Quantitative Analyse der Mitochondrien-assoziierten Stabilisierung der endoplasmatischen Retikulummembran (MAM) in einem neuronalen Modell der Alzheimer-Krankheit (AD)

Wir versuchen, die Stabilität von mitochondrienassoziierten ER-Membranen unterschiedlicher Dicke oder Lückenbreiten quantitativ zu messen, was für die Regulierung der Pathophysiologie verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen, einschließlich AD, wichtig ist. Jüngste Studien an Mitochondrien-assoziierten ER-Membranen, oft als MAM bezeichnet, haben sie als einen der Schlüsselfaktoren bei der Einleitung der Amyloid-Pathologie im Frühstadium der Alzheimer-Krankheit beschrieben. Die Ergebnisse führten zur Entwicklung einer neuen Hypothese, der sogenannten MAM-Hypothese, die darauf hindeutet, dass AD ausschließlich eine MAM-bedingte Krankheit ist.

Unser Protokoll ist das erste, das ein quantitatives Instrument zur Messung der MAM-Stabilisierung in lebenden Zellen bereitstellt, was bisher eine Herausforderung darstellte. Der größte Vorteil unseres Protokolls besteht darin, dass es die intrinsische dynamische Eigenschaft der Mitochondrien nutzt, um die Veränderungen der MAM-Stabilisierung beim Anziehen oder Lockern der MAM-Lückenbreiten in lebenden Zellen quantitativ zu messen.

Unser Fokus in der unmittelbaren Zukunft liegt darauf, unsere hochmoderne Lebendzellbildgebung und kymographische Technik zu verbessern und einzusetzen, um eine Reihe von von der FDA zugelassenen synthetischen oder natürlichen niedermolekularen Modulatoren von MAMs oder MAM-gebundenen Sigma-One-Rezeptoren unter Verwendung einer kürzlich entwickelten AD-Wirkstoff-Screening-Plattform zu screenen und ihren Wirkmechanismus zu verstehen.

[Erzähler] Um die Zellen mit MAM-Stabilisatoren zu transfizieren, ersetzen Sie das mononukleäre Knochenmarkgemisch durch zwei Milliliter DMEM-F12-Medium bei Raumtemperatur in jeder Vertiefung. Kombinieren Sie das Nukleofektor-Reagenz mit dem Supplement eins in einem Verhältnis von 4,5 zu eins. Geben Sie 100 Mikroliter des Nukleofektorreagenzes zu der Mischung. Wirbeln Sie dann die DNA-Lösung ein. Geben Sie für jede Transfektion ein bis fünf Mikrogramm DNA pro Behandlung in separate Ein-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Nachdem Sie das vorhandene Medium aus den Zellen abgesaugt haben, waschen Sie die Zellen einmal mit 10 Millilitern PBS. Aspirieren Sie das PBS und geben Sie einen Milliliter Accutase direkt in die Zellen. Inkubieren Sie die Zellen fünf bis 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Klopfen Sie dann vorsichtig auf die Seite der Schale, um die Zellen zu entfernen. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellen gelockert sind und frei fließen. Neutralisieren Sie die Wirkstoffe mit 10 Millilitern DMEM-F12-Medium und überführen Sie die Zellsuspension in ein sauberes 15-Milliliter-Röhrchen. Nehmen Sie als Nächstes 10 Mikroliter der suspendierten Zellen und fügen Sie sie auf Seite A einer Zellzählkammer hinzu. Stecken Sie dann Seite A der gefüllten Kammer in den Hauptschlitz an der Vorderseite des Zellzählers. Drücken Sie auf Messen und notieren Sie die Anzahl der Zellen pro Milliliter. Die erforderliche Anzahl von Zellen wird fünf Minuten lang bei 300 g zentrifugiert. Aspirieren Sie dann den Überstand vorsichtig und resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern Nukleofektormischung für jede Elektroporation. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter der resuspendierten Zellsuspension in eines der Röhrchen mit DNA. Mischen Sie, indem Sie die Lösung mehrmals pipettieren. Anschließend wird das DNA-Zellgemisch in eine Elektroporationsküvette überführt und mit dem mitgelieferten Deckel verschlossen. Wählen Sie das entsprechende Nukleofektorprogramm auf dem Gerät aus. Geben Sie sofort ca. 500 Mikroliter DMEM aus einer vorgefüllten Sechs-Well-Platte mit sterilen Pipetten in die Küvette. Einmal vorsichtig mischen und die elektroporierten Zellen und das Medium in die entsprechende Vertiefung geben. Platzieren Sie zunächst die Sechs-Well-Platte mit den Zellen in der Mikroskopkammer und stellen Sie den Fokus des Mikroskops so ein, dass die Zellen sichtbar werden. Um das rot fluoreszierende Proteinsignal einzufangen, regen Sie das Fluorophor mit einem 594-Nanometer-Laser an und stellen Sie die Emission auf 570 bis 640 Nanometer ein. Verwenden Sie für grün fluoreszierendes Protein einen 488-Nanometer-Laser zur Anregung mit einer Emission von 510 bis 540 Nanometern. Schneiden Sie den Scanbereich so zu, dass er um das Axon passt. Ein kleinerer Scanbereich reduziert die Verarbeitungszeit und vereinfacht die Kymographie-Generierung. Legen Sie das Intervall auf ein Bild pro Sekunde und die Gesamtdauer auf 181 Sekunden fest. Klicken Sie auf Ausführen, um den Vorgang zu starten. Die axonale Geschwindigkeit von MAM 1X-markierten ER-gebundenen Mitochondrien war im Vergleich zu freien und MAM 9X-gebundenen Mitochondrien um 50% reduziert. 26,6 % der MAM 1X-Mitochondrien waren mobil, gegenüber 53,82 % der freien Mitochondrien und 44,79 % der MAM 9X-Mitochondrien. Die retrograde Bewegung war für MAM-1X-Mitochondrien geringer als für Mito-RFP-Mitochondrien und MAM-9X-Mitochondrien. Die anterograde Bewegung der MAM 1X-Mitochondrien war im Vergleich zu Mito-RFP ebenfalls reduziert. Der stationäre Prozentsatz der MAM 1X-Mitochondrien war signifikant höher als der der MAM 9X-Mitochondrien, was eine Verringerung der Motilität widerspiegelt, während die Gesamtgeschwindigkeit der MAM 1X-Mitochondrien signifikant niedriger war als die der MAM 9X-Mitochondrien.