Kristallisations- und In-situ-Raumtemperatur-Datenerfassung mit der Kristallisationsanlage in Harwell und der Beamline VMXi, Diamantlichtquelle
8. März 2024
Wir präsentieren ein Protokoll für die Kristallisation von Proteinen unter Verwendung der Kristallisationsanlage im Forschungskomplex in Harwell und die anschließende in-situ-Röntgenkristallographie-Datenerfassung von Kristallen innerhalb der Platten an der Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) Beamline von Diamond. Wir beschreiben Probenanforderungen, Kristallisationsprotokolle und Richtlinien für die Datenerfassung.
Das Verständnis der dreidimensionalen Strukturen von Proteinen ist die Grundlage für die Entwicklung von Medikamenten, die Biotechnologie und unser Verständnis vieler verschiedener Krankheiten. VMXI bestimmt Proteinstrukturen ohne Kryo-Kühlung, also viel näher an ihren natürlichen Temperaturen. VMXI misst auch Beugungsdaten von Proteinkristallen, während sie sich noch in ihren Kristallisationsplatten befinden, um Schäden durch mechanische Handhabung zu vermeiden.
In Zukunft wollen wir den unglaublichen Durchsatz von VMXI nutzen, um große Populationen von Kristallen zu erforschen, um viele verschiedene Strukturzustände zu identifizieren, anstatt die einzelne Struktur, die die Menschen heute oft erhalten. Wir wollen auch die Entwicklung von Medikamenten vorantreiben und das Fragment-Screening und die Optimierung innerhalb von Kristallisationsplatten durchführen. Ein neuer Ansatz, der enorm vielversprechend ist.
Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Proteinkristallisation und die in-situ-Röntgenkristallographiedatenakquisition vor. Die Methode nutzt die Messlinie VMXi, um Proteinstrukturen bei natürlichen Temperaturen zu analysieren und dadurch das Verständnis des Proteinverhaltens zu verbessern.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Strukturbiologie
- Kristallographie
- Proteinaufreinigung
Hintergrund
- Das Verständnis von Proteinstrukturen ist entscheidend für die Arzneimittelentwicklung und die Erforschung von Krankheiten.
- Herkömmliche Methoden beinhalten oft Kryokühlung, die den Zustand der Proteine verändern kann.
- VMXi ermöglicht die Datensammlung direkt aus Kristallisationsplatten.
- Dieser Ansatz minimiert mechanische Beschädigungen der Kristalle durch Handhabung.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls für eine effiziente Protein-Kristallisation.
- Nutzung der Fähigkeiten von VMXi für die strukturelle Analyse im Hochdurchsatzverfahren.
- Untersuchung mehrerer struktureller Zustände von Proteinen, um tiefere Einblicke zu gewinnen.
Verwendete Methoden
- Kristallisation von Proteinen in NC2-Platten.
- Nutzung des ISPyB-Systems zur Verwaltung von Anträgen und Sendungen.
- Datenerfassung mittels der VMXi-Beamline bei 20 Grad Celsius.
- Automatisierte Bildaufnahme und Analyse von Kristallisationsansätzen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Sammlung von Beugungsdaten ohne Kryokühlung.
- Identifizierung kristalliner Objekte mittels CHiMP-Analyse.
- Effizientes Management von Proben-Gruppen und Datensammlungsprozessen.
- Verbesserte Durchsatzleistung zur Erforschung vielfältiger Proteinstrukturen.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll ermöglicht die Hochdurchsatz-Kristallisation und -Analyse von Proteinen.
- Der Ansatz von VMXi bietet erhebliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden.
- Diese Methode verspricht Fortschritte für die zukünftige Arzneimittelentwicklung und die Forschung in der Strukturbiologie.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Dank der In-situ-Kristallographie bei Raumtemperatur an der VMXi können Proteine schnell und mit hohem Durchsatz strukturell untersucht werden, was die frühe Arzneimittelentwicklung und die Absicherung von Wirkmechanismen unterstützt. Die direkte Datenerfassung aus Kristallisationsplatten minimiert artefaktbehaftete Probenvorbereitungen und beschleunigt die Rückmeldung zu Kristallisationsergebnissen, wodurch die Vorhersagegenauigkeit in der strukturbasierten Forschung und Entwicklung erhöht wird. Diese Methodik ist darauf ausgelegt, die Zielvalidierung und das fragmentbasierte Screening zu beschleunigen, wobei der weltweite Fernzugriff die strategische Weiterentwicklung umfangreicher Wirkstoffportfolios ermöglicht.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte strukturelle Analyse von Proteinen bei nahezu physiologischen Temperaturen zur funktionellen Zielvalidierung.
- Unterstützt schnelles Hypothesentesten, indem unmittelbares Feedback zu Kristallisation und Ligandenbindungsstatus bereitgestellt wird.
- Erleichtert die mechanistische Risikominimierung, indem multiple konformationelle Zustände innerhalb von Kristallpopulationen erfasst werden.
- Erhöht die Vorhersagesicherheit für die nachgeschaltete Wirkstoffentwicklung, indem kryoinduzierte Artefakte minimiert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte Kristallisationssysteme für das Fragment-Screening und die Optimierung in Mikrotiterplatten vor.
- Standardisiert die Bildgebung und die Datenerfassungsabläufe mithilfe automatisierter, auf maschinellem Lernen basierender Kristallidentifizierung.
- Ermöglicht reproduzierbare, quantitative strukturelle Ergebnisse für eine zuverlässige Verbindungsbewertung.
- Lässt sich auf Hochdurchsatz-Screenings skalieren, mit einer warteschlangenbasierten Datenerfassung und automatischer Datenzusammenführung.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Erfassung struktureller Daten unter krankheitsrelevanten Bedingungen, indem kryogene Artefakte vermieden werden.
- Gewährleistet eine lückenlose Übertragung von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem serielle Kristallographie unterstützt wird.
- Ermöglicht eine risikoadjustierte Weiterentwicklung durch schnelle Beurteilung der Ligandenbindung und Proteindynamik.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert den Prozess von der frühen Entdeckung bis hin zur Identifizierung von Leitverbindungen und unterstützt die strukturbasierte Wirkstoffgestaltung sowie die Fragment-Screening-Methodik innerhalb eines einheitlichen, remote zugänglichen Workflows.
- Entdeckungsbasierte Biologie: Beschleunigt die Hypothesenprüfung und Klärung von Wirkwegen, indem schnelle, artefaktfreie Strukturbestimmung ermöglicht wird.
- Screening: Stellt assaysbereite, reproduzierbare Kristallisationsplattformen mit automatisierter Bildgebung und Datenerfassung bereit.
- Analytik: Bietet quantitative Beugungsdaten und automatisierte Datenzusammenführung für robuste vergleichende Analysen.
- Translationale Forschung: Unterstützt die präklinische Kontinuität durch Erfassung von Proteinstrukturen unter native-ähnlichen Bedingungen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine skalierbare, remote zugängliche Infrastruktur für wiederholte strukturelle Untersuchungen über verschiedene Programme hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen bei der Target-Validierung.
- Operationaler Wert: Standardisiert und automatisiert Kristallisations-, Bildgebungs- und Datenerfassungsabläufe.
- Strategischer Wert: Ermöglicht schnellere Go/No-Go-Entscheidungen und kapitaleffizientere Portfoliofortschritte.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt risikoadjustierte Priorisierung und zügige Weiterentwicklung strukturell validierter Targets.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Protein-Kristallisation und der Interpretation strukturbiologischer Daten.
- Benötigt Zugang zu automatisierter Bildgebung, kristallbasierter Identifizierung mittels maschinellen Lernens und Synchrotron-Strahlrohr-Infrastruktur.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Teams hinweg für die Probennachverfolgung, Datenverwaltung und Fernzugriffsprotokolle voraus.
- Die Anpassung an unterschiedliche Proteinziele und Kristallisationsbedingungen kann eine Optimierung der Protokolle erfordern.
- Die Durchsatzrate und Datenqualität hängen von der Probenvorbereitung und der Verträglichkeit der Platten mit automatisierten Systemen ab.
