Mikro-Computertomographie-Analyse des Knies bei gealterten Dunkin-Hartley-Meerschweinchen nach intraartikulärer Injektion

Osteoarthritis oder OA ist eine degenerative Gelenkerkrankung, von der 32,5 Millionen Erwachsene in den USA betroffen sind. Oft treten OA-Symptome erst nach einem schweren Krankheitsverlauf auf. Der Mangel an krankheitsmodifizierenden Medikamenten ist auf ein mangelndes Verständnis der Mechanismen zurückzuführen, die die Krankheit auslösen und antreiben.

Infolgedessen besteht ein kritischer und anhaltender medizinischer Bedarf an verbesserten Wirkstoffen für die Behandlung von OA. Dunkin-Hartley-Meerschweinchen sind ein etabliertes OA-Tiermodell, da sie diese Krankheit auf natürliche Weise entwickeln und ein robustes Modell für die Untersuchung der Auswirkungen neuartiger Therapeutika, die durch intraartikuläre Injektion verabreicht werden, auf das Fortschreiten der Krankheit bieten. Da mineralisierter Knochen in der Mikro-CT einen hervorragenden Kontrast aufweist, kann diese Modalität zur Beurteilung von 3D-Merkmalen und zur Durchführung quantitativer Analysen von Veränderungen im Zusammenhang mit OA verwendet werden. Zwei besonders relevante quantitative Messungen sind die Knochenmineraldichte und die Trabekeldicke, da beide im Laufe des Krankheitsverlaufs zunehmen. Die beschriebene Methodik der intraartikulären Injektionen bei Meerschweinchen und die anschließende Analyse von Mikro-CT-Daten wird dazu beitragen, die Variabilität der Studien zu reduzieren und die Effizienz der Datenanalysen zu erhöhen.

Rasieren Sie das Knie mit einem Elektrorasierer. Betäuben Sie das Tier und bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesietiefe, indem Sie nicht auf das Einklemmen der Zehen reagieren. Geben Sie steriles Augengleitmittel in beide Augen, um Austrocknung und Verletzungen zu verhindern.

Reinigen Sie die Injektionsstelle dreimal mit kreisenden Bewegungen und wechseln Sie mit dem verdünnten Peeling und der Alkohollösung. Es sollten sterile Handschuhe verwendet werden. Dieses Video zeigt die Verwendung von Autoklaven-Nitro-Handschuhen.

Während des gesamten Eingriffs sollte eine aseptische Technik angewendet werden. Beugen Sie das Knie um 90 Grad, bewegen Sie den Finger distal zur Patella, um die Rille des distalen Aspekts des Gelenkraums zu lokalisieren, indem Sie die hintere Extremität beugen und strecken. Die Tibia ist als knöcherne Struktur distal der Kniescheibe zu spüren.

Sobald die Lage von Tibia und Patella bestimmt ist, befindet sich das Gelenk zwischen ihnen. Führen Sie die Insulinnadel vorsichtig in der Mittellinie distal der Patella im Gelenkspalt ein. Die Nadel sollte ein bis zwei Millimeter unter der Haut eingeführt werden.

Injizieren Sie das Volumen langsam. Massieren Sie das Knie, indem Sie das Gelenk einige Male beugen und strecken, um die richtige Verteilung des Arzneimittels zu gewährleisten. Geben Sie die Proben mit Formalin in einen kompatiblen Behälter.

Kalibrieren Sie das Mikro-CT-Gerät für Dunkelfeld- und Lichtfeld-Belichtungen gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Scannen Sie die Probe mit einem Aluminium-Kupferfilter bei 18 Mikrometern. Verwenden Sie den Rotationsschritt 0,7 Grad für 360 Grad mit der Offset-Kamera.

Wählen Sie eine Schicht aus den Mikro-CT-Bildern aus. Überprüfen Sie die Kompensation von Fehlausrichtungen. Wenden Sie unter Einstellungen Glättung, Strahlhärtung, CS-Drehung und Ringartefakt an.

Wählen Sie Start aus, um mit der Rekonstruktion zu beginnen. Wählen Sie VOI und richten Sie die Probe so aus, dass sie vertikal ausgerichtet wird, um die spätere Analyse zu erleichtern. Speichern Sie das bearbeitete VOI als neuen Ordner.

Wählen Sie den Bereich der zu analysierenden Bilder aus, beginnend mit der subchondralen Platte. Es wird empfohlen, die Analyse der subchondralen Platte im trabekulären Knochen aufzuteilen, da sie unterschiedliche knöcherne Merkmale aufweisen. Wählen Sie für jedes Bild den gewünschten Bereich aus, um sicherzustellen, dass es den Knochen umfasst.

Wählen Sie die Binärauswahl aus. Passen Sie das Histogramm so an, dass der Hintergrund im Bone vollständig getrennt ist. Wählen Sie die Registerkarte Knochenmineraldichte aus.

Speichern Sie diese Daten in einem neuen Analysedatenordner. Wählen Sie Benutzerdefinierte Verarbeitung aus. Führen Sie zuerst die Schwellenwertbestimmung durch und wählen Sie Automatisch und dann Ausführen.

Wählen Sie dann Flecken entfernen und dann Schwarze Flecken entfernen aus. Wiederholen Sie den Vorgang Flecken entfernen, und wählen Sie Weiße Flecken entfernen aus. Wählen Sie 3D-Analyse und wählen Sie Grundwerte und Zusatzwerte aus.

A zeigt ein präpariertes Knie mit dem Vorhandensein von Methylenblau-Farbstoff im Gelenkspalt, was die korrekte Injektion zeigt. B ist eine flache Injektion, die dazu führt, dass sich im subkutanen Raum eine Bläse bildet. C zeigt den Mangel an Methylenblau-Farbstoff im Gelenkspalt, was auf eine falsche Injektion hinweist.

Es kann hilfreich sein, die Analyse für die subchondrale Platte, die in A dargestellt ist, und den trabekulären Knochen, der in B dargestellt ist, aufzuteilen, da sie manchmal unterschiedliche Parameter für unterschiedliche Knochenanalysen haben. Für die Knochenmineraldichte sehen wir, dass es einen Anstieg des Mittelwerts der 12 Monate alten Meerschweinchen im Vergleich zu den fünf Monate alten Meerschweinchen gibt, und dies gilt sowohl für die subchondrale Platte als auch für den trabekulären Knochen, was zeigt, dass die Knochenmineraldichte im Laufe der Zeit zunimmt. Zusätzlich zur trabekulären Dicke sehen wir, dass die Dicke zwischen dem 12 Monate alten Meerschweinchen und dem neun Monate alten Meerschweinchen und dem fünf Monate alten Meerschweinchen in Millimetern zunimmt, was zeigt, dass die trabekuläre Dicke im Laufe der Zeit zunimmt.

Die modifizierten Mankin-Werte nehmen mit zunehmendem Alter der Meerschweinchen zu, wie in Abbildung A zu sehen ist. Die Abbildungen B bis D zeigen Toluidinblau-Flecken. B ist ein fünf Monate altes Meerschweinchen, C ist ein neun Monate altes Meerschweinchen und D ist ein 12 Monate altes Meerschweinchen. Das schwarze Sternchen in Abbildung C zeigt den Proteoglykanverlust, während das schwarze Sternchen in Abbildung D Fissuren und das weiße Sternchen in Abbildung D Hypozellularität zeigt.

Derzeit ist die einzige Heilung für schwere Arthrose der Ersatz, der kostspielig und invasiv ist und zu Morbidität und Mortalität der Patienten führen kann. Infolgedessen besteht ein dringender Bedarf, die Forschung mit Tiermodellen für Open Access fortzusetzen und die nachhaltige Entwicklung neuartiger Therapeutika voranzutreiben. Obwohl intraartikuläre Injektionen ein wesentlicher Bestandteil von OA-Studien an Meerschweinchen sind, muss dieses Verfahren noch systematisch detailliert beschrieben werden.

Geeignete Injektionsverfahren sind von größter Bedeutung, um das Wohlergehen der Tiere zu gewährleisten und die Gesamtzahl der Tiere zu reduzieren, insbesondere bei Studien, die mehrere Injektionen über viele Monate erfordern. Um OA-bedingte Veränderungen systematisch zu beurteilen, beschreiben wir Mikro-CT-Analysen. Die Mikro-CT bietet eine tiefergehende Beurteilung von OA-Veränderungen als die histologische Überprüfung der Scans in einer gesamten Probe anstelle eines oder weniger Gewebeschnitte.

Während Dunkin-Hartley-Meerschweinchen ein robustes Modell für die Untersuchung der OA-Progression und der Auswirkungen neuartiger Therapeutika darstellen, gibt es Einschränkungen bei diesem Modell. Spontane Modelle benötigen in der Regel einen längeren Untersuchungszeitraum im Vergleich zur raschen Entwicklung von Veränderungen nach chirurgischer oder chemisch induzierter Arthrose. Darüber hinaus können Forscher den Effekt der Variabilität zwischen den Tieren reduzieren, indem sie Behandlungen auf eine Gliedmaße in jedem Tier anwenden, so dass die kontralaterale Gliedmaße als interne Kontrolle dienen kann.