Name: Aufzeichnung der funktionellen Barriereintegrität auf bEnd.3 vaskulären Endothelzellen mittels transendothelialer elektrischer Widerstandsdetektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Erfahren Sie die Messung des transendothelialen elektrischen Widerstands an bEnd.3-Zellen zur Bewertung der Blut-Hirn-Schranke. Diese nicht-invasive Methode ermöglicht die Beschleunigung von Arzneimittelscreenings für das zentrale Nervensystem.

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Wir freuen uns über die finanzielle Unterstützung der National Natural Science Foundation of China (82274207 und 82104533), des Key Research and Development Program of Ningxia (2023BEG02012) und des Xinglin Scholar Research Promotion Project der Chengdu University of TCM (XKTD2022013).

ANMERKUNG: Aus dem Gehirn von Mäusen gewonnene Endothelzellen.3 (bEnd.3) wurden in die Kammern einer 24-Well-Platte inokuliert, um ein einfaches In-vitro-Modell der BHS unter bestimmten Mediumbedingungen zu konstruieren. Die TEER von normalen Zellen und hypoxischen Zellen wurden mit einem TEER-Messgerät gemessen (Abbildung 1 und Abbildung 2).
1. Vorbereitung der Lösung
<ol><li>Bereiten Sie das DMEM-Zellkulturmedium vor, das FBS (10 %, v/v), 100 U/ml Penicillin und 10 mg/ml Streptomycin enthält (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Bereiten Sie 100 mM CoCl2 Stammlösung vor, indem Sie 1,30 mg CoCl2 zu 100 μl DMSO-Lösung hinzufügen. ANMERKUNG: Alle oben genannten Lösungen wurden bei 4 °C gelagert, und die Stammlösung wurde vor der Verwendung entsprechend der gewünschten Konzentration verdünnt.</li>
	<li>Bereiten Sie 5%ige Natriumhypochloritlösung (v/v) vor, indem Sie 2 ml Natriumhypochloritlösung zu 38 ml doppelt destilliertem Wasser hinzufügen.</li>
</ol>2. Zellkultur und Zelllebensfähigkeit
<ol><li>1 ml bEnd.3-Zellen in einer Kulturschale (100 mm) mit DMEM-Medium mit einer Dichte von 1 x 106 Zellen/ml und einer Kultur bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 %CO2 aussäen. Wechseln Sie das Medium alle 2 bis 3 Tage und subkultivieren Sie die Zellen 2x pro Woche.</li>
	<li>Nachdem die Zellen auf 80 % Konfluenz angewachsen sind, verdauen Sie die Zellen 30 s lang mit 0,25 % Trypsin.</li>
	<li>Stellen Sie eine Suspension aus bEnd.3-Zellen mit einer Dichte von 7 x 104 Zellen/ml unter Verwendung von DMEM-Medium durch einen Zellzähler her. Säen Sie dann 100 μl bEnd.3-Zellsuspension in eine 96-Well-Platte.</li>
	<li>Nach der Zelladhäsion werden die Zellen mit PBS gereinigt und die Zellen mit 100 μl Kulturmedium oder arzneimittelhaltigem Medium (100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM CoCl2) für 24 h unter den gleichen Bedingungen kultiviert. Nachdem Sie das Medium aus dem Inneren der Well-Platte entfernt und mit PBS gereinigt haben, fügen Sie 100 μl CCK-8-Lösung hinzu. HINWEIS: Erzeugen Sie keine Blasen in der Vertiefung, die die Werte der optischen Dichte (OD) beeinträchtigen.</li>
	<li>96-Well-Platten bei 37 °C platzieren und 1 h inkubieren. Messen Sie die Absorption der 96-Well-Platten bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader. HINWEIS: Um Unterschiede innerhalb der Gruppe zu vermeiden, wurden die Well-Platten vor der Detektion auf Raumtemperatur abgekühlt.</li>
	<li>Berechnen Sie die Zelllebensfähigkeit, die durch verschiedene Konzentrationen von CoCl2 induziert wird, gemäß der Formel [ODDrug - ODBlank] / [ODControl-OD Blank] x 100%. Wählen Sie für das nächste Experiment die CoCl2-Konzentration mit einem signifikanten Unterschied in der Reduktion der Zellviabilität im Vergleich zur Kontrollgruppe.</li>
</ol>3. Zusammenbau des Modells
<ol><li>Spülen Sie die obere Kammer der 24-Well-Platten mit PBS. HINWEIS: Die Zellen wuchsen und verschmolzen am Boden der oberen Kammer der 24-Well-Platte, und es bildeten sich allmählich Tight Junctions zwischen den Zellen, die eine Barriererolle spielten. Wenn die in einigen Studien verwendeten Endothelzellen nicht in der Lage sind, selbstständig eine vollständige Barriere auf PET-Membranen zu bilden, müssen die Membranen vor der Zellinokulation mit Kollagen-IV-Lösung beschichtet werden.</li>
	<li>Mischen Sie die bEnd.3-Zellen mit DMEM-Medium, um mit einem Vortex-Mischer eine Suspension mit einer Dichte von 5 x 105 Zellen/ml herzustellen. Säen Sie dann 200 μl bEnd.3-Zellsuspension auf die PET-Membran in der oberen Kammer einer 24-Well-Platte (0,33 cm2, 0,4 μm Membranporengröße). HINWEIS: Die Pilotstudie dieses Protokolls ergab keinen Unterschied in den Ergebnissen, wenn 5 bis 10 Passagen von bEnd.3-Zellen für Experimente verwendet wurden. Um die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Modellierung zu gewährleisten, beachten Sie bitte das Zellzahlintervall dieses Protokolls.</li>
	<li>Geben Sie 1200 μl des kompletten Mediums in die untere Kammer der Platte, um sicherzustellen, dass sich der osmotische Druck der oberen und unteren Kammer tendenziell stabilisiert. Je nach Typ gibt es Unterschiede in der Menge des zugegebenen Mediums; Stellen Sie sicher, dass der Flüssigkeitsstand der oberen und unteren Kammer bündig ist.</li>
	<li>Wechseln Sie täglich das Medium der oberen und unteren Kammer zu einer festgelegten Zeit und überwachen Sie gleichzeitig den Widerstandswert.<ol><li>Beim Wechsel des Mediums wird die Integrität der Zellschicht durch künstliche Berührung oder übermäßige Bewegung beschädigt. Um die oben genannte Situation zu vermeiden, entfernen Sie das alte Medium langsam von einer Seite mit einer Unterdruckpipette und fügen Sie während des Flüssigkeitsaustauschs langsam ein neues Medium entlang der Wand hinzu.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Messung des TEER
<ol><li>Bevor Sie mit der Arbeit beginnen, stellen Sie den Widerstand, die 5%ige Natriumhypochloritlösung, das 75%ige Ethanol und die doppelt destillierte Wasserlösung auf einen hochreinen Tisch. Schalten Sie die UV-Bestrahlung für 30 Minuten ein, um Restbakterien und Krankheitserreger zu entfernen.</li>
	<li>Legen Sie die Elektroden in eine 5%ige Natriumhypochloritlösung mit langsamem Schütteln für 3 s bis 5 s und tauchen Sie dann 15 Minuten lang in 75%iges Ethanol ein. Zum Schluss bis zur Verwendung in PBS oder doppelt destillierte Wasserlösung überführen.</li>
	<li>Schalten Sie den Schalter auf der Rückseite des Zellwiderstandsmessgeräts ein, klicken Sie gemäß den Parametern in Tabelle 1 auf Platte auswählen und wählen Sie 24-Well-Platte.</li>
	<li>Wählen Sie je nach Operationsanforderung die geeignete Erkennungssequenz aus. Wir haben uns in dieser Studie für das A1-Verfahren entschieden.</li>
	<li>Stecken Sie einen kΩ-Widerstand in den rechten Stecker, um das Gerät zu kalibrieren. Wenn das Kalibrierungsergebnis 1000 ± 5 Ω beträgt, betrachten Sie die Genauigkeit des Geräts als normal.<ol><li>Wenn das Kalibrierungsergebnis nicht 1000 Ω beträgt, klicken Sie auf der Hauptschnittstelle auf Moduseinheiten , um OHMS auszuwählen, und klicken Sie dann auf dem Hauptbildschirm auf Kalibrieren , um das Gerät erneut zu kalibrieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Ziehen Sie den kΩ-Widerstand auf der rechten Seite heraus und ersetzen Sie die Messelektrode durch ein Verbindungskabel.</li>
	<li>Legen Sie die Elektrode in die 24-Well-Platte, ohne Zellen vertikal zu impfen, und klicken Sie auf dem Hauptbildschirm des Geräts auf Blank Handling . Der Hintergrundwert des Plattenwiderstandes ohne gekeimte Zellen beträgt etwa 134,4 Ω.</li>
	<li>Führen Sie die beiden Elektroden in die obere und untere Kammer der besäten Platte mit den Zellen ein, so dass sich die Zellschicht dazwischen befindet, und notieren Sie dann den Widerstandswert, indem Sie vorsichtig auf das Pedal treten.<ol><li>Achten Sie darauf, dass die Elektrode die Zellen in der oberen Kammer und den Boden der unteren Kammer nicht berührt. Die Einweichzeit der Elektrode in der Lösung hat keinen Einfluss auf den Widerstandswert, und es muss nur sichergestellt werden, dass sich die Elektrode in der richtigen Position befindet.</li>
	</ol></li>
	<li>Die TEER-Werte (Ωcm2) erhalten Sie, indem Sie die elektrischen Widerstandswerte (Ohm) mit dem unteren Bereich (cm2) der oberen Kammer multiplizieren, wie in der Gleichung dargestellt: TEER (Ωcm2) = Widerstand (Ω) xS-Einsatz (cm 2)</li>
	<li>Zeichnen Sie ein Liniendiagramm der TEER-Zeit (in Tagen). Wenn der Widerstandswert mit der Zeit nicht weiter ansteigt (gemessen über Tage), betrachten Sie die Zelle als Barriere. NOTW: Das monolayerige BHS-Modell von bEnd.3-Zellen wird erfolgreich konstruiert, indem bEND.3-Zellen mit den Parametern in dieser Studie für etwa 6 Tage kultiviert werden. Die TEER des bEnd.3-Zell-Monolayer-Modells reichte von 16,49 ± 2,12Ωcm2 bis 27,59 ± 1,50 Ωcm2 innerhalb von 6 Tagen (n=8, Mittelwert ± SD).</li>
</ol>5. Barrierezerstörung und statistische Analyse
<ol><li>Entsprechend der TEER - Zeitkurve wählen Sie die Wells mit Barrierefunktion aus und teilen sie in die Kontrollgruppe und die CoCl2-Gruppe (n = 4) ein.</li>
	<li>Das Nährmedium und das Nährmedium, das 300 μMCoCl2 (200 μl) enthält, werden in die obere Kammer der Kontrollgruppe bzw. der CoCl2-Gruppegegeben .</li>
	<li>Die Widerstandswerte der Kontroll- und CoCl2-Gruppen werden nach 12 h und 24 h Inkubation bei 37 °C mit dem in Schritt 4 beschriebenen Verfahren ermittelt.</li>
	<li>Verwenden Sie kommerzielle Software, um den Trend der TEER-Werte der Barriere von Zellen abzubilden, die mit oder ohne 300 μM CoCl2 kultiviert wurden.</li>
	<li>Verwenden Sie eine statistische Analysesoftware, um den Unterschied in den Resistenzwerten zwischen CoCl2-behandelten Zellen und normalen Zellen zu analysieren (n=4, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).</li>
</ol>

Messung des transendothelialen Widerstands zur Beurteilung der Integrität der Zellbarriere

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<li>Sivandzade, F., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+blood-brain+barrier+modeling%3A+A+review+of+modern+and+fast-advancing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1667-1681 (2018).</li>
<li>Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocultures+of+primary+porcine+brain+capillary+endothelial+cells%3A+Still+a+functional+in+vitro+model+for+the+blood-brain-barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Monocultures of primary porcine brain capillary endothelial cells: Still a functional in vitro model for the blood-brain-barrier.</a> J Control Release. 285, 172-177 (2018).</li>
<li>Srinivasan, B., Kolli, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial%2Ftransendothelial+electrical+resistance+%28TEER%29+to+measure+the+integrity+of+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Blood-Brain+Barrier%22%5BJournal%5D)">Transepithelial/transendothelial electrical resistance (TEER) to measure the integrity of blood-brain barrier.</a> Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).</li>
<li>Liang, Y., Yoon, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+sensors+for+blood-brain+barrier+%28BBB%29+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Actuators+Rep%22%5BJournal%5D)">In situ sensors for blood-brain barrier (BBB) on a chip.</a> Sens Actuators Rep. 3, 100031(2021).</li>
<li>Ozgür, B., Helms, H. C. C., Tornabene, E., Brodin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+increases+expression+of+selected+blood-brain+barrier+transporters+GLUT-1%2C+P-gp%2C+SLC7A5+and+TFRC%2C+while+maintaining+barrier+integrity%2C+in+brain+capillary+endothelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Hypoxia increases expression of selected blood-brain barrier transporters GLUT-1, P-gp, SLC7A5 and TFRC, while maintaining barrier integrity, in brain capillary endothelial monolayers.</a> Fluids Barriers CNS. 19 (1), (2022).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Das Gehirn ist eines der am weitesten entwickelten Körperorgane und steuert eine Vielzahl komplizierter physiologischer Prozesse, darunter Gedächtnis, Kognition, Hören, Riechen und Bewegung27. Das Gehirn ist eines der kompliziertesten und zugleich am meisten erkrankten Organe des menschlichen Körpers. Das Auftreten vieler Erkrankungen des Zentralnervensystems zeigt eine wachsende Tendenz von Jahr zu Jahr, was auf Faktoren wie Luftverschmutzung, unregelmäßiges Essverhalten und andere Faktoren zurüc...

BHS ist eine einzigartige biologische Schnittstelle zwischen Blutkreislauf und Nervengewebe, die aus vaskulären Endothelzellen, Perizyten, Astrozyten, Neuronen und anderen zellulären Strukturen besteht1. Der Fluss von Ionen, Chemikalien und Zellen zwischen Blut und Gehirn wird durch diese Barriere streng reguliert. Diese Homöostase schützt das Nervengewebe vor Toxinen und Krankheitserregern und ermöglicht gleichzeitig die entsprechende Funktion der Nerven des Gehirns 2,3. Die Aufrechterhaltung der Integrität der BHS kann die Entwicklung und das Fortschreiten von Störungen, die das zentrale Nervensystem betreffen, wie z. B. neuronale Dysfunktion, Ödeme und Neuroinflammation, wirksam verhindern4. Die einzigartigen physiologischen Eigenschaften der BHS verhindern jedoch, dass mehr als 98 % der niedermolekularen Medikamente und 100 % der makromolekularen Arzneimittel in das zentrale Nervensystem gelangen5. Daher ist es für die Erzielung der therapeutischen Wirksamkeit unerlässlich, die Penetration von Medikamenten durch die BHS während der Entwicklung von Medikamenten für das zentrale Nervensystem zu erhöhen 6,7. Auch wenn das Computersimulations-Screening von Substraten die Wahrscheinlichkeit, dass Wirkstoffkandidaten die BHS überschreiten, erheblich erhöht hat, werden immer noch zuverlässige und erschwingliche In-vitro-/In-vivo-BHS-Modelle benötigt, um den Anforderungen der wissenschaftlichen Forschung gerecht zu werden8.
Eine schnelle und kostengünstige Technik für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening ist das In-vitro-Modell 9. Um die grundlegenden Prozesse der Auswirkungen von Medikamenten auf die BHS-Funktion und ihre Rolle bei der Entstehung und dem Fortschreiten von Krankheiten zu beleuchten, wurde eine Reihe vereinfachter In-vitro-BHS-Modelle erstellt. Gegenwärtig sind die üblichen In-vitro-BHS-Modelle die Monolayer-, Co-Kultur-, dynamischen und mikrofluidischen Modelle 10,11,12, die aus vaskulären Endothelzellen und Astrozyten, Perizyten oder Mikroglia 13,14 aufgebaut sind. Obwohl 3D-Zellkulturen eher der physiologischen Struktur von BHS15 entsprechen, ist ihre Anwendung als Mittel zum Wirkstoffscreening auf BHS immer noch durch ihr kompliziertes Design und ihre unterdurchschnittliche Reproduzierbarkeit eingeschränkt. Im Gegensatz dazu wird das Monolayer-In-vitro-Modell am häufigsten zur Erforschung der BHS verwendet und ist für die Bestimmung der Expression von Membrantransportern und Tight-Junction-Proteinen in bestimmten Zellen geeignet.
Die Messung des elektrischen Transmembranwiderstands (TEER) ist eine Technik zur Bewertung und Überwachung der Zellschicht über dem Widerstand und zur Bewertung der Zellintegrität und Durchlässigkeit der Barriere. Durch gleichzeitiges Einführen von zwei Elektroden in das Wachstumsmedium oder die Pufferlösung auf beiden Seiten der Monoschicht ist es möglich, den Wechselstrom oder die elektrische Impedanz durch die kompakte Schicht16,17 der Zelle zu messen. Um festzustellen, ob das In-vitro-BHS-Modell ordnungsgemäß erstellt wurde, wird in der Regel die Messung der TEER als Goldstandard verwendet18. Auf der anderen Seite kann der Trend der medikamentösen Wirkung auf die BHS-Permeabilität genau vorhergesagt werden, indem die Änderung des elektrischen Widerstands der Zellschicht nach Arzneimittelbeteiligung gemessen wird19. Zum Beispiel entdeckten Feng et al., dass Catalpol (das primäre aktive Monomer von Rehmanniae) die Lipopolysaccharid-induzierte Herunterregulierung von Tight-Junction-Proteinen in der BHS effektiv umkehren und den TEER-Wert der Endothelzellschicht des Mäusegehirns20 erhöhen kann.
Die neuroinflammatorische Reaktion ist in der Regel die Hauptursache für ein Ungleichgewicht der BHS-Homöostase21. Die hypoxische Behandlung zur Induktion neuroinflammatorischer Schäden ist die Hauptmethode zur Zerstörung der Blut-Hirn-Schranke, hauptsächlich mit physikalischen Methoden und chemischen Reagenzien. Ersteres verwendet in erster Linie einen Drei-Gas-Inkubator, um den Sauerstoffgehalt in der Zellwachstumsumgebung zu variieren, um hypoxische Bedingungen zu simulieren22, während letzteres durch künstliches Einbringen von Desoxyreagenzien wie CoCl2in das Zellkulturmedium23 erreicht wird. Die Zellen bleiben in einem sauerstoffarmen Zustand, wenn Fe2+ durch Co2+ im Häm ersetzt wird. Wenn Fe2+ in der katalytischen Gruppe durch Co2+ ersetzt wird, wird die Aktivität der Prolinhydroxylase und der Aspartathydroxylase gehemmt, was zu einer Akkumulation des Hypoxie-induzierbaren Faktors-1α (HIF-1α)24 führt. Bei anhaltender Hypoxie löst die Dephosphorylierung von HIF-1α im Zytoplasma den Zelltod aus und aktiviert den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor, der letztendlich die Gefäßpermeabilität erhöht. In früheren Studien 25,26 wurde gut gezeigt, dass Hypoxie die Expression von endothelialen Tight-Junction-Proteinen signifikant reduzieren kann, um die Permeabilität der BHS zu erhöhen. In dieser Studie wurde die Zeit-Widerstands-Kurve von bEnd.3-Zellen gemessen, die in 24-Well-Platten ausgesät wurden, um ein einfaches BHS-Modell zu erstellen. Mit Hilfe dieses Modells haben wir die Veränderungen der Zell-TEER nach CoCl2-Intervention charakterisiert, um ein Zellmodell zu konstruieren, das für das Screening von Medikamenten auf BHS-Schutz verwendet werden kann.

<table><tbody><tr><td>24-Well-Transwell-Platte</td><td>Corning (Corning 3470, 0,33 cm2, 0,4 & micro; m)</td><td>10522023</td><td></td></tr><tr><td>75 % Ethanol</td><td>ChengDu Chron Chemicals Co,. Ltd</td><td>2023052901</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte</td><td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd</td><td>220412-078-B</td><td></td></tr><tr><td>bEnd.3 Zellen</td><td>Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd</td><td>CL0049</td><td></td></tr><tr><td>Zellzählkit-8 (CCK-8)</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>BG0025</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschale (100 mm)</td><td>Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td><td>1192022</td><td></td></tr><tr><td>Cobalt Chloride (CoCl2)</td><td>Sigma</td><td>15862</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>PYG0040</td><td></td></tr><tr><td>modifiziertes Adlermedium von Dulbecco (1x)</td><td>Gibco ThermoFisher Scientific</td><td>8121587</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco ThermoFisher Scientific</td><td>2166090RP</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism Software</td><td>GraphPad Software</td><td>9.0.0(121)</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (Enthält Kollagen IV)</td><td>MedChemexpress</td><td>HY-K6002</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader</td><td>Molekulare Geräte</td><td>SpectraMax iD5</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 8 Software</td><td>OriginLab Corporation</td><td>v8.0724(B724)</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>17C18B16</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, 1x)</td><td>Gibco ThermoFisher Scientific</td><td>8120485</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhypochlorit</td><td>ChengDu Chron Chemicals Co,. Ltd</td><td>2022091501</td><td></td></tr><tr><td>Transmembran-Widerstandsmessgerät</td><td>World Precision Instruments LLC</td><td>VOM3 (Version 1.6)</td><td></td></tr></tbody></table>

aufzeichnung der funktionellen barriereintegrität auf bend.3 vaskulären endothelzellen mittels transendothelialer elektrischer widerstandsdetektion

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist eine dynamische physiologische Struktur, die aus mikrovaskulären Endothelzellen, Astrozyten und Perizyten besteht. Durch die Koordination der Wechselwirkung zwischen dem eingeschränkten Transit von Schadstoffen, der Nährstoffaufnahme und der Metaboliten-Clearance im Gehirn ist die BHS für die Aufrechterhaltung der Homöostase des Zentralnervensystems unerlässlich. Die Erstellung von In-vitro-Modellen der BHS ist ein wertvolles Werkzeug zur Erforschung der Pathophysiologie neurologischer Erkrankungen und zur Entwicklung pharmakologischer Behandlungen. Diese Studie beschreibt ein Verfahren zur Erstellung eines in vitro Monolayer-BHS-Zellmodells durch Aussaat von bEnd.3-Zellen in die obere Kammer einer 24-Well-Platte. Um die Integrität der Zellbarrierefunktion zu beurteilen, wurde das konventionelle Epithelzellvoltmeter verwendet, um den transmembranellen elektrischen Widerstand von normalen Zellen und CoCl 2-induzierten hypoxischen Zellen in Echtzeit aufzuzeichnen. Wir gehen davon aus, dass die oben genannten Experimente effektive Ideen für die Erstellung von In-vitro-Modellen für BHS und Medikamente zur Behandlung von Erkrankungen des zentralen Nervensystems liefern werden.

Dieses Protokoll ermöglichte die Aufzeichnung von Änderungen der Widerstandswerte von Zellen gemäß den im transendothelialen Widerstandsmessgerät eingestellten Parametern. Die Viabilität von bEnd.3-Zellen (Anzahl der lebenden Zellen), die mit unterschiedlichen Konzentrationen von CoCl2 behandelt wurden, wurde mittels CCK-8-Assay untersucht. Eine größere Zellschädigung durch CoCl2 wurde durch eine geringere Zelllebensfähigkeit repräsentiert. Wir fanden heraus, dass 300 μM CoCl2 in vitro sign...

Dieses Protokoll beschreibt ein zuverlässiges und effizientes In-vitro-Modell der Blutschranke des Gehirns. Die Methode verwendet zerebrale vaskuläre Endothelzellen der Maus bEnd.3 und misst den elektrischen Widerstand der Transmembran.

Aufzeichnung der funktionellen Barriereintegrität auf bEnd.3 vaskulären Endothelzellen mittels transendothelialer elektrischer Widerstandsdetektion

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

Aktuelle Studien verwenden in der Regel Permeabilitätstests und die damit verbundene Proteinexpression, um die Genauigkeit des TEER-Nachweises zu überprüfen. Das BHS-Modell von Monolayer-Zellen ist für das Wirkstoff-Screening weniger effektiv, und die Verwendung von mehr Zellen erschwert die Konstruktion des Modells. Das Protokoll dieser Studie ist relativ einfach, da das nicht-invasive Verfahren es ermöglicht, die Zellproben nach dem TEER-Nachweis in anderen Experimenten zu verwenden.Der Nachweis von TEER zur Beurteilung der Permeabilität von Zellmodellen kann das Screening von Medikamenten zur Behandlung und Prävention des zentralen Nervensystems beschleunigen, um die Erfolgsrate der Entwicklung neuer Medikamente zu erhöhen. In Zukunft werden wir die Expression des Tight-Junction-Proteins in Zellen des oberen Kompartiments der Brustwand nachweisen, um zu überprüfen, ob TEER-Testergebnisse die Integrität der BHS-Barrierefunktion effektiv darstellen können.

barrier-functional-integrity-recording-on-bend3-vascular-endothelial

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Eine Echtzeit-Elektrische Impedanz basierte Technik zur Invasion von Endothelzellen Monolayer von Krebs Zellen zu messen

Dieses Video zeigt eine Methode zur Bestimmung des transendothelialen elektrischen Widerstands (TEER) in mikrovaskulären Endothelzellen des Mausgehirns in vitro. Ein hoher TEER-Wert deutet auf intakte Endothelzellverbindungen hin, während die Zugabe von aktivierten T-Zellen den TEER-Wert senkt, was eine Störung der Verbindungsbarriere widerspiegelt.

Bewertung des transendothelialen elektrischen Widerstands in einem in vitro Blut-Hirn-Schrankenmodell

Die Organische elektrochemischen Transistor mit lebenden Zellen integriert und zur Ionenfluss über den Magen-Darm-Epithel-Barriere zu überwachen. In dieser Studie wurde eine Erhöhung des Ionenflusses, um eine Unterbrechung der tight junctions, die durch die Anwesenheit der Calcium-Chelatbildner EGTA (Ethylenglykol-bis (beta-aminoethylether)-N, N, N ', N'-Tetra-Essigsäure induzierten verwandten Säure), wird gemessen.

Erkundung der Barrier Gewebestörung mit einem organischen Transistor Elektro

Dieses Protokoll Bewertungen Elektro Zell-Substrat-Impedance Sensing, eine Methode zur Quantifizierung der Zellhaftung, Proliferation, Motilität und zellulären Antworten auf pharmakologische und toxische Stimuli erfassen und analysieren die Impedanzspektrum von adhärenten Zellen. Nachweis endothelialer Permeabilität und Bewertung der Zell-Zell-und Zell-Substrat-Kontakte sind hervorgehoben.

Elektro-Zell-Substrat-Impedance Sensing zur Quantifizierung der endothelialen Proliferation, Barrierefunktion und Beweglichkeit

Hier beschreiben wir ein in vitro Mausmodell der Blut-Hirn-Schranke, das Impedanzzellspektroskopie verwendet, mit einem Schwerpunkt auf den Auswirkungen auf die Integrität und Permeabilität von Endothelzellen bei Interaktion mit aktivierten T-Zellen.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell der Blut-Hirn-Schranke Mit Impedanzspektroskopie: Ein Fokus auf T-Zell-Endothelzellinteraktion

Diese Publikation beschreibt die Herstellung von einer Orgel-on-Chip-Gerät mit integrierten Elektroden für die direkte Quantifizierung der Transendothelial elektrischen Widerstand (TEER). Für die Validierung die Blut - Hirn-Schranke wurde innerhalb dieses Gerät mikrofluidischen nachgeahmt und seiner Barrierefunktion wurde überwacht. Die vorgestellten Methoden zur Elektrode Integration und direkte Quantifizierung der TEER sind allgemein anwendbar.

Herstellung und Validierung von einer Orgel-on-Chip-System mit integrierten Elektroden, direkt Transendothelial elektrischen Widerstand zu quantifizieren

Hier zeigen wir, wie man ein kostengünstiges Volt-Amperemeter mit programmierbarer Ausgangsfrequenz aufstellt, das mit handelsüblichen Essstäbchenelektroden für transepitheliale/endotheliale elektrische Widerstandsmessungen verwendet werden kann.

Ein einfacher Ansatz zur Durchführung von TEER-Messungen mit einem selbst gefertigten Volt-Amperemeter mit programmierbarer Ausgangsfrequenz

Dieses Protokoll veranschaulicht einen In-vitro-Endothelzell-Transzytose-Assay als Modell zur Bewertung der Permeabilität der inneren blutretinalen Barriere durch Messung der Fähigkeit menschlicher retinaler mikrovaskulärer Endothelzellen, Meerrettichperoxidase über Zellen in caveolae-vermittelten transzellulären Transportprozessen zu transportieren.

Endothelzell-Transzytose-Assay als In-vitro-Modell zur Beurteilung der Permeabilität der inneren Blut-Retina-Barriere

Hier demonstrieren wir die Technik der Verwendung impedanzbasierter Biosensoren: ECIS und cellZscope zur Messung der Endothelbarriere des Gehirns. Wir beschreiben die Vorbereitung und Technik des Hinzufügens verschiedener Stimuli zu einem in vitro-Modell des Gehirnendothels. Wir messen, erfassen und analysieren die Ergebnisse repräsentativ.

Messung von Veränderungen der Integrität der endothelialen Barriere des Gehirns mit zwei impedanzbasierten Biosensoren als Reaktion auf Krebszellen und Zytokine

Wir stellen eine Methode zum Sammeln electrocorticographic Signale für die Forschung von Menschen, die sich einer invasiven Monitoring-Epilepsie sind. Wir zeigen, wie das BCI2000 Software-Plattform für die Datenerfassung, Signalverarbeitung und Stimulus Präsentation zu nutzen. Insbesondere zeigen wir, Sigfried, ein BCI2000-basiertes Tool für die Echtzeit-funktionelles Brain Mapping.

Aufnahme Menschliche Electrocorticographic (ECoG) Signale für neurowissenschaftliche Forschung und Real-time Funktionelle kortikale Mapping

Erfahren Sie die Messung des transendothelialen elektrischen Widerstands an bEnd.3-Zellen zur Bewertung der Blut-Hirn-Schranke. Diese nicht-invasive Methode ermöglicht die Beschleunigung von Arzneimittelscreenings für das zentrale Nervensystem.

Aufzeichnung der funktionellen Barriereintegrität auf bEnd.3 vaskulären Endothelzellen mittels transendothelialer elektrischer Widerstandsdetektion (Video) | JoVE Journal

Aufzeichnung der funktionellen Barriereintegrität auf bEnd.3 vaskulären Endothelzellen mittels transendothelialer elektrischer Widerstandsdetektion

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