Name: Live-Kalzium-Bildgebung von virusinfizierten humanen Darm-Organoid-Monolayern unter Verwendung genetisch kodierter Kalziumindikatoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Erfahren Sie die Live-Kalzium-Bildgebung in virusinfizierten humanen Darm-Organoid-Monolayern mit genetisch kodierten Indikatoren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Signalstörungen im Epithelgewebe.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse R01DK115507 und R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) der National Institutes of Health (NIH) unterstützt. Die Praktikanten wurden von NIH Grants F30DK131828 (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F. J. Scribano) und F32DK130288 (PI: K.A. Engevik) unterstützt. Wir danken dem Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core für die Bereitstellung der organoiden Erhaltungsmedien.

Calcium-Bildgebung von virusinfizierten humanen Darm-Organoid-Monoschichten

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</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen offenzulegen.

Veränderungen des zytosolischenCa2+-Spiegels können sowohl Ursache als auch Wirkung von Pathologien innerhalb des Epithels sein 10,16,17. Ein Anstieg des zytosolischen Kalziums kann die Sekretion über die Aktivierung des kalziumabhängigen Chloridkanals direkt antreiben TMEM16A18,19. Die Aktivierung von TMEM16A als Reaktion auf Ca2+ ermöglicht den apikalen Ausfluss von Chlorid, wodurch ein osmotischer Gradient entsteht, der die Flüssigkeitssekretion fördert20,21. Darüber hinaus löst ein Anstieg von Ca2+ in enteroendokrinen Zellen die Freisetzung von Serotonin aus, das afferente sensorische Neuronen stimuliert, die die Aktivität im enterischen Nervensystem modulieren können22. Ca2+-Signale können auch Tight Junctions modulieren, um die Barrierefunktionzu beeinflussen 23,24 und die Proliferation in Darmstammzellen zu regulieren25. So kann eine Dysregulation von Ca2+ weitreichende Auswirkungen haben.
Viele Viren manipulieren zytosolisches Ca2+, um eine zelluläre Umgebung zu schaffen, die der Replikation förderlich ist26. Ein Paradebeispiel dafür ist das Rotavirus im Darmepithel27. Rotavirus non-structural protein 4 (NSP4) ist ein Ca2+ leitender Kanal, der den Ausfluss von Ca2+ aus dem endoplasmatischen Retikulum in das Zytosolermöglicht 28,29. Dies stimuliert die Autophagie und unterstützt den Aufbau des äußeren Kapsids 30,31,32. Eine Rotavirus-Infektion induziert auch die Freisetzung von ADP und löst interzelluläre Ca2+-Wellen aus, die zur Pathogenese beitragen17. Andere enterische Viren, einschließlich Caliciviren und Enteroviren, kodierenCa2+-leitende Viroporine, die eine ähnliche Dysregulation von Ca2+ in infizierten Zellen auslösen33,34.
Die Lebendzell-Ca2+ -Bildgebung von humanen Darmorganoiden bietet eine vielseitige Plattform, um virusinduzierte Signale innerhalb des Epithels zu untersuchen. Die Stärke der Schlussfolgerungen, die aus den Bildgebungsdaten gezogen werden, hängt jedoch untrennbar von der Gesundheit und Qualität der HIOs, geeigneten Bildgebungsparametern und einem soliden analytischen Ansatz ab.
Eine effiziente lentivirale Transduktion ist oft der limitierende Schritt bei der Etablierung neuer HIO-Linien, aber Lentivirus- und Mehrfachtransduktionen mit hohem Titer tragen dazu bei, eine ausreichende Transgenexpression zu gewährleisten. Wichtig ist, dass dies mit dem Potenzial für erheblichen zellulären Stress bei der Transduktion abgewogen werden muss. Dies ist meist vorübergehend und klingt nach Selektion und mehrfachen Durchgängen wieder ab. Nichtsdestotrotz ist es von entscheidender Bedeutung, dass HIOs, die zur Expression von GECIs entwickelt wurden, vor Beginn der Experimente ein normales Wachstum und eine normale Proliferation aufweisen. Ebenso induziert die Dispergierung von 3-dimensionalen HIOs und deren Neubildung als Monoschichten zellulären Stress. Es empfiehlt sich, drei oder mehr Tage Zeit zu geben, bis sich die Monolagen nach dem Plattieren angepasst haben. Die Beschichtung der Platten mit Kollagen IV ist entscheidend für die Integrität der Monoschicht35,36. Das Aliquotieren von Kollagen IV und die Lagerung bei -80 °C zwischen den Anwendungen trägt dazu bei, die Monolayer-Haftung zu gewährleisten. Die Bestimmung der optimalen Aussaatdichte für jede HIO-Linie kann ebenfalls dazu beitragen, die Konsistenz zu verbessern. Schließlich ist es unerlässlich, die richtigen Kontrollen einzubeziehen und sie über Experimente hinweg zu vergleichen, um sicherzustellen, dass jede Beobachtung eine Reaktion auf die betreffende Variable darstellt und nicht eine technische Störfaktor.
Während das Ritzen einer Monoschicht unerwünschte Zellschäden verursachen kann, verbessert es die RV-Infektion von 2D-HIOs erheblich. Abbildung 2 verdeutlicht dies, da sich fast alle infizierten Zellen direkt neben dem Kratzer befinden. Experimentelle Befunde deuten darauf hin, dass RV am effizientesten an der basolateralen Oberfläche von Darmepithelzellen infiziert37. Daher wird vorhergesagt, dass das Ritzen einer Monoschicht die Infektiosität erhöht, indem die basolaterale Oberfläche freigelegt wird. Eine effiziente Monolayer-Infektion kann auch durch die Beschichtung von HIOs auf Polycarbonatmembranen erreicht werden, die in Vertiefungen mit Kulturmedium aufgehängt sind und den Zugang zur basolateralen Oberfläche ermöglichen. Der relativ große Abstand zwischen der Platte und der Polycarbonatmembran, die Polycarbonatmembran selbst und die Kunststoffoberfläche an der Basis der Vertiefung machen sie jedoch für die Epifluoreszenzbildgebung ungeeignet. Somit bleibt die in diesem Protokoll beschriebene Scoring-Methode der bevorzugte Ansatz. Angesichts der Tatsache, dass das Scoring selbst zu Signalstörungen führen kann, ist der Einschluss der nicht infizierten, bewerteten Kontrolle entscheidend für die Interpretation. Bei Viren, wie z. B. dem humanen Norovirus, die effizient über die apikale Membran infizieren, ist eine Ritzung der Monoschicht nicht erforderlich38.
Wie bei jedem Live-Imaging-System kann Phototoxizität Experimente mit HIO-Monoschichten leicht verwirren. Während eines bildgebenden Experiments ist es wichtig, auf unerwartete Vakuolisierung, Membranbläschen oder andere morphologische Indikatoren für Stresszu achten 39. Wenn eines dieser Anzeichen erkannt wird, muss die Dauer, Frequenz oder Stärke der Erregung reduziert werden. Die Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses geht oft auf Kosten der langfristigen Zellgesundheit, daher ist die empirische Optimierung von Parametern von entscheidender Bedeutung. Photobleaching, das durch eine Abnahme der Basisfluoreszenzintensität im Laufe der Zeit angezeigt wird, ist ein Vorbote von Zellstress und sollte vermieden werden.
Die Visualität von Bilddaten kann dazu führen, dass Forscher qualitative statt quantitative Analysen bevorzugen. Wie bei jeder Modalität müssen reproduzierbare Schlussfolgerungen jedoch quantifiziert werden. Die quantitative Bildanalyse enthält weit mehr Komplexität, als in einem einzigen Manuskript abgedeckt werden kann, aber es lohnt sich, einige wichtige Punkte hervorzuheben. Erstens erfordert eine konsistente Quantifizierung eine konsistente Erfassung. Eine Analyse-Pipeline, die für einen bestimmten Satz von Aufnahmeparametern entwickelt wurde, ist möglicherweise nicht effektiv für Bilder, die mit unterschiedlichen Frequenzen, Belichtungszeiten, Laserleistungen oder Wellenlängen aufgenommen wurden. Zweitens hat die Vielzahl der Infektionen einen übergroßen Einfluss auf die Häufigkeit der viral induzierten Kalziumsignale. Daher ist es wichtig, die Anzahl der infizierten Zellen pro Sichtfeld zu bewerten und die Konsistenz unter allen Behandlungsbedingungen sicherzustellen. Alternativ kann die Normalisierung der Signalfrequenz auf die Anzahl der infizierten Zellen pro Sichtfeld dazu beitragen, Fehler zu reduzieren. Während der kürzlich entwickelte mNG-basierte Kalziumindikator (NEMO) einen vielversprechenden Ansatz zur Bestimmung absoluterCa2+ -Konzentrationen in Zellen bietet40, vermitteln die meisten Biosensoren nur relative Informationen über biologische Systeme. Daher sind die Subtraktion, Normalisierung und der Vergleich mit einem Steuerelement von entscheidender Bedeutung.
Während sich dieses Protokoll auf die Kalziumbildgebung während einer Virusinfektion konzentriert, ist der allgemeine Ansatz leicht anpassbar. Eine Virusinfektion kann leicht durch eine alternative Behandlungsbedingung ersetzt werden, und es gibt eine ständig wachsende Litanei von Biosensoren, um viele verschiedene zelluläre Signalwege und Prozesse zu überwachen. Bei jeder Protokollanpassung müssen die Forscher die Analyse im Auge behalten und Experimente mit klaren, quantifizierbaren Ergebnissen entwerfen.
Insgesamt bietet die Live-Bildgebung eine unübertroffene zeitliche Auflösung, die die Charakterisierung hochdynamischer Prozesse verbessert. Die Einbindung von Organoiden in Live-Imaging-Experimente ermöglicht es, diese Prozesse in einem gewebeechten, physiologisch relevanten Modell zu beobachten. Wir hoffen, dass das hier beschriebene Protokoll die Versuchsplanung und -optimierung erleichtert und die Forscher in die Lage versetzt, neue Aspekte der Zell- und Gewebesignalübertragung aufzudecken.

Kalzium ist ein weit verbreiteter sekundärer Botenstoff, der eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Zellphysiologie spielt1. Aufgrund seiner starken Ladung, seiner geringen Größe und seiner hohen Löslichkeit unter physiologischen Bedingungen ist Kalzium ein idealer Manipulator der Proteinkonformation. Dies macht Kalzium zu einem leistungsstarken Mittel, um elektrochemische Signale in enzymatische, transkriptionelle oder posttranskriptionelle Veränderungen umzuwandeln. Die strengen Kalziumkonzentrationsgradienten über das endoplasmatische Retikulum (ER) und die Plasmamembranen erzeugen eine hohe Antriebskraft, die schnelle Änderungen der zytosolischen Kalziumkonzentration ermöglicht. Mehrere Mechanismen, darunter sowohl die Pufferung als auch der aktive Transport, halten diesen Gradienten aufrecht. Diese Aufrechterhaltung ist zwar für normale Zellfunktionen notwendig, aber energetisch teuer, was sie besonders anfällig für Stresszustände macht 2.
Daher ist eine Dysregulation von Kalzium im Zytosol ein nahezu universelles Signal für viele Arten von zellulärem Stress. Stoffwechselstörungen, Toxine, Krankheitserreger, mechanische Schäden und genetische Störungen können die Kalziumsignalisierung stören. Unabhängig vom Stimulus kann ein anhaltender, unkontrollierter Anstieg des zytosolischen Kalziums auf Ganzzellebene die Apoptose und schließlich die Nekrose fördern 3,4. Veränderungen des zytosolischen Kalziumspiegels mit geringerer Amplitude oder höherer Frequenz haben jedoch unterschiedliche Auswirkungen2. Ebenso können die Ergebnisse von Kalziumschwankungen je nach räumlicher Mikrodomäne, in der sie auftreten, unterschiedlich sein5. Die Überwachung des Kalziumspiegels kann daher Aufschluss über dynamische Signalprozesse geben, erfordert jedoch eine Probenahme mit relativ hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung.
Genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECIs) sind leistungsfähige Werkzeuge für die kontinuierliche Probenahme in lebenden Zellsystemen6. Einige der am weitesten verbreiteten GECIs sind GFP-basierte, auf Kalzium reagierende fluoreszierende Proteine, die als GCaMPsbekannt sind 7. Die kanonische GCaMP ist eine Fusion von drei verschiedenen Proteindomänen: einem zirkulär permutierten GFP (cpGFP), Calmodulin und M136. Die Calmodulindomäne erfährt bei der Bindung von Kalzium eine Konformationsänderung, die ihre Interaktion mit M13 ermöglicht. Die Calmodulin-M13-Wechselwirkung induziert eine Konformationsänderung des cpGFP, die seine Fluoreszenzemission bei Anregung erhöht. Daher korreliert ein Anstieg der Kalziumkonzentration mit einem Anstieg der GCaMP-Fluoreszenzintensität. Diese Sensoren können zytosolisch oder auf bestimmte Organellen gerichtet sein8.
Ähnlich wie die meisten Gewebe reguliert Kalzium eine Vielzahl von Funktionen innerhalb des Magen-Darm-Epithels. Das Darmepithel ist ein wesentlicher Bestandteil der Nährstoff- und Flüssigkeitsaufnahme, muss aber auch eine dichte Barriere und Immunschnittstelle bilden, um das Eindringen von Krankheitserregern oder toxische Beleidigungen zu vermeiden. Kalziumabhängige Signalwege beeinflussen fast alle diese lebenswichtigen Funktionen 9,10,11. Die Kalziumsignalisierung im Darmepithel ist jedoch nach wie vor ein wenig erforschtes Gebiet mit vielversprechendem Potenzial als therapeutisches Ziel. Während die Überwachung der Kalziumdynamik im Darmepithel in vivo weiterhin eine Herausforderung darstellt, bieten humane Darmorganoide (HIOs) ein anpassungsfähiges ex vivo System für Experimente12. HIOs sind 3-dimensionale (3D) Sphäroide, die aus menschlichen Darmstammzellen gewonnen werden und bei Differenzierung einen Großteil der zellulären Vielfalt des nativen Darmepithels rekapitulieren12.
Dieses Protokoll beschreibt umfassende Methoden zur Entwicklung von HIOs, die GECIs exprimieren, und zur Herstellung von künstlich hergestellten HIOs als Monolayer für die Kalziumbildgebung lebender Zellen. Es bietet eine Virusinfektion als Beispiel für eine pathologische Manipulation, die die Kalziumsignalisierung stört, und bietet einen analytischen Ansatz zur Quantifizierung dieser Veränderungen.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsin EDTA &nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>25300054</tr><tr><td>0,05 % Trypsin EDTA</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>25300054</tr><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Fisherbrand</td><td>5408137</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konische Röhrchen</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>0553859A</td><td></td></tr><tr><td>16% Formaldehyd</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Corning&nbsp;</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>25-Gauge-Nadel</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>1482113D</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykozytikum&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>FisherScientific&nbsp;</td><td></td><td></td>BP1600100</tr><tr><td>CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glasboden, 10 Fächer</td><td>Greiner</td><td>543979</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Fluorobrit</td><td>Gibco</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>35050079</tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>35050079</tr><tr><td>Humaner epidermaler Wachstumsfaktor</td><td>ProteinTech</td><td>HZ-1326</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus</td><td>VectorBuilder</td> <td>(variabel)</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosceicen</td><td>356231/CB40230C</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcystein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Nunc mit Zellkultur behandelte 24-Well-Platten</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Polybren</td><td>MilliporeSigma</td><td>TR1003G</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S70767</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzym, ohne Phenolrot</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Worthington Biochemical</td><td>NC9811754</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

live-kalzium-bildgebung von virusinfizierten humanen darm-organoid-monolayern unter verwendung genetisch kodierter kalziumindikatoren

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

Die Kalziumsignalisierung ist ein integraler Regulator fast jedes Gewebes. Im Darmepithel ist Kalzium an der Regulierung der sekretorischen Aktivität, der Aktindynamik, der Entzündungsreaktionen, der Stammzellproliferation und vieler anderer nicht charakterisierter zellulärer Funktionen beteiligt. Daher kann die Kartierung der Kalzium-Signaldynamik im Darmepithel Einblicke in homöostatische zelluläre Prozesse geben und einzigartige Reaktionen auf verschiedene Reize aufdecken. Humane intestinale Organoide (HIOs) sind ein vom Menschen abgeleitetes Hochdurchsatzmodell zur Untersuchung des Darmepithels und stellen somit ein nützliches System zur Untersuchung der Kalziumdynamik dar. In diesem Artikel wird ein Protokoll beschrieben, um HIOs mit genetisch kodierten Kalziumindikatoren (GECIs) stabil zu transduzieren, Live-Fluoreszenzmikroskopie durchzuführen und Bilddaten zu analysieren, um Kalziumsignale aussagekräftig zu charakterisieren. Als repräsentatives Beispiel wurden 3-dimensionale HIOs mit Lentivirus transduziert, um GCaMP6s, eine grün fluoreszierende Protein-basierte zytosolische GECI, stabil zu exprimieren. Die entwickelten HIOs wurden dann in einer einzelligen Suspension dispergiert und als Monolagen ausgesät. Nach der Differenzierung wurden die HIO-Monolayer mit Rotaviren infiziert und/oder mit Medikamenten behandelt, von denen bekannt ist, dass sie eine Kalziumreaktion stimulieren. Ein Epifluoreszenzmikroskop, das mit einer temperaturkontrollierten, befeuchteten Live-Imaging-Kammer ausgestattet war, ermöglichte die Langzeitbildgebung von infizierten oder medikamentös behandelten Monoschichten. Im Anschluss an die Bildgebung wurden die aufgenommenen Bilder mit der frei verfügbaren Analysesoftware ImageJ analysiert. Insgesamt etabliert diese Arbeit eine anpassungsfähige Pipeline zur Charakterisierung zellulärer Signaltransduktion in HIOs.

Abbildung 1A zeigt eine BMM-Kuppel mit 3-dimensionalen humanen Darmorganoiden, die transduziert wurden, um GCaMP6s stabil zu exprimieren. Abbildung 1B zeigt die gleiche Linie von Organoiden, die 24, 48 und 72 Stunden nach der Aussaat als Monoschicht neu beschichtet wurden. Um die Funktion von GCaMP6s zu validieren, wurde die Monoschicht alle 2 s für 4 min durch Fluoreszenzmikroskopie abgebildet und nach ~20 s 100 nM ADP zu den Medien hinzugefügt. ADP löst eine Kalziumfreisetzung aus dem endoplasmatischen Retikulum aus, wodurch das zytosolische Kalzium erhöht wird. Die Fluoreszenzintensität, die auf dem 488-nm-Kanal bei jeder Belichtung detektiert wird, ist in Abbildung 1C dargestellt. Die Spur zeigt eine stetige Basislinien-Fluoreszenzintensität, gefolgt von einem schnellen Anstieg bei ADP-Zugabe und einer allmählichen Rückkehr zum Ausgangswert. Eine Vehikelsteuerung ist enthalten, um zu überprüfen, ob es sich bei der Reaktion um ein echtes Signalereignis handelt und nicht nur um eine Änderung der Fluoreszenzintensität, die durch die Zugabe von Medien entstehen kann.
Das Scoring eines HIO-Monolayers erhöht die Effizienz der Rotavirus-Infektion. Während die Techniken für die Bewertung variieren, ist es am einfachsten, eine konsistente Infektion mit einem einzigen Score entlang der Länge der Monoschicht zu erzielen, wie in Abbildung 2A dargestellt. Bei der Verwendung von rekombinanten Rotavirusstämmen, die fluoreszierende Proteine exprimieren, kann die Infektion während der Live-Bildgebung nachgewiesen werden (Abbildung 2B). Bei Verwendung eines Stammes, der keinen Marker exprimiert, kann die Infektion nach der Bildgebung durch Immunfluoreszenz nachgewiesen werden. Aufgrund der Beweglichkeit von Zellen in HIO-Monolayern ist es oft schwierig, eine einzelne infizierte Zelle über die Zeit zu verfolgen. Verwenden Sie stattdessen die Endpunktfärbung als Methode, um die Infektion zu verifizieren und zu bestätigen, dass die Vielzahl der Infektionen zwischen den Sichtfeldern übereinstimmt (Abbildung 2C).
Interzelluläre Kalziumwellen in HIOs können qualitativ beobachtet werden, wie in Abbildung 3A dargestellt. Die Bestimmung der Häufigkeit von Kalziumwellen in einem bestimmten Sichtfeld erfordert jedoch eine quantitative Analyse. Die Schritte der erfolgreichen Segmentierung, wie in Schritt 6 des obigen Protokolls beschrieben, sind in Abbildung 3A dargestellt. Die Abbildung zeigt das Rohbild (Abbildung 3Ai), das Bild, nachdem die Pixelintensitäten des vorherigen Bildes subtrahiert wurden (Abbildung 3Aii), dann die segmentierte Kalziumwelle (Abbildung 3Aiii).
Sobald die Kalziumwellen für jedes Sichtfeld im Laufe des Bildgebungslaufs segmentiert und quantifiziert wurden, ist es oft aufschlussreich, die Frequenz der Wellen in Monoschichten zu vergleichen, die verschiedenen Bedingungen ausgesetzt sind. Das Streifendiagramm in Abbildung 3B zeigt die Gesamtzahl der Kalziumwellen pro Sichtfeld in simulierten und Rotavirus-inokulierten Monoschichten. Dieses Beispiel umfasst zwei Stämme von RV: einen Stamm des humanen Rotavirus (Ito HRV) und einen rekombinanten Stamm des affenartigen Rotavirus SA11, der mRuby exprimiert (SA11-mRuby). Die simulierte infizierte Kontrolle wird als Basis-Kalziumwellenfrequenz genommen, die unbehandelten Rotavirus-infizierten Monolagen dienen als Positivkontrollen, und die Rotavirus-infizierten, behandelten Monolagen sind die experimentellen Bedingungen. Scheininfizierte und RV-infizierte Monoschichten, die mit Medikamenten, einschließlich des ADP-Rezeptor-Inhibitors BPTU, behandelt wurden, können dann mit beiden Kontrollbedingungen durch Einweg-ANOVA verglichen werden. Die Daten deuten darauf hin, dass BPTU die Frequenz der interzellulären Kalziumwellen effektiv verringert.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig01.jpg"> Abbildung 1: Validierung der GCaMP6s-Expression in jejunalen humanen Darmorganoiden. (A) Nach der Lentivirus-Transduktion durchliefen die GCaMP-exprimierenden HIOs eine Selektion und mehrere Passagen, die hier 7 Tage nach der letzten Passage gezeigt werden. Nach Stimulation mit dem 488-nm-Laser zeigt sich die GCaMP6s-Expression in den transduzierten HIOs, die in 15 μl Basalmembranmatrix als 3-dimensionale Sphäroide (Ai) plattiert sind. 50-ms-Belichtungen wurden bei 50% Laserleistung mit einem 20-fachen Objektiv aufgenommen und dann zusammengefügt, um die gesamte Membranmatrixkuppel des Grundes sichtbar zu machen. Ein ähnlicher Prozess wurde mit 4 ms Hellfeld-Belichtungen (Aii) durchgeführt. Im Hellfeldbild sind die dunklen HIOs in der Mitte der Kuppel ein Hinweis darauf, dass die Kulturen bereit für die Passage sind. (B) HIOs wurden enzymatisch zu einer Einzelzellsuspension verdaut und dann mit einer Dichte von 150.000 Zellen pro Vertiefung (5 mm Durchmesser) einer mit Kollagen IV vorbeschichteten Bildgebungsbodenplatte neu plattiert. 72 Stunden nach der Aussaat war die Monoschicht konfluent und bereit für nachgelagerte Anwendungen. Um die Funktion von GCaMP zu validieren, wurden Bilder mit dem 488-nm-Filterset mit 50 ms Belichtungszeit bei 50 % Laserleistung alle 2 s für 4 Minuten aufgenommen. (C) Die hier gezeigten Spuren stellen die Ganzfeld-Fluoreszenzintensität dar, die im Verlauf der Bildgebung auf die erste Aufnahme normiert wurde. Nach etwa 20 s (Pfeil), nach der zehnten Exposition, wurden 100 nM Adenosindiphosphat (ADP) hinzugefügt, um einen Anstieg des zytosolischen Kalziums (rot) hervorzurufen. Die Zugabe eines gleichen Volumens von 1x PBS löste keine aussagekräftige Reaktion aus (blau). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig02.jpg"> Abbildung 2: Ritzen einer HIO-Monoschicht zur Erleichterung der RV-Infektion. (A) Die Abbildung zeigt eine geeignete Technik zum Ritzen einer Monoschicht mit einer 25G-Nadel. (B) Eine HIO-Monoschicht wurde mit einem rekombinanten RV-Stamm infiziert, der das fluoreszierende mRuby-Protein (magenta, Pfeil) exprimiert, was die Identifizierung infizierter Zellen ermöglicht. Alternativ können bei Verwendung eines natürlich vorkommenden RV-Stammes infizierte Zellen mittels Immunfluoreszenz identifiziert werden. (C) Die gezeigten Bilder stammen von 4 verschiedenen HIO-Monolayern nach Fixierung, DAPI-Färbung (blau) und Antikörpermarkierung des Rotavirus-Antigens (Magenta). Beide Techniken veranschaulichen die bevorzugte RV-Infektion in der Nähe des gekerbten Teils der Monoschicht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig03.jpg"> Abbildung 3: Segmentierung und Quantifizierung von RV-induzierten interzellulären Kalziumwellen. Die 488-nm-Exposition von RV-infizierten HIOs, die GCaMP6s exprimierten, wurde alle 1 Minute für 16 Stunden unter Verwendung des Protokolls aufgenommen. (A) Die Abbildung veranschaulicht den Prozess der interzellulären Kalziumwellensegmentierung. Zunächst werden die Pixelwerte der vorherigen Aufnahme (t-1) von jedem Rohbild (Ai) subtrahiert, um die Änderung der Fluoreszenzintensität (Aii) zu quantifizieren. Anschließend wird ein Schwellenwert angewendet, der auf einer experimentell optimierten minimalen Intensitätssteigerung gegenüber dem vorherigen Frame basiert. Die Bilder werden dann nach einem minimalen zusammenhängenden Signalbereich gefiltert, um interzelluläre Kalziumwellen (Aiii) auszuwählen und einzellige Kalziumsignale auszuschließen. Diese Verarbeitung ermöglicht die Quantifizierung von Kalziumwellen in jedem Sichtfeld. In diesem Experiment wurden die Monolayer entweder simuliert, mit dem ITO-Stamm des humanen Rotavirus (HRV) oder mit einem rekombinanten Stamm des Affen-Rotavirus infiziert, der mRuby auf Genabschnitt 7 kodiert, stromabwärts von Nicht-Strukturprotein 3 (SA11-mRuby). Infizierte Monolayer wurden entweder mit dem ADP-Rezeptor-Inhibitor BPTU behandelt oder unbehandelt gelassen. Monoschichten wurden dann an 8 verschiedenen Positionen abgebildet, und Kalziumwellen in jedem Sichtfeld wurden mit der in diesem Protokoll beschriebenen Pipeline quantifiziert. Die Punkte auf dem Streifendiagramm zeigen die Anzahl der an jeder Position detektierten Kalziumwellen an, die auf einem Balkendiagramm überlagert sind, das den Mittelwert und die SD markiert. Die einseitige ANOVA, gefolgt von den Dunnett-Tests, zeigt, dass zwar jeder RV-Stamm die Frequenz der interzellulären Kalziumwellen über die der nicht infizierten Gruppe hinaus erhöht, die BPTU-Behandlung jedoch die RV-vermittelte Erhöhung der Kalziumwellenfrequenz verhindert. **p<0,01, ***p<0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagenz</td>
			<td>Transduktion</td>
			<td>Steuerung</td>
		</tr><tr><td>Y-27632 (1 mM Lagerbestand)</td>
			<td>4 μl</td>
			<td>4 μl</td>
		</tr><tr><td>Polybrene (1 mg/μl Brühe)</td>
			<td>2 μl</td>
			<td>2 μl</td>
		</tr><tr><td>Lentivirus</td>
			<td>Variable*</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HighWnt-WRNE *siehe Anmerkungen</td>
			<td>bis 400 μL</td>
			<td>bis 400 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Lentivirus-Transduktionsmedium. Bereiten Sie die Transduktionsmedien und Kontrollmedien vor, indem Sie die Reagenzien in den in der zweiten bzw. dritten Spalte angegebenen Volumina kombinieren. Streben Sie eine Vielzahl von Infektionen (MOI) von 10 Lentivirus-Transduktionseinheiten pro Zelle an. Für LV, das im eigenen Haus verpackt wird, erfordert dies in der Regel ~25-50 μl konzentriertes LV. Der Titer der meisten kommerziell verpackten LV wird mit dem Analysenzertifikat versehen.
Ergänzende Codierungsdatei 1: ImageJ-Makroskript, um die Quantifizierung von Kalziumwellen durch Stapelverarbeitung zu ermöglichen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/Wave_counter.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur Durchführung von Kalzium-Bildgebung in virusinfizierten menschlichen Darmorganoiden und bietet einen Ansatz für die Analyse.

Live-Kalzium-Bildgebung von virusinfizierten humanen Darm-Organoid-Monolayern unter Verwendung genetisch kodierter Kalziumindikatoren

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

Mit unserer Arbeit wollen wir verstehen, wie Viren die Signalübertragung im Darmepithel stören. Wir sind besonders daran interessiert zu verstehen, wie virusinfizierte Zellen benachbarte, nicht infizierte Zellen dysregulieren, um zur Pathogenese beizutragen. Wir haben kürzlich entdeckt, dass Rotavirus-infizierte Zellen ADP-Impulse freisetzen, die benachbarte, nicht infizierte Zellen dysregulieren und die Ausbreitung des Virus erleichtern und die Krankheit verschlimmern.Während die Kalzium-Bildgebung in Bereichen wie den Neurowissenschaften sehr beliebt ist, wurde sie bisher nicht häufig zur Untersuchung der Epithelbiologie oder Virologie eingesetzt. Dieses Protokoll bietet einen Ansatz zur Anpassung bestehender Technologien und Modellsysteme zur Untersuchung von Kalziumsignalen und lebendem virusinfiziertem Epithelgewebe. Durch die Modifikation von Organoiden, die genetisch kodierte Kalziumindikatoren exprimieren, ermöglicht unser Ansatz eine konsistente, reproduzierbare Langzeitbildgebung in einem Modellsystem, das die zelluläre Vielfalt des menschlichen Darmepithels rekapituliert.Unser Ziel ist es, die Auswirkungen der virusinduzierten parakrinen purinergen Signalübertragung sowohl für den Wirt als auch für das Virus zu verstehen. Unsere zukünftige Arbeit wird auch bestimmen, ob diese Art der Signalübertragung bei anderen Viren weitgehend konserviert ist und ob die Auswirkungen ähnlich sind.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Das endoplasmatische Retikulum spielt eine wichtige Rolle in Protein Biogenese und in Calcium-Homöostase. Wir haben ein experimentelles System, das uns auf die Rolle der Ca2 +-Kanäle Leck-Adresse und ihrer vermeintlichen Regulationsmechanismen charakterisieren lässt etabliert. Dieses System beinhaltet siRNA-vermittelten Gen-Silencing-und Live-Cell-Ca2 +-Imaging.

Live Cell Imaging mit Calcium siRNA vermittelte Gene Silencing Combined Identifiziert Ca 2 + Leck-Kanäle in der ER-Membran und deren Regulationsmechanismen

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In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Körperwandmuskeln

Hier stellen wir ein Protokoll vor, in dem einzelne Zellen auf akute Ereignisse und produktive HIV-1-Infektionen auf einem nanofluidischen Gerät überwacht werden. Bildgebende Daten definieren Virus-Wirt-Rezeptor-Interaktionen und Signalwegdynamik. Dies ist die erste Methode für nanofluidische Hochdurchsatz-Längskultur und Bildgebung von Einzelzellen, um Signalkinetik und molekulare Wechselwirkungen zu untersuchen.

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Fluoreszenzbasierte Kalziumbildgebung in primären menschlichen Atemwegsepithelkulturen mittels automatisierter Zellsegmentierung

Erfahren Sie die Live-Kalzium-Bildgebung in virusinfizierten humanen Darm-Organoid-Monolayern mit genetisch kodierten Indikatoren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Signalstörungen im Epithelgewebe.

Live-Kalzium-Bildgebung von virusinfizierten humanen Darm-Organoid-Monolayern unter Verwendung genetisch kodierter Kalziumindikatoren (Video) | JoVE Journal

Live-Kalzium-Bildgebung von virusinfizierten humanen Darm-Organoid-Monolayern unter Verwendung genetisch kodierter Kalziumindikatoren

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