbakterien aus Übernachtkulturen in Weichagar geimpft werden. Hier beeinflusste das Volumen der 16 h (über Nacht) E. coli-Kultur , die in den Weichagar geimpft wurde, die Plaquezahl (Abbildung 3B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Dichte von E. coli im Agar die Anzahl der Plaque-Assays beeinflussen kann. Bei beiden Ansätzen stagnierten die Ergebnisse der Phagenquantifizierung auf dem gleichen Wert (109 pfu/ml), was darauf hindeutet, dass die Zielbakterien eine ausreichend hohe Dichte im Weichagar aufweisen müssen, um die Genauigkeit der Plaquezählung zu gewährleisten.
Zusammengenommen unterstreichen diese Ergebnisse, wie wichtig es ist, ein Verständnis der Phagenbakterienkinetik durch In-vitro - und In-vivo-Pilotexperimente zu entwickeln, bevor experimentelle Manipulationen durchgeführt werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig01v2.jpg"> Abbildung 1: Herstellung von Phagenlysaten. (A) Arbeitsablauf zum Starten eines Phagenlysats aus einem Phagenstamm mit hohem Titer. Lysate wurden vermehrt, gereinigt, konzentriert und Endotoxine entfernt. Kontaminierendes 1-Octanol wurde durch Schnellvakuum entfernt. (B) Endotoxine wurden in Phagen- und Vehikellysaten unter Verwendung eines chromogenen Endotoxin-Quantifizierungskits quantifiziert. Gestrichelte blaue Linien zeigen die oberen und unteren Grenzen an, um die Produkthemmung in der Produkthemmungskontrolle zu widerlegen (0,5 EU/ml ± 25%). Jeder Punkt repräsentiert eines von zwei technischen Replikaten. Die Balkenhöhe stellt den Mittelwert über Replikate hinweg dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig01largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig02v2.jpg"> Abbildung 2: Erzeugung monokolonisierter Mäuse und Überwachung der Phagen- und Bakterienkonzentrationen in Kotpellets. (A) Arbeitsablauf zur Besiedlung keimfreier Mäuse mit einer einzigen Bakterienart und Erzeugung von monokolonisierten F1- und F2-Mäusen. (B-E) Konzentrationen von T4-Phagen und E. coli in Kotpellets von C57BL/6-Mäusen, die monokolonisiert mit E. coli geboren und im Alter von 6-8 Wochen mit T4-Phagen geimpft wurden. An Tag 0 (vor der Besiedlung) und an den angegebenen Tagen nach der Besiedlung wurden die T4-Phagenspiegel durch Spot-Plattierung und Plaque-Assays unter Verwendung der Einzel-Agar-Schichtmethode gemessen. Die E. coli-Gehalte wurden durch Spot-Plattierung auf 1,5 % LB-Agar gemessen. (B, C) Kinetik der (B) T4-Phagen- und (C) E. coli-Spiegel in zurückgewonnenen Kotpellets nach Inokulation mit 2 x 106 pfu T4-Phagen oder Vehikellysat (normalisiert für Volumen und Endotoxingehalt). (D, E) (D) T4-Phagen- und (E) E. coli-Spiegel in zurückgewonnenen Kotpellets nach Inokulation mit 2 x 102 pfu, 2 x 104 pfu oder 2 x 106 pfu T4-Phagen. Fehlerbalken stellen den Mittelwert und den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig02largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig03v2.jpg"> Abbildung 3: Genauigkeit bei der Fehlerbehebung bei Plaque-Assays. (A) T4-Phagenlysat-Titer unter Verwendung von E. coli-Übernachtkulturen oder -subkulturen zur Weichagarherstellung (0,5 % Agar, LB). Subkulturen wurden unter Verwendung einer 1:50-Verdünnung von E. coli-Kultur über Nacht in frisches LB hergestellt. 5 ml Weichagarpräparate wurden mit 100 μl E. coli und 20 μl T4-Phagen beimpft. CaCl2 und MgSO4 wurden dem Weichagar für diese Tests nicht zugesetzt, können aber auf Wunsch zugesetzt werden. E. coli-Subkulturzeiten unter 2,8 h führten zu einem niedrigeren scheinbaren Phagentiter. (B) T4-Phagenlysat-Titer unter Verwendung unterschiedlicher E. coli-Dichten in der Weichagar-Zubereitung. Die Zugabe unterschiedlicher Mengen von E. coli aus einer Übernachtkultur (nicht subkultiviert, wie in A) in den Weichagar führte zu unterschiedlichen scheinbaren Phagentitern. Fehlerbalken stellen die berechnete Phagentiterunsicherheit dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig03largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Bakteriophagen (Phagen), Viren, die Bakterien infizieren, sind ein integraler Bestandteil des Darmmikrobioms. Obwohl diese symbiotischen Bewohner die bakterielle Fitness und Populationsdynamik vorantreiben, ist wenig darüber bekannt, wie sie sich auf die Darmhomöostase und -krankheit auswirken. Dieses Protokoll untersucht isolierte T4-Phagen in einem Mausmodell, die an andere Phagen-Bakterien-Paare angepasst werden können.

T4-Bakteriophagen- und E. coli-Interaktion im murinen Darm: Ein prototypisches Modell zur Untersuchung der Wirt-Bakteriophagen-Dynamik in vivo

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across ...

Unsere Forschung zielt darauf ab, die dreiteiligen Wechselwirkungen zwischen Bakteriophagen, Bakterien und dem Immunsystem von Säugetieren im Kontext des Darms, des gnotobiotischen Mausdarms zu verstehen. Wir hoffen, Einblicke in diese Wechselwirkungen unter Gesundheits- und Krankheitsbedingungen zu gewinnen, um die Bedeutung des Darmmikrobioms besser zu verstehen. Jüngste Entwicklungen haben ergeben, dass Bakteriophagen vom Immunsystem von Säugetieren erkannt werden können.Es wurde vermutet, dass das menschliche Darmphageom bei Krankheitszuständen wie entzündlichen Darmerkrankungen fehlreguliert sein könnte und die Immunstimulation durch Phagen Krankheitsphänotypen verschlimmern könnte. Unser Ziel ist es, anderen ein standardisiertes Protokoll zur Herstellung eines T4-Phagenlysats für die Inokulation und Enumeration in gnotobiotischen Mausmodellen zur Verfügung zu stellen. Diese Protokolle können für die Verwendung mit anderen Bakteriophagen-Bakterienpaaren aufgebaut und modifiziert werden.

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Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieser Artikel beschreibt das Verfahren zur Herstellung eines fluoreszenzmarkierten Version des Bakteriophagen Lambda,...

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Assessing the Coexistence of T4 Bacteriophage and E. coli in Murine Fecal Samples

Source: Pett, N., et al. T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates the purification of bacteriophages from bacterial cell lysates using sequential centrifugation, membrane filtration, chloroform extraction, centrifugal filtration, and buffer exchange to obtain a purified phage preparation.

Purification of Bacteriophages from Bacterial Lysate

Dieses Protokoll beschreibt eine robuste Methode zur Verwendung von Hochdurchsatzeinstellungen, um die antibakterielle Wirksamkeit von Bakteriophagencocktails zu überprüfen.

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Wir beschreiben ein Protokoll zu den wichtigsten Aufgaben der Host Signalmoleküle in lytische Replikation eines Modells Herpesvirus, gamma Herpesvirus 68 (γHV68) zu identifizieren. Mit Hilfe genetisch veränderter Mauslinien und embryonale Fibroblasten zur γHV68 lytische Replikation, erlaubt das Protokoll sowohl phänotypische Charakterisierung und molekulare Vernehmung von Virus-Wirt-Interaktionen in lytischen Replikation.

Sezieren Host-Virus-Interaktion in Lytic Replikation von einem Modell Herpesvirus

Murine Knochenmark-Transplantation ist eine weit verbreitete Technik, um immunologische Mechanismen für Graft-versus-Host-Krankheit beim Menschen zu studieren. Die Fähigkeit zur T-Zell-Trafficking-Muster zu...

Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit und<em&gt; In Vivo</em&gt; T-Zell-Überwachung mit einem MHC-matched Mausmodell

Wir skizzieren Methoden für die effiziente und schnelle Isolierung / Kultur lebensfähiger Mikroglia aus dem Neugeborenen Hirnrinde und erwachsenen Rückenmark. Die Präparation und Beschichtung der kortikalen Mikroglia kann innerhalb von 90 Minuten erreicht werden, mit der anschließenden Mikroglia Ernte stattfindet ~ 10 Tage nach der ersten Sektion.

Kultivierung Mikroglia aus dem Neugeborenen und Erwachsenen Central Nervous System

Mitglieder der Gattung Burkholderia sind Erreger von klinischer Bedeutung. Wir beschreiben ein Verfahren zur bakteriellen Gesamtproteinextraktion unter Verwendung mechanischer Aufbruch-und 2-D-Gelelektrophorese für nachfolgende Proteomanalyse.

Gesamtproteinextraktion und 2-D Gelelektrophorese-Methoden für<em&gt; Burkholderia</em&gt; Arten

Hier wird ein Verfahren für die Festlegung der systemischen Infektion in der neonatalen Ratten mit Kulturen von Escherichia coli K1 beschrieben. Diese nichtinvasive Vorgehensweise erlaubt Besiedlung des Magen-Darm-Trakt, die Translokation des Erregers in den systemischen Kreislauf, und das Eindringen des zentralen Nervensystems in den Plexus choroideus.

Nichtinvasive Modell Neuropathogenic Escherichia coli Infektion in der neonatalen Ratten

Die vorliegende Studie beschreibt die Entwicklung und Anwendung eines gentechnisch veränderten Assay-Systems, das auf der Transfektion von basophilen Leukämiezellen der Ratte mit dem equinen FcεRIα-Gen basiert. Transfizierte Zellen exprimieren einen funktionellen Rezeptor, an dem die Freisetzung von Mediatoren der allergischen Reaktion durch IgE und Antigen aktiviert werden kann.

Entwicklung eines In vitro Modellsystem für die Untersuchung der Wechselwirkung von Equus Caballus IgE mit seinen hochaffinen Rezeptors FcsRI

Erfahren Sie die Interaktion von T4-Bakteriophagen und E. coli im murinen Darm. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Wirt-Bakteriophagen-Dynamik in vivo und liefert Einblicke in das Darmmikrobiom.

T4-Bakteriophagen- und E. coli-Interaktion im murinen Darm: Ein prototypisches Modell zur Untersuchung der Wirt-Bakteriophagen-Dynamik in vivo (Video) | JoVE Journal

T4-Bakteriophagen- und E. coli-Interaktion im murinen Darm: Ein prototypisches Modell zur Untersuchung der Wirt-Bakteriophagen-Dynamik in vivo

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