Name: Einstufige Isolierung extrazellulärer Vesikel aus großvolumigen Proben mit einem gegabelten mikrofluidischen A4F-Gerät (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Lernen Sie die Isolierung extrazellulärer Vesikel aus großvolumigen Biofluiden mit einem mikrofluidischen A4F-Gerät. Diese Methode ermöglicht kontinuierlichen Fluss und Automatisierung für biomedizinische Anwendungen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken allen Spendern, die an dieser Studie teilgenommen haben, den Mitarbeitern der lettischen Genomdatenbank für die Bereitstellung der Proben. Das Institut für Festkörperphysik der Universität Lettland als Exzellenzzentrum hat eine Förderung aus dem Horizon 2020-Rahmenprogramm H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 739508, Projekt CAMART2, erhalten. Diese Arbeit wurde vom Lettischen Wissenschaftsrat Projekt-Nr. lzp-2019/1-0142 und Projektnummer: lzp-2022/1-0373.

Mikrofluidisches Gerät zur kontinuierlichen Isolierung extrazellulärer Vesikel aus menschlichem Urin

<ol><li>Colombo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+secretion%2C+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).</li>
<li>Tricarico, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+biogenesis+of+shed+microvesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Small+GTPases%22%5BJournal%5D)">Biology and biogenesis of shed microvesicles.</a> Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).</li>
<li>Yáñez-Mó, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> J Extracell Vesicles. 4 (1), 27066(2015).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+an+emerging+drug+delivery+system+for+cancer+treatment%3A+Current+strategies+and+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as an emerging drug delivery system for cancer treatment: Current strategies and recent advances.</a> Biomed Pharmacother. 153, 113480(2022).</li>
<li>Royo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+separation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%3A+Results+of+a+Worldwide+Survey+Performed+by+the+ISEV+Rigor+and+Standardization+Subcommittee%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Methods for separation and characterization of extracellular vesicles: Results of a Worldwide Survey Performed by the ISEV Rigor and Standardization Subcommittee.</a> Cells. 9 (9), 1955(2020).</li>
<li>Sidhom, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+exosomal+isolation+methods%3A+Is+size+exclusion+chromatography+the+best+option%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">A review of exosomal isolation methods: Is size exclusion chromatography the best option.</a> Int J Mol Sci. 21 (18), 6466(2020).</li>
<li>Reshi, Q. U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+extracellular+vesicles+%28EVs%29+using+benchtop+size+exclusion+chromatography+%28SEC%29+columns%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of extracellular vesicles (EVs) using benchtop size exclusion chromatography (SEC) columns.</a> Methods Mol Biol. 2273, 201-206 (2021).</li>
<li>Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+isolation+and+separation+techniques+for+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles.</a> J Chromatogr A. 1636, 461773(2021).</li>
<li>Priedols, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifurcated+asymmetric+field+flow+fractionation+of+nanoparticles+in+PDMS-free+microfluidic+devices+for+applications+in+label-free+extracellular+vesicle+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Bifurcated asymmetric field flow fractionation of nanoparticles in PDMS-free microfluidic devices for applications in label-free extracellular vesicle separation.</a> Polymers. 15 (4), 789(2023).</li>
<li>Zhang, H., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric-flow+field-flow+fractionation+technology+for+exomere+and+small+extracellular+vesicle+separation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Asymmetric-flow field-flow fractionation technology for exomere and small extracellular vesicle separation and characterization.</a> Nat Protoc. 14 (4), 1027-1053 (2019).</li>
<li>Talebjedi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+microfluidics+for+extracellular+vesicle+isolation+and+characterization%3A+Potential+use+for+standardized+embryo+quality+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Exploiting microfluidics for extracellular vesicle isolation and characterization: Potential use for standardized embryo quality assessment.</a> Front Vet Sci. 7, 620809(2020).</li>
<li>van Meer, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+absorption+by+PDMS+in+the+context+of+drug+response+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays.</a> Biochem Biophys Res Commun. 482 (2), 323-328 (2017).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+extracellular+vesicles+isolation+and+separation%3A+Current+techniques%2C+pending+questions+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications.</a> Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).</li>
<li>Bussooa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+oxygen+levels+within+thermoplastic+Organ-on-Chip+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%3A+X%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of oxygen levels within thermoplastic Organ-on-Chip devices.</a> Biosensors and Bioelectronics: X. 11, 100198(2022).</li>
<li>Tang, L., Lee, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+facile+route+for+irreversible+bonding+of+plastic-PDMS+hybrid+microdevices+at+room+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A facile route for irreversible bonding of plastic-PDMS hybrid microdevices at room temperature.</a> Lab Chip. 10 (10), 1274-1280 (2010).</li>
<li>Borda, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformable+neural+interface+based+on+off-stoichiometry+thiol-ene-epoxy+thermosets%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Conformable neural interface based on off-stoichiometry thiol-ene-epoxy thermosets.</a> Biomaterials. 293, 121979(2023).</li>
<li>Sandström, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+injection+molding+and+direct+covalent+bonding+of+OSTE%2B+polymer+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Reaction injection molding and direct covalent bonding of OSTE+ polymer microfluidic devices.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 25 (7), 075002(2015).</li>
<li>Sticker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-ene+based+polymers+as+versatile+materials+for+microfluidic+devices+for+life+sciences+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Thiol-ene based polymers as versatile materials for microfluidic devices for life sciences applications.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 12 (9), 10080-10095 (2020).</li>
<li>Bajo-Santos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+isolation+from+large+volume+samples+using+a+polydimethylsiloxane-free+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles isolation from large volume samples using a polydimethylsiloxane-free microfluidic device.</a> Int J Mol Sci. 24 (9), 7971(2023).</li>
<li>Claridge, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+extracellular+vesicle+therapeutics%3A+Challenges%2C+considerations%2C+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of extracellular vesicle therapeutics: Challenges, considerations, and opportunities.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 734720(2021).</li>
<li>Rezaie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+on+exosomes+application+in+clinical+trials%3A+Perspective%2C+questions%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">Review on exosomes application in clinical trials: Perspective, questions, and challenges.</a> Cell Commun Signal. 20 (1), 145(2022).</li>
<li>Aragón, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+urinary+tract+microbiome+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Urol+Focus%22%5BJournal%5D)">The urinary tract microbiome in health and disease.</a> Eur Urol Focus. 4 (1), 128-138 (2018).</li>
</ol>

A.A., G.M. und R.R. sind Gründer, Vorstandsmitglieder und Anteilseigner von Cellbox Labs, LLC

Das vorgestellte mikrofluidische Gerät bietet eine vielversprechende Methode zur Isolierung und Extraktion von EVs aus biologischen Flüssigkeiten, die einige der kritischen Einschränkungen bestehender Goldstandardmethoden wie UC und SEC12 behebt. UC und SEC sind dafür bekannt, arbeitsintensiv und zeitaufwändig zu sein und unter geringer Ausbeute zu leiden, wodurch sie für Anwendungen mit hohem Durchsatz, bei denen große Mengen an Elektrofahrzeugen benötigt werden, weniger geeignet sind21,22. Im Gegensatz dazu kann das beschriebene mikrofluidische Gerät kontinuierlich ein beträchtliches Volumen von bis zu 20 ml biologischer Flüssigkeit mit minimalen Benutzereingaben verarbeiten, was es zu einem potenziellen Game-Changer für industrielle oder klinische Umgebungen macht. Einer der Hauptvorteile dieses mikrofluidischen Geräts ist seine Fähigkeit, die EV-Isolierung zu standardisieren und die Reproduzierbarkeit im Vergleich zu herkömmlichen Methoden mit manuellen Schritten zu verbessern. Durch die Reduzierung der Variabilität bei der Herstellung von EV-Isolationsgeräten durch Massenfertigung kann die Leistung des Geräts besser kontrolliert und konsistent werden, was für Anwendungen wie EV-basierte Therapeutika und Diagnostika von entscheidender Bedeutung ist. Darüber hinaus erhöht die Kompatibilität des Geräts mit der Großserienfertigung durch Reaktionsspritzguss geeigneter Substrate sein Potenzial für Skalierbarkeit und breitere Akzeptanz.
Um Reproduzierbarkeit und konsistente Leistung zu gewährleisten, ist ein umfangreiches und klar definiertes Protokoll erforderlich, sowohl für die Herstellung des Chips als auch für seine Verwendung in Experimenten. Der Chip wurde mit Blick auf die Industrialisierung entwickelt. Bei der Geräteherstellung in der Laborumgebung muss jedoch darauf geachtet werden, Blasenbildung zu vermeiden, eine präzise und robuste Verklebung zu gewährleisten und gründliche Tests bei höheren Strömungsgeschwindigkeiten durchzuführen, als sie in realen Experimenten erwartet werden. Diese Vorsichtsmaßnahme ist besonders wichtig für COC-OSTE-Geräte, da sie aufgrund einer erfolglosen Verklebung anfällig für Undichtigkeiten sein können, insbesondere bei höheren Durchflussraten. Da OSTE ein lichtempfindliches Material ist, sollte die Herstellung des Geräts außerdem bei gelbem Licht durchgeführt werden, um eine unnötige UV-Exposition zu vermeiden. Da sich diese Technologie noch in einem Anfangsstadium befindet, sollten Forscher mit verschiedenen Strömungsgeschwindigkeiten experimentieren, um die optimale Einstellung für ihre spezifische Anwendung zu ermitteln, da standardisierte Protokolle für diese neuartige Methode noch festgelegt werden müssen und die Flüssigkeitsviskosität die Wirksamkeit der EV-Isolierung auf der Grundlage unserer Ergebnisse eindeutig beeinflussen kann. Durch die Befolgung dieser Richtlinien und die Bewältigung der Herausforderungen der Standardisierung kann das Potenzial dieses mikrofluidischen Geräts für die EV-Isolierung in verschiedenen Forschungsbereichen und Anwendungen voll ausgeschöpft werden.
Die Methode der EV-Isolierung mit dem mikrofluidischen Gerät ermöglicht umfangreiche Modifikationen und Fehlerbehebungen zur Optimierung der Leistung. Um die Partikeltrennung zu verbessern, können Forscher längere Kanäle, unterschiedliche Membranporositäten und Porendichten sowie veränderte Abmessungen untersuchen. Wenn sich viele große Partikel im kleinen Partikelauslass befinden, kann das Testen einer höheren Puffereintrittsgeschwindigkeit von Vorteil sein, während bei vielen kleinen Partikeln im großen Partikelauslass das Experimentieren mit einem längeren Kanal oder einer Membran mit größeren Poren empfohlen wird. Die Partikelabsorption kann die Anpassung der Strömungsgeschwindigkeiten, Oberflächenmodifikationen und der OSTE-Zusammensetzung oder die Änderung der UV-Belichtungszeit umfassen. Bei Geräten mit Instabilität und Leckage sind die Verringerung der Strömungsgeschwindigkeiten und die Sicherstellung einer ordnungsgemäßen Verklebung entscheidende Schritte. Um Schäden an Elektrofahrzeugen zu minimieren, können Forscher die Fließgeschwindigkeiten reduzieren, nach der Sterilisation des Geräts gründlicher mit PBS waschen und die Verwendung kleinerer Membranporen oder alternativer Formdesigntechniken und -materialien in Betracht ziehen. Durch diese Anpassungen kann das mikrofluidische Gerät fein abgestimmt werden, wodurch sein Potenzial für vielfältige Anwendungen in der EV-Forschung und verwandten Bereichen freigesetzt wird. Um die Leistung des Geräts zu optimieren, könnte außerdem eine vorgelagerte Probencharakterisierung, einschließlich Dichte- und Viskositätsmessungen, integriert werden, um die Durchflussparameter anzupassen. Darüber hinaus muss angesichts der erwiesenen Nichtsterilität von Bioflüssigkeiten23 besonderes Augenmerk auf die Art der Probe gelegt werden. Daher sollte die Sterilisation von Proben vor ihrer Verabreichung in klinischen Anwendungen gebührend in Betracht gezogen werden.
Trotz dieser Herausforderungen birgt das mikrofluidische Gerät ein immenses Potenzial in verschiedenen Forschungsbereichen. Seine Fähigkeit, EVs kontinuierlich aus großen Mengen hochheterogener Proben zu isolieren, öffnet die Tür für die Automatisierung, erleichtert Anwendungen mit hohem Durchsatz und ermöglicht eine tiefergehende Analyse von EVs aus verschiedenen Quellen. Die Integration dieses mikrofluidischen Moduls in verschiedene Geräte, wie z. B. Hohlfaserzell-Bioreaktorkartuschen oder hochauflösende Durchflusszytometer, könnte EV-Anwendungen industriefreundlicher machen und Innovationen in Bereichen wie Arzneimittelverabreichung, Diagnostik und Kosmetik vorantreiben4. Insgesamt stellt dieses mikrofluidische Gerät einen bedeutenden Fortschritt auf dem Gebiet der EV-Forschung dar und bietet eine effiziente und standardisierte Methode zur EV-Isolierung mit vielversprechenden Anwendungen in einem breiten Spektrum von Forschungs- und Industrieumgebungen.

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind aus Zellen gewonnene membrangebundene Partikel, die zwei Haupttypen umfassen: Exosomen (30-200 nm) und Mikrovesikel (200-1000 nm)1. Exosomen bilden sich durch nach innen gerichtete Knospung der endosomalen Membran innerhalb eines multivesikulären Körpers (MVB) und setzen bei Fusion mit der Plasmamembranintraluminale Vesikel (ILVs) in den extrazellulären Raum frei. Im Gegensatz dazu werden Mikrovesikel durch nach außen gerichtete Knospung und Spaltung der Zellmembranerzeugt 2. EVs spielen eine entscheidende Rolle bei der interzellulären Kommunikation, indem sie Proteine, Nukleinsäuren, Lipide und Metaboliten transportieren und den physiologischen Zustand der Zelle widerspiegeln, einschließlich Wachstum, Angiogenese, Metastasierung, Proliferation und Therapieresistenz3. Infolgedessen haben sie sich als vielversprechende Biomarker und therapeutische Ziele für Krankheiten, einschließlich Krebs, herausgestellt, was ihr Potenzial in der Diagnostik und in Arzneimittelverabreichungssystemen unterstreicht4.
Um EVs in der Krankheitsdiagnostik und -therapie voll auszuschöpfen, ist eine effiziente Isolierung aus verschiedenen Bioflüssigkeiten von entscheidenderBedeutung 5. Zu den gängigen Methoden gehören Ultrazentrifugation (UC), Dichtegradientenzentrifugation, Größenausschlusschromatographie (SEC), Filtration und Immunisolierung6. UC ist eine weit verbreitete Technik, kann aber Partikel ähnlicher Dichte liefern, die keine EVs sind und EV-Aggregate erzeugen können7. SEC hat aufgrund seiner Fähigkeit, Proben mit höherer Reinheit zu liefern, durch den Ausschluss von Partikeln auf der Grundlage der Größe und nichtder Dichte 8 an Popularität gewonnen. Eine sorgfältige Auswahl der geeigneten Porengröße für die SEC-Säule und die Optimierung der Chromatographiebedingungen sind jedoch unerlässlich, um die Co-Isolierung unerwünschter Partikel wie Chylomikronen und Lipoproteine niedriger Dichtezu minimieren 8. Trotz ihrer Wirksamkeit sind beide Methoden zeitaufwändig und schwierig zu automatisieren, insbesondere bei großvolumigen Proben wie Zellmedien oder Urin, was ihre Skalierbarkeit für industrielle Anwendungen einschränkt9.
In den letzten Jahren hat sich die asymmetrische Feldflussfeldfraktionierung (A4F) zu einer leistungsstarken Trenntechnik für die größen- und auftriebsbasierte Partikeltrennung im Mikro- und Nanometerbereich entwickelt10. Das Funktionsprinzip von A4F beruht auf einem mikrofluidischen Kanal, der an seiner Basis mit einer porösen Membran ausgestattet ist und eine Kraft erzeugt, die auf die Membran ausgeübt wird, die als Cross-Flow10 bezeichnet wird. In Kombination mit der systemeigenen Brownschen Bewegung und Poiseuille-Strömung ermöglicht die Querströmung eine effiziente Partikeltrennung aufgrund der unterschiedlichen Partikelposition innerhalb der Strömungsdynamik11. Trotz der Vorteile ist dieses Verfahren auf Probenvolumina im Mikroliterbereich12 beschränkt und erfordert einen zusätzlichen Fokussierungsschritt, wodurch die Dauer des Prozessesverlängert wird 10.
In den letzten zehn Jahren hat die Mikrofluidik als Werkzeug für eine schnelle, effiziente und klinisch zuverlässige EV-Trennung an Bedeutung gewonnen13. Die meisten mikrofluidischen Methoden, die für die EV-Trennung entwickelt wurden, sind jedoch für kleinvolumige, hochkonzentrierte EV-Proben optimiert oder hängen von komplexen Trennverfahrenab 14. Darüber hinaus ist Polydimethylsiloxan (PDMS) im Bereich der Mikrofluidik aufgrund seiner optischen Transparenz, Biokompatibilität und Benutzerfreundlichkeit als goldenes Standardmaterial anerkannt15. Dennoch kann seine bekannte Neigung, kleine lipophile Moleküle, einschließlich EVs, zu absorbieren, für seine Anwendung im EV-Bereich problematisch sein13.
Cyclisches Olefin-Copolymer (COC) ist aufgrund der Biokompatibilität, der geringen Absorption von Molekülen und der hohen chemischen Beständigkeit ein häufig verwendetes Material in der Mikrofluidik15. Die Herstellung von COC-Geräten erfordert jedoch häufig komplexe Prozesse oder spezielle Geräte16. Alternativ ist Off-Stöchiometrie-Thiol-En (OSTE) aufgrund der verringerten Absorption kleiner Moleküle, der überlegenen chemischen Stabilität, der einfachen Herstellung und des skalierbaren Herstellungsprozesses eine vielversprechende Alternative zu PDMS17,18. Aufgrund komplexer Verbindungen zu Schläuchen können Geräte jedoch anfällig für Undichtigkeitensein 19.
Das Ziel dieser Studie war es, ein mikrofluidisches Gerät zu entwickeln und herzustellen, das OSTE und COC und das gegabelte A4F-Prinzip für die EV-Trennung aus großvolumigen Proben wie Urin oder Zellmedien kombiniert.

<table><tbody><tr><td>0,1 &Mikro; m Carboxylat FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td><td>#F8803</td><td>Stammkonzentration: 3,6 x 1013 Kügelchen/mL (LOT abhängig)</td></tr><tr><td>0,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Starstedt</td><td>72.704</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Luer-Konus-Spritze zum Einmalgebrauch ohne Nadel</td><td>RAYS</td><td>TUB1ML</td><td></td></tr><tr><td>1,0 & micro; m Polystyrol FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td><td>#F13083</td><td>Stammkonzentration: 1 x 1010 Kügelchen/mL (LOT abhängig)</td></tr><tr><td>10 mL Serologische Pipetten</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL (100k) Amicon Ultra Zentrifugalfilter</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>2,0 mL Protein LoBind Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>30108132</td><td></td></tr><tr><td>20 mL Spritzen</td><td>BD PlastikPak</td><td></td><td></td>10569215</tr><tr><td>250 &micro; m ID Polyetheretherketonschlauch</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>CIL-1581</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa MWCO Zentrifugalfiltereinheiten</td><td>Merck Millipore,</td> <td>UFC200324</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Medizinische Spritze ohne Nadel</td><td>Anhui Hongyu Wuzhou Medical</td><td>159646</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konische Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>70 Ti Festwinkel-Ultrazentrifugenrotor</td><td>Beckman Schar</td><td></td><td></td>337922</tr><tr><td>800 & micro; m ID Polytetrafluorethylen-Schlauch</td><td>Darwin</td><td>Microfluidics LVF-KTU-15</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Mikrotiterplatte, f-Boden, med. Bindung</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655001</td><td>ELISA-Platte</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x), serumfrei</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>SigmaAldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>COC Topas Objektträgerplattform</td> <td>für MikroskopieMikrofluidik Chipshop</td><td>10000002</td><td></td></tr><tr><td>COC Topas Objektträgerplattform für Mikroskopie 2 x 16 Mini Luer&nbsp;</td><td>Mikrofluidik Chipshop</td><td>10000387</td><td></td></tr><tr><td>Elveflow OB1 Druckregler</td><td>Elvesys Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luer-Steckverbinder</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>&nbsp; CS-10000095</td><td></td></tr><tr><td>Mask Aligner Süss MA/BA6</td><td>SÜSS MicroTec Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mixer Thinky ARE-250</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NS300</td><td>Nanopartikel-Analysator</td></tr><tr><td>Optisches Mikroskop Nikon Eclipse LV150N</td><td>Nikon Metrology NV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OSTE 322 Crystal Clear</td><td>Mercene Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS TABLETS.Ca/Mg kostenlos. Fisher Bioreagenzien. 100 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>PC-Membran (50 nm Porendurchmesser, 11,8 % Dichte)</td><td>it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petrischale, steril</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td></td></tr><tr><td>Plasma-Ascher GIGAbatch 360 M</td><td>PVA TePla America, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qEVoriginal/35 nm Säule</td><td>Izon</td><td>SP5</td><td>SEC</td></tr><tr><td>QSIL 216 Silikonelastomer Kit</td><td>PP& S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resin Tough Black</td><td>Zortrax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW40 Ti Ausschwingrotor Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>331301</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>DK Infusetek</td><td>ISPLab002</td><td></td></tr><tr><td>T175</td><td>Suspensionskolben Sarstedt</td><td>83.3912.502</td><td></td></tr><tr><td>TIM4-Fc Protein</td><td>Adipogen LifeSciences</td><td>AG-40B-0180B-3010</td><td></td></tr><tr><td>TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidin)</td><td>SigmaAldrich</td><td>T0440-100ML</td><td>Meerrettichperoxidase-Substrat</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>SigmaAldrich</td><td>P1379-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge Optima L100XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultraschall-Reinigungsgerät P 60 H</td><td>Elma Schmidbauer GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Universal Mikrotiterplatten-Spektralphotometer</td><td>Bio-Tek instruments</td><td>71777-1</td><td></td></tr><tr><td>Urinauffangbecher, 150 ml, steril</td><td>APTACA</td><td>2120_SG</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Anotop 25 Spritzenfilter</td><td>SigmaAldrich</td><td>68092002</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td>dynamisches Lichtstreusystem (DLS)</td></tr><tr><td>Zortrax Inkspire</td><td>Zortrax</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

einstufige isolierung extrazellulärer vesikel aus großvolumigen proben mit einem gegabelten mikrofluidischen a4f-gerät

Single Step Isolation of Extracellular Vesicles from Large-Volume Samples with a Bifurcated A4F Microfluidic Device

Extrazelluläre Vesikel (EVs) bergen ein immenses Potenzial für verschiedene biomedizinische Anwendungen, einschließlich Diagnostik, Arzneimittelabgabe und regenerative Medizin. Dennoch stellen die aktuellen Methoden zur Isolierung von Elektrofahrzeugen erhebliche Herausforderungen dar, wie z. B. Komplexität, Zeitaufwand und die Notwendigkeit sperriger Geräte, die ihre klinische Umsetzung behindern. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wollten wir ein innovatives mikrofluidisches System entwickeln, das auf zyklischem Olefin-Copolymer-Off-Stöchiometrie-Thiol-En (COC-OSTE) für die effiziente und kontinuierliche Isolierung von EVs aus großvolumigen Proben basiert. Durch die Verwendung einer größen- und auftriebsbasierten Trennung erreichte die in dieser Studie verwendete Technologie eine deutlich engere Größenverteilung im Vergleich zu bestehenden Ansätzen aus Urin- und Zellmedienproben, was die gezielte Ausrichtung auf spezifische EV-Größenfraktionen in zukünftigen Anwendungen ermöglicht. Unser innovatives mikrofluidisches COC-OSTE-Gerätedesign, das die Technologie der gegabelten asymmetrischen Durchflussfeld-Durchflussfraktionierung verwendet, bietet einen einfachen und kontinuierlichen EV-Isolationsansatz für großvolumige Proben. Darüber hinaus bietet das Potenzial für die Massenproduktion dieses mikrofluidischen Geräts Skalierbarkeit und Konsistenz, so dass es möglich ist, die EV-Isolierung in klinische Routinediagnostik und industrielle Prozesse zu integrieren, bei denen hohe Konsistenz und hoher Durchsatz wesentliche Anforderungen sind.

Wir haben ein mikrofluidisches Gerät mit einer 3D-gedruckten Doppelnegativform (Abbildung 1) mittels Softlithographie (Abbildung 2A) für die EV-Trennung mit hohem Durchsatz basierend auf dem gegabelten A4F-Prinzip (Abbildung 2B,C) hergestellt. Der Aufbau erfordert eine Pumpe und eine Durchflussstation, wie in Abbildung 3 zu sehen ist, für die automatisierte Isolierung von Elektrofahrzeugen. Um den Machbarkeitsnachweis der Geräte zu evaluieren, wurde zunächst eine Mischung aus Polystyrolkügelchen mit Durchmessern von 100 nm und 1000 nm hergestellt, um Vesikel bzw. feine Zelltrümmer darzustellen10. Es wurden Experimente mit unterschiedlichen Durchflussraten für die Raupenmischung durchgeführt, sowohl mit als auch ohne Bifurkationsströmung, um den Einfluss der linearen Geschwindigkeit auf die Trenneffizienz zu untersuchen. Über alle Experimente hinweg blieb die Rückgewinnung kleiner Kügelchen konstant und lag über 90 %10, was das Potenzial des Geräts zur Rückgewinnung von Elektrofahrzeugen zeigt.
Anschließend bewerteten und verglichen wir das Potenzial des COC-OSTE-Geräts bei der Isolierung von EVs aus großen Volumina (&gt;1 ml) aus komplexen Bioflüssigkeiten mit minimaler Vorverarbeitung. Daher wurden Urin von 10 gesunden Spendern (Abbildung 4) und Zellmedien von zwei verschiedenen Prostatazelllinien (Abbildung 5) als Vorlage verwendet, um EVs gleichzeitig nach drei verschiedenen Verfahren zu isolieren: Ultrazentrifugation (UC), Größenausschlusschromatographie (SEC) und das A4F-Mikrofluidik-basierte OSTE-COC-Gerät. Nach der Isolierung wurden die Gesamtzahl der Partikel und ihre Größenverteilung mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) bewertet. Im Durchschnitt zeigte das OSTE-COC-Gerät eine bessere Gesamtpartikelrückgewinnung aus Bioflüssigkeiten im Vergleich zu UC, aber die statistische Signifikanz wurde nur erreicht, wenn die Partikelzahlen aus beiden Anschlüssen kombiniert wurden (Abbildung 4A). Um die Geräteleistung mit anderen Systemen zu vergleichen, sollten R &amp; L-Ausgänge zusammen berücksichtigt werden. Wie in Abbildung 4 gezeigt, übertrifft die gemeinsame Leistung von L- und R-Ausgang bei der Rückgewinnung von EVs UC und SEC. Unabhängig davon wurde der L-Port entwickelt, um die kleine EV-Fraktion zu erfassen, während der R-Port so konzipiert war, dass er die größere EV-Fraktion mit anderen Molekülen ähnlicher Größe sammelt. Interessanterweise war die Wiederfindung mit dem R-PORT des OSTE-COC-Geräts etwas höher als mit SEC und UC allein (Abbildung 4A). Die CD63-Expression zeigte ein ähnliches Muster (Abbildung 4C). Dieser Befund deutet darauf hin, dass das OSTE-COC-Gerät bei der vollständigen EV-Wiederherstellung effektiver war. Es wurde eine äquivalente Größenverteilung zwischen den verschiedenen Methoden gefunden, mit Ausnahme von UC, das eine größere Partikelgrößenverteilung aufweist (Abbildung 4B).
Vergleichbare Ergebnisse wurden in Zellmedienkulturen beobachtet. In beiden Szenarien zeigte die Gesamtpartikelrückgewinnung von beiden Geräteanschlüssen eine überlegene Leistung im Vergleich zu SEC- oder UC-Methoden (wie in Abbildung 5A, B dargestellt). Bemerkenswert ist, dass EVs, die von PC3-Zellen abgeleitet wurden, eine ausgeprägte Größenverteilung mit größerer Homogenität in der L-PORT-Verteilung im Vergleich zu anderen Versuchsgruppen aufwiesen (Abbildung 5C,D). Darüber hinaus bestätigte die Analyse der CD63-Expression die höheren EV-Wiederfindungsraten, die mit dem COC-OSTE-Gerät erreicht wurden (wie in Abbildung 5E,F dargestellt). Eine Zusammenfassung der Isolationsmerkmale der verschiedenen in dieser Studie untersuchten Methoden findet sich in Tabelle 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig01.jpg"> Abbildung 1: 3DP-Serpentinen-förmige, doppelt negative Formabmessungen und isometrische Ansicht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig02.jpg"> Abbildung 2: COC-OSTE mikrofluidische Vorrichtung. (A) Schema der verschiedenen Hauptschritte zur Herstellung der OSTE-COC-Vorrichtung. (B) Funktionsprinzip des Geräts. (C) Bild des fertigen Geräts. Maßstab: 15 mm. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Priedols et al.10 und Bajo-Santos et al.20 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig03.jpg"> Abbildung 3: Experimentelle Konfiguration des Geräts. Die Spritzenpumpe befindet sich auf der linken Seite, das OSTE-COC-Gerät in der Mitte und die Auffangstation auf der rechten Seite. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Priedols et al.10 und Bajo-Santos et al.20 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig04.jpg"> Abbildung 4: EV-Größenverteilung im Urin und Partikelrückgewinnung von 10 Spendern mittels Ultrazentrifugation (UC), Größenausschlusschromatographie (SEC) und dem COC-OSTE-Gerät. (A) Partikelmenge, die aus jeder Isolationsmethode durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) gewonnen wird. Die Daten werden als Mittelwert +/- Standardabweichung dargestellt. Statistische Signifikanz mit * (p&lt;0,05). (B) Boxplots zeigen die durchschnittliche Partikelgrößenverteilung unter allen von NTA bewerteten Urinproben, wobei Whisker die Minimal- und Maximalwerte anzeigen. Die p-Werte wurden aus Vergleichen mit UC abgeleitet, wobei **** eine hohe statistische Signifikanz anzeigt (p&lt;0,0001). (C) Der Median und der Bereich der durchschnittlichen CD63-Menge, die mit einem Double-Sandwich-Enzyme-linked Immunosorbent Assay (dsELISA) für jede Isolierungsmethode bestimmt wurden, wurden für alle Proben berechnet. L-Anschluss: Linker Anschluss; R-Port: Rechter Port. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Bajo-Santos et al.20 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig05.jpg"> Abbildung 5: Charakterisierung von EVs, die aus PC3- und LNCaP-Zellen isoliert wurden, mit verschiedenen Methoden. (A) Partikelmenge, die aus PC3-Medien mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) gewonnen wird, dargestellt durch Mittelwert +/- Standardabweichung. (B) Partikelmenge, die aus LNCaP-Zellmedien unter Verwendung von NTA gewonnen wird, dargestellt als Mittelwert +/- Standardabweichung. (C) Die mediane Partikelgrößenverteilung von EVs aus PC3-Kulturen wurde zusammen mit dem Bereich durch NTA bestimmt. (D) Mediane Größenverteilung von EVs, die aus LNCaP-Kulturen mit Reichweite isoliert wurden. (E) Median und Bereich der CD63-Expression für jede Isolierungsmethode für PC3-Zelllinien-abgeleitetes EV unter Verwendung eines Double-Sandwich-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (dsELISA). (F) Median und Bereich der LNCaP-abgeleiteten EV-CD63-Expression durch dsELISA für jede Isolationsmethode. UC: Ultrazentrifugation; SEC: Größenausschlusschromatographie; L-Anschluss: Linker Anschluss; R-Port: Rechter Port. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Bajo-Santos et al.20 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>UC</td>
			<td>SEC</td>
			<td>COC-OSTE</td>
		</tr><tr><td>Bearbeitungszeit/Probe</td>
			<td>++/+++</td>
			<td>+++</td>
			<td>+</td>
		</tr><tr><td>Durchsatz</td>
			<td>++</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
		</tr><tr><td>Kosten/Muster</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
		</tr><tr><td>Reinheit</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
		</tr><tr><td>Automatisierung</td>
			<td>++</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
		</tr><tr><td>EV-Ertrag</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
			<td>+++</td>
		</tr><tr><td>Größenauswahl</td>
			<td>+</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1. Vergleich der Isolationseigenschaften von EVs mit den drei Methoden UC SEC und dem COC-OSTE-Gerät. UC: Ultrazentrifugation; SEC: Größenausschlusschromatographie. COC-OSTE: cyclisches Olefin-Copolymer-Off-Stöchiometrie-Thiol-en. +: niedrig; ++: mittel; +++: hoch. * Geräteabhängig.

Extrazelluläre Vesikel sind für biomedizinische Anwendungen sehr vielversprechend, aber die derzeitigen Isolierungsmethoden sind zeitaufwändig und für den klinischen Einsatz unpraktisch. In dieser Studie stellen wir ein mikrofluidisches Gerät vor, das die direkte Isolierung extrazellulärer Vesikel aus großen Mengen von Bioflüssigkeiten in einer kontinuierlichen Weise mit minimalen Schritten ermöglicht.

Einstufige Isolierung extrazellulärer Vesikel aus großvolumigen Proben mit einem gegabelten mikrofluidischen A4F-Gerät

Extracellular vesicles (EVs) hold immense potential for various biomedical applications, including diagnostics, drug delivery, and regenerative medicine. ...

Wir sehen das Potenzial extrazellulärer Vesikel, erkennen aber auch die Schwierigkeit bei ihrer Isolierung, insbesondere aus großen Proben-Bioflüssigkeiten wie Bioreaktormedien. In dieser Forschung haben wir getestet, ob wir die asymmetrische Flussfeld-Fluss-Fraktionierung verwenden können, um extrazelluläre Vesikel zu isolieren. Bisher ist es unmöglich, extrazelluläre Vesikel direkt aus Bioflüssigkeiten in einem kontinuierlichen Fluss für die Integration in Bioreaktoren zu isolieren.Stattdessen müssen zuerst Bioflüssigkeiten gesammelt und verarbeitet werden, was die Variabilität und den Arbeitsaufwand erhöht. Unser Gerät, das für die extrazelluläre Vesikelisolierung aus großvolumigen Bioflüssigkeiten entwickelt wurde, ermöglicht die Integration mit Bioreaktoren für kontinuierlichen Durchfluss und Automatisierung. Wir fanden heraus, dass die Flüssigkeitsviskosität die Isolierung extrazellulärer Vesikel durch asymmetrische Feldflussfraktionierung beeinflussen könnte.Wir untersuchen, ob die Anpassung von Biofluid- und Pufferströmen an die Viskosität die Isolierung verbessern kann.

single-step-isolation-extracellular-vesicles-from-large-volume

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Quelle: Watson, D. C., et.al. Skalierbare Isolierung und Reinigung von extrazellulären Vesikeln aus Escherichia coli und anderen Bakterien. J. Vis. Exp. (2021)Dieses Video zeigt die Isolierung und Konzentration von extrazellulären Vesikeln (EVs), die aus der äußeren Membran von gentechnisch veränderten Bakterien gewonnen werden. Der Prozess umfasst die Kultivierung der Bakterien, um EVs freizusetzen, gefolgt von sequenziellen Zentrifugations- und Filtrationsschritten, um Zellen und Ablagerungen...

Isolierung und Anreicherung von extrazellulären Vesikeln aus der äußeren Membran aus Bakterien

Quelle: Watson, D. C., et al. Skalierbare Isolierung und Reinigung von extrazellulären Vesikeln aus Escherichia coli und anderen Bakterien. J. Vis. Exp. (2021)Dieses Video zeigt die Verwendung der Größenausschlusschromatographie mit porösen Harzkügelchen zur Isolierung bakterieller extrazellulärer Vesikel (EVs) aus einem Bakterienkulturfiltrat. Größere EVs eluieren früh, indem sie die Harzporen umgehen, während kleinere Proteine in die Poren eindringen und später eluieren.

Isolierung bakterieller extrazellulärer Vesikel mittels Größenausschlusschromatographie 

Diese Protokollinformationen ein Verfahren zur extrazellulären Vesikeln (EVs), kleine membranöse Teilchen aus Zellen freigesetzt zu isolieren, von so wenig wie 10 ul Serumproben. Dieser Ansatz umgeht die Notwendigkeit von Ultrazentrifugation, nur wenige Minuten von Testzeit erfordert und ermöglicht die Isolation von Elektrofahrzeugen aus Proben von begrenzten Mengen.

Auf Papier basierende Vorrichtungen zur Isolierung und Charakterisierung von extrazellulärer Vesikel

Dieses Protokoll beschreibt eine Systemarchitektur für die Durchführung automatisierter Partikeltrennungen mit kleinen Volumina (0,15–1,5 ml) unter Verwendung eines mikrofluidischen Geräts und diskutiert Methoden zur Optimierung der Leistung und des Betriebs von akustofluidischen Geräten.

Einem mikrofluidischen Plattform für Präzisions-Kleinvolumen Probenbearbeitung und seine Verwendung zur Größe Separate biologische Partikel mit einem Acoustic Microdevice

Hier beschreiben wir zwei extrazellulären Vesikel Isolierung Protokolle, Ultrafiltration Zentrifugation und Ultrazentrifugation mit Dichte Steigung Zentrifugierung, extrazelluläre Vesikel aus murinen alvéolaire Lavage Flüssigkeitsproben zu isolieren. Die extrazelluläre Vesikel aus murinen alvéolaire Lavage Fluid durch beide Methoden abgeleitet werden quantifiziert und charakterisiert.

Isolierung der extrazellulären Vesikel aus murinen alvéolaire Lavage Fluid eine Ultrafiltration Zentrifugation Technik

Hier legen wir ein leicht anwendbares Protokoll vor, um die Speicherstabilität von extrazellulären Bläschen zu beurteilen, einer Gruppe natürlich vorkommender Nanopartikel, die von Zellen produziert werden. Die Vesikel werden als Modellenzym mit Glucuronidase beladen und unter unterschiedlichen Bedingungen gelagert. Nach der Lagerung werden ihre physikalisch-chemischen Parameter und die Aktivität des verkapselten Enzyms ausgewertet.

Bewertung der Speicherstabilität von extrakellulären Bläschen

Dieses Protokoll isoliert extrazelluläre Vesikel (EVs) von Virionen mit hoher Effizienz und Ausbeute, indem EV-Fällung, Dichtegradient-Ultrazentrifugation und Partikelerfassung integriert werden, um einen optimierten Workflow und eine Reduzierung des Startens zu ermöglichen. Mengenanforderungen, die zu reproduzierbaren Präparaten für den Einsatz in allen EV-Forschungen führen.

Reinigung von hochertragreichen extrazellulären Vesikelpräparaten weg vom Virus

Bakterien sezernieren nanometergroße extrazelluläre Vesikel (EVs), die bioaktive biologische Moleküle tragen. Die EV-Forschung konzentriert sich auf das Verständnis ihrer Biogenese, ihrer Rolle bei Mikroben-Mikroben- und Wirt-Mikroben-Interaktionen und Krankheiten sowie ihrer potenziellen therapeutischen Anwendungen. Ein Workflow für die skalierbare Isolierung von EVs aus verschiedenen Bakterien wird vorgestellt, um die Standardisierung der EV-Forschung zu erleichtern.

Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien

Das vorliegende Protokoll enthält detaillierte Beschreibungen für die Isolierung, Konzentration und Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus Cyanobakterienkulturen. Ansätze zur Reinigung von Vesikeln aus Kulturen auf verschiedenen Skalen, Kompromisse zwischen den Methoden und Überlegungen zur Arbeit mit Feldproben werden ebenfalls diskutiert.

Isolierung und Charakterisierung von zyanobakteriellen extrazellulären Vesikeln

Dieses Protokoll demonstriert, wie die kleinen extrazellulären Vesikel (hUC-MSC-sEVs) von humanen Nabelschnurstammzellen (hUC-MSC-sEVs) mit einer einfachen Laborumgebung isoliert werden können. Die Größenverteilung, Proteinkonzentration, sEVs-Marker und Morphologie isolierter hUC-MSC-sEVs werden durch Nanopartikel-Tracking-Analyse, BCA-Protein-Assay, Western Blot bzw. Transmissionselektronenmikroskop charakterisiert.

Eine einfache Tischfiltrationsmethode zur Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus humanen mesenchymalen Stammzellen

Dieses Protokoll bietet eine schnelle und größenspezifische Isolationsmethode für kleine extrazelluläre Vesikel, indem die Größe der Luftsprühdüse, der Mantelflüssigkeitsdruck, der Probenflussdruck, die Spannung, die Verstärkung und die Auslöseschwellenparameter optimiert werden.

Optimierung der durchflusszytometrischen Sortierparameter für die Hochdurchsatzisolierung und Aufreinigung kleiner extrazellulärer Vesikel

Lernen Sie die Isolierung extrazellulärer Vesikel aus großvolumigen Biofluiden mit einem mikrofluidischen A4F-Gerät. Diese Methode ermöglicht kontinuierlichen Fluss und Automatisierung für biomedizinische Anwendungen.

Einstufige Isolierung extrazellulärer Vesikel aus großvolumigen Proben mit einem gegabelten mikrofluidischen A4F-Gerät

Weitere Videos entdecken