Name: In-vitro-Kultivierungstechniken zur Modellierung der Leberorganogenese, zum Aufbau von Assembloiden und zum Design synthetischer Gewebe unter Verwendung menschlicher Zelllinien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Erfahren Sie, wie Stammzellen zur Erzeugung von Leberorganoiden und Assembloiden eingesetzt werden. Diese Miniaturisierungstechniken ermöglichen die Untersuchung von Morphogenese und Zellmigration für die regenerative Medizin.

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Die Autoren möchten Ogechi Ogoke und Osama Yousef aufrichtig danken für ihre unschätzbaren Beiträge zu den in diesem Artikel verwendeten Daten. NP wurde unterstützt von den UB CBE Startup-Fonds, einem Mark Diamond Fellowship, dem New York State Stem Cell Science C024316, dem UB Stem Cells in Regenerative Medicine (ScIRM) Center und dem University at Buffalo Center for Cell, Gene, Tissue Engineering (CGTE).

Assembloid Technology: Pioneering Liver Development Research

<ol><li>Bort, R., Signore, M., Tremblay, K., Martinez Barbera, J. P., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hex+homeobox+gene+controls+the+transition+of+the+endoderm+to+a+pseudostratified%2C+cell+emergent+epithelium+for+liver+bud+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hex homeobox gene controls the transition of the endoderm to a pseudostratified, cell emergent epithelium for liver bud development.</a> Dev Biol. 290 (1), 44-56 (2006).</li>
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<li>Petkov, P. M., Kim, K., Sandhu, J., Shafritz, D. A., Dabeva, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+differentially+expressed+genes+in+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells+of+fetal+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Identification of differentially expressed genes in epithelial stem/progenitor cells of fetal rat liver.</a> Genomics. 68 (2), 197-209 (2000).</li>
<li>Yang, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+the+independent+effect+of+twist+and+snail+in+promoting+metastasis+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of the independent effect of twist and snail in promoting metastasis of hepatocellular carcinoma.</a> Hepatology. 50 (5), 1464-1474 (2009).</li>
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<li>Rajvanshi, P., Kerr, A., Bhargava, K. K., Burk, R. D., Gupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+liver+repopulation+using+the+dipeptidyl+peptidase+iv-deficient+rat+and+other+rodent+recipients%3A+Cell+size+and+structure+relationships+regulate+capacity+for+increased+transplanted+hepatocyte+mass+in+the+liver+lobule%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Studies of liver repopulation using the dipeptidyl peptidase iv-deficient rat and other rodent recipients: Cell size and structure relationships regulate capacity for increased transplanted hepatocyte mass in the liver lobule.</a> Hepatology. 23 (3), 482-496 (1996).</li>
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<li>Rossi, J. M., Dunn, N. R., Hogan, B. L., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mesodermal+signals%2C+including+BMPs+from+the+septum+transversum+mesenchyme%2C+are+required+in+combination+for+hepatogenesis+from+the+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Distinct mesodermal signals, including BMPs from the septum transversum mesenchyme, are required in combination for hepatogenesis from the endoderm.</a> Genes Dev. 15 (15), 1998-2009 (2001).</li>
<li>Ng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+actopaxin+impairs+hepatocellular+carcinoma+metastasis+through+modulation+of+cell+migration+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Suppression of actopaxin impairs hepatocellular carcinoma metastasis through modulation of cell migration and invasion.</a> Hepatology. 58 (2), 667-679 (2013).</li>
<li>Fransvea, E., Angelotti, U., Antonaci, S., Giannelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+transforming+growth+factor-beta+up-regulates+e-cadherin+and+reduces+migration+and+invasion+of+hepatocellular+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Blocking transforming growth factor-beta up-regulates e-cadherin and reduces migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells.</a> Hepatology. 47 (5), 1557-1566 (2008).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+silencing+of+c-myc+inhibits+cell+migration%2C+invasion%2C+and+proliferation+in+hepg2+human+hepatocellular+carcinoma+cell+line%3A+C-myc+silencing+in+hepatocellular+carcinoma+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">RNAi silencing of c-myc inhibits cell migration, invasion, and proliferation in hepg2 human hepatocellular carcinoma cell line: C-myc silencing in hepatocellular carcinoma cell.</a> Cancer Cell Int. 13 (1), 23(2013).</li>
<li>Fitamant, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yap+inhibition+restores+hepatocyte+differentiation+in+advanced+HCC%2C+leading+to+tumor+regression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Yap inhibition restores hepatocyte differentiation in advanced HCC, leading to tumor regression.</a> Cell Rep. 10 (10), 1692-1707 (2015).</li>
<li>Xue, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goosecoid+promotes+the+metastasis+of+hepatocellular+carcinoma+by+modulating+the+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Goosecoid promotes the metastasis of hepatocellular carcinoma by modulating the epithelial-mesenchymal transition.</a> PLoS One. 9 (10), e109695(2014).</li>
<li>Biname, F., Lassus, P., Hibner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta+controls+the+directional+migration+of+hepatocyte+cohorts+by+modulating+their+adhesion+to+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta controls the directional migration of hepatocyte cohorts by modulating their adhesion to fibronectin.</a> Mol Biol Cell. 19 (3), 945-956 (2008).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-338-3p+inhibits+epithelial-mesenchymal+transition+and+metastasis+in+hepatocellular+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">MiR-338-3p inhibits epithelial-mesenchymal transition and metastasis in hepatocellular carcinoma cells.</a> Oncotarget. 8 (42), 71418-71429 (2017).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-1301+inhibits+hepatocellular+carcinoma+cell+migration%2C+invasion%2C+and+angiogenesis+by+decreasing+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+through+targeting+BCL9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">MiR-1301 inhibits hepatocellular carcinoma cell migration, invasion, and angiogenesis by decreasing Wnt/beta-catenin signaling through targeting BCL9.</a> Cell Death Dis. 8 (8), e2999(2017).</li>
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<li>Ogoke, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+niche+and+transcription+trigger+early+murine+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+liver+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the niche and transcription trigger early murine and human pluripotent stem cell-derived liver organogenesis.</a> bioRxiv. , 10.1101/2022.07.24.501313 (2023).</li>
<li>Ogoke, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+liver+organogenesis+by+recreating+three-dimensional+collective+cell+migration%3A+A+role+for+TGF-beta+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Modeling liver organogenesis by recreating three-dimensional collective cell migration: A role for TGF-beta pathway.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 621286(2021).</li>
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</ol>

NP ist der Gründer von Khufu Therapeutics, einem Unternehmen für Organoid-Engineering, das Behandlungen für akute und chronische Lebererkrankungen entwickelt.

Das vorliegende Protokoll umfasst mehrere Verfahren zur Kultivierung sowohl einfacher als auch komplexer Assembloide sowie Techniken zur Induktion der kollektiven 3D-Zellmigration in der frühen Leberorganogenese 24,25. Die skizzierten Protokolle heben mehrere kritische Schritte hervor, wobei die Sphäroidbildung ein zentraler Aspekt aller Methoden ist. Mikrovertiefungen (96 oder 384 Vertiefungen) werden entweder mit nicht-adhärenten oder mit Agarose beschichteten ...

Die Migration von Leberzellen spielt eine bedeutende Rolle bei der Organogenese, Krankheit und Zelltherapie der Leber. Während der Leberorganogenese (E8.5-9.0, Maus) beginnt das ventrale prähepatische Epithel des Vorderdarms, Lebergene aufgrund induktiver Signale zu exprimieren, die vom umgebenden Mesenchym und vom Herzen ausgehen. Bei E9.0 verdickt sich das Epithel des Vorderdarms, wenn die Zellen von einer quaderförmigen zu einer pseudostratifizierten säulenförmigen Morphologie übergehen und das Leberdivertikel bilden1,2. In diesem kritischen Stadium besteht das Leberdivertikel aus nur ~1.500 Zellen. Als nächstes verdickt sich das hepatische Endoderm, das das Leberdivertikel auskleidet, delaminiert und bildet Stränge aus wandernden Hepatoblasten (HBs). Diese HBs wandern gemeinsam mit Endothelzellen und mesenchymalen Zellen, verzweigen sich in das umgebende mesenchymale Gewebe und initiieren eine dreidimensionale kollektive Zellmigration, um die Leberknospe zu bilden3,4. Tatsächlich durchlaufen Zellen in diesem Stadium kollektiv (1) Co-Migration oder Bewegung zusammen mit anderen Zelltypen, (2) verzweigte Morphogenese oder Bildung verzweigter röhrenartiger Strukturen und (3) interstitielle Migration oder Migration auf oder zwischen anderen Zellen. Bei E11.5 hört die Migration auf, und die primitive Leber hat sich gebildet und expandiert um das 10-3-fache3. Die Migration von Leberzellen kann auch in späteren Stadien der Leberorganogenese erforderlich sein, da die Expression der HBs von Ratten Hinweise auf stark hochregulierte Gene gezeigt hat, die mit kollektiver 3D-Zellmigration, Morphogenese und dem Umbau der extrazellulären Matrix verbunden sind5. Zusätzlich zu ihrer Rolle bei der frühen Organogenese der Leber ist die kollektive 3D-Migration eng mit der lokalen Ausbreitung und Metastasierung des fortgeschrittenen hepatozellulären Karzinoms (HCC) verbunden, was letztendlich zu einer verschlechterten Prognose und einer erhöhten Behandlungsresistenz führt6. Adulte und fetale Hepatozyten nutzen ebenfalls eine kollektive Migration, wenn sie sich während der Leberrepopulation von der Milz in die Leber bewegen. In-vivo-Bildgebungsstudien haben gezeigt, dass transplantierte Hepatozyten innerhalb von Stunden in die Pfortader und dann in die Kapillaren gelangen und über die Lebersinusoide und durch das Lebergewebe wandern7,8,9. Schließlich zeigen neuere Studien, dass migrierende HBs während der Leberregeneration von Mäusen und Menschen entstehen, mit einigen Hinweisen auf Bewegungen in Sheets10. Insgesamt spielt die kollektive Migration der Leber, die zu mehreren Modi der Morphogenese fähig ist, eine wichtige Rolle bei der Organogenese, Krebs, Hepatozytenzelltherapie und Leberregeneration.
Zahlreiche genetische Studien haben die molekularen Wege untersucht, die der kollektiven 3D-Zellmigration der Leber zugrunde liegen. Diese Studien zeigen, dass das Fehlen von Lebersträngen die Leberbildung behindert, was die Notwendigkeit der Leberstrangbildung und ihrer Wechselwirkungen mit unterstützenden Zellen für die Leberbildung unterstreicht1,11,12,13. Diese Studien zeigen auch, dass das Leberwachstum durch verschiedene Faktoren ausgelöst wird, darunter FGF-2, das vom kardialen Mesoderm sezerniert wird, BMP4, das vom umgebenden Mesenchym sezerniert wird, HGF und Endothelzellinteraktionen. Darüber hinaus spielen migrationsassoziierte Transkriptionsfaktoren, einschließlich HEX, PROX1 und TBX3, eine entscheidende Rolle2,14. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass genetische Studien den Beweis erbringen, dass die Signalübertragung löslicher Faktoren, die zur Expression von Transkriptionsfaktoren führt, die Migration, die Signalübertragung und die molekularen Wechselwirkungen zwischen HBs und ihrem umgebenden Mesenchym antreibt.
Obwohl die Zellmigration in der frühen Leberorganogenese ausgiebig untersucht wurde, verwenden aktuelle in vitro Studien zur Lebermigration häufig 2D-Assays mit hochmigratorischen HCC-Zellen neben in vivo Tumormodellen15. Diese Studien haben Einblicke in mehrere Faktoren gegeben, die die Lebermigration beeinflussen, darunter TGFβ-116, c-Myc17, YAP18, goosecoid19, actopaxin20 und miRNAs21,22,23. Obwohl bemerkenswerte Fortschritte beim Verständnis der molekularen Mechanismen bei der 3D-Leberzellmigration erzielt wurden, deuten die deutlichen Unterschiede zwischen 2D- und 3D-Zellmigration darauf hin, dass 2D-Assays inhärente Einschränkungen aufweisen. Darüber hinaus fehlen in diesen Modellen oft die Einbeziehung von mesenchymalen Zelltypen, die sowohl für die Migration als auch für das Wachstum unerlässlich sind. Obwohl es Fortschritte bei der Entwicklung von 3D-Modellen für die Lebermigration gegeben hat, die das unterstützende Mesenchym integrieren, konzentrieren sich diese Modelle in erster Linie auf die Komigration, anstatt die verschiedenen Arten der kollektiven Migration zu erforschen.
Die Fähigkeit, Gewebe aus Sphäroiden durch verschiedene Selbstorganisation und morphogenetische Prozesse zu erzeugen, erleichtert die wissenschaftliche Erforschung synthetischer Gewebe. Diese Gewebe haben breite Anwendungen in der Arzneimittelentwicklung und im Screening, in der Krankheitsmodellierung, in der Therapie und in anderen biomedizinischen und biotechnologischen Anwendungen. Es werden die methodischen Details mehrerer 3D-In-vitro-Kultivierungssysteme vorgestellt, die so entwickelt wurden, dass sie unterschiedliche Modi der kollektiven 3D-Migration der Leber aufweisen. Diese Systeme umfassen (1) Co-Sphäroid-Kultur mit HEP- und MES-Sphäroiden in einer Matrix, (2) HEP-Sphäroid-Matrix-Tröpfchen, die mit M-CM kultiviert wurden, (3) HEP-MES-gemischte Sphäroide und (4) HEP-Sphäroid-Matrix, die mit einer hohen Dichte an MES-Zellen kultiviert wurde. Diese Systeme ermöglichen eine robuste Modellierung der kollektiven Migration der Leber in einer 3D-Umgebung und verbessern so unser Verständnis der molekularen und zellulären Prozesse, die der Leberorganogenese, Krebs und Therapie zugrunde liegen.

<table><tbody><tr><td>384-Well Schwarz/Klarer Boden mit ultra-niedrigem Aufsatz Sphäroid-Mikroplatte</td><td>Corning</td><td>3830</td><td></td></tr><tr><td>96-wl Zellkulturplatte flach, TC,STRL,1/pk,100/CS</td><td>Vertrieb von Laborprodukten 701001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0576</td><td>Low EEO</td></tr><tr><td>Axiovision Software</td><td>ZEISS</td><td></td><td>Version 4</td></tr><tr><td>Zellkulturschale, 60 mm, TC, STRL, 20/pk, 500/CS</td><td>Laborprodukte Verkauf</td><td>705001</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturflasche,175cm&sup2;, Vent,TC,STRL,5/pk,40/CS</td><td>Laborprodukte Verkauf</td><td>709003</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturkolben,75cm&sup2;, Vent,TC,STRL,5/pk,100/CS</td><td>Laborprodukte Verkauf 708003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen, 15mL,PP,STRL,Grad,50/bg,500/CS</td><td>Laborprodukte Verkauf L226010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollagen I, Rattenschwanz, 100 mg</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt, GlutaMAX Supplement, Pyruvat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>EVOS Fluoreszierendes Phasenkontrastmikroskop</td><td>EVOS</td><td>AMEFC4300R</td><td>1.360 x 1.024 Pixel Dichte</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, qualifiziert, USA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen aus humanem Plasma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4883-500MG</td><td>500 mg</td></tr><tr><td>Hep G2 [HEPG2]</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell vios 160i</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51033557</td><td></td></tr><tr><td>HFF-1</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1041</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>IJ1.46r; https://imagej.net/ij/</td></tr> <tr><td>Matrigel Wachstumsfaktor reduziert (GFR) Basalmembran Matrix, LDEV-frei, 10 mL</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>MRC-5</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>MSCGMT Human Mesenchymal Stem Cell Growth BulletKit</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin aus menschlichem Plasma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6884-100UN</td><td>100 Einheiten</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), Phenolrot</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%), Phenolrot</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiD-Zellmarkierungslösung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22887</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiI-Zellmarkierungslösung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22885</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiO-Zellmarkierung Lösung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22886</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Fluoreszenzmikroskop</td><td>ZEISS</td><td></td><td>SE64, 1.344 > 1.024 Pixel Dichte</td></tr></tbody></table>

in-vitro-kultivierungstechniken zur modellierung der leberorganogenese, zum aufbau von assembloiden und zum design synthetischer gewebe unter verwendung menschlicher zelllinien

In Vitro Cultivation Techniques for Modeling Liver Organogenesis, Building Assembloids, and Designing Synthetic Tissues using Human Cell Lines

Chronische Lebererkrankungen haben epidemische Ausmaße erreicht und betreffen weltweit über 800 Millionen Menschen. Die derzeitige Behandlung, die orthotope Lebertransplantation, hat mehrere Einschränkungen. Auf dem Gebiet der regenerativen Lebermedizin haben sich vielversprechende Lösungen herauskristallisiert, wobei die Leberorganogenese ein erhebliches Potenzial birgt. Die frühe Organogenese der Leber, die zwischen E8.5 und 11.5 stattfindet, beinhaltet die Bildung von epithelial-mesenchymalen Wechselwirkungen, die zur Morphogenese, zur Bildung des Leberstrangs und zur kollektiven Migration führen. Es fehlen jedoch Methoden zur In-vitro-Modellierung dieses Prozesses. In dieser Arbeit wird eine detaillierte Reihe von Methoden vorgestellt, die es ermöglichen, verschiedene Stadien und Aspekte der Leberorganogenese mit humanen Zelllinien zu modellieren. In einer Methodenreihe wird die Assembloid-Technologie mit hepatischen (HEP) und mesenchymalen (MES) Sphäroiden verwendet, die frühe Strukturen der Leberorganogenese repliziert, die frühe Morphogenese modelliert und die interstitielle Zellmigration in vivo demonstriert. Diese innovativen Assembloid-Systeme helfen bei der Identifizierung von Faktoren, die die Bildung und Migration von Assembloiden beeinflussen. HEP-Sphäroid-Kultivierungssysteme wurden auch eingesetzt, um die kollektive Migration und die Verzweigungsmorphogenese zu modellieren. Mesenchymalkonditionierte Medien (M-CM) spielen eine wichtige Rolle bei der Initiierung der dosisabhängigen Verzweigungsmigration. Alle vorgestellten Methoden erwiesen sich als hochgradig reproduzierbar mit einer hohen Erfolgsquote. Durch die Verknüpfung dieser Ereignisse wird unsere Arbeit die Nachbildung sequentieller, morphogenetischer Ereignisse ermöglichen, um die Organogenese in vitro und in vivo zurückzuentwickeln.

Das Interesse an synthetischen Geweben für eine Vielzahl biomedizinischer Anwendungen wie die Krankheitsmodellierung, die Arzneimittelforschung und das Gewebeengineering (Abbildung 7) nimmt zu. In diesem Bereich werden aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSZ) abgeleitete Organoiden, Sphäroide und Zellen in immer synthetischere, komplexere und größere Gewebe umgewandelt. Diese Umwandlung umfasst die Anwendung von Prinzipien der Morphogenese, den Einsatz von Werkzeugen wie der Mikrofertigu...

Organoide revolutionieren die personalisierte Gewebemodellierung für die Organentwicklung, Wirkstoffforschung und Krankheitsforschung. Die Organoid-Technik schreitet voran und führt zur Herstellung komplizierter synthetischer Gewebe. Ziel ist es, Morphogenese, Assembloid-Technologie und Biomatrizen zu integrieren, um das Tissue Engineering voranzutreiben. Dieses Protokoll hilft bei der Modellierung der Leberorganogenese und der Festlegung von Richtlinien für den Aufbau synthetischer Gewebe.

In-vitro-Kultivierungstechniken zur Modellierung der Leberorganogenese, zum Aufbau von Assembloiden und zum Design synthetischer Gewebe unter Verwendung menschlicher Zelllinien

Chronic liver disease has reached epidemic proportions, affecting over 800 million people globally. The current treatment, orthotopic liver ...

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Biotechnik

Dieser Artikel wird auf die Erzeugung von menschlichen Leber Entoderm aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen zu konzentrieren.

Robuste Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen

Eine Technik zur Isolierung menschlicher Hepatozyten und nicht-parenchymaler Leberzellen vom selben Spender wird beschrieben. Die unterschiedlichen Leberzelltypen bilden die Grundlage für funktionelle Lebermodelle und Tissue Engineering. Diese neue Methode zielt darauf ab, Leberzellen in einer hohen Ausbeute und Lebensfähigkeit zu isolieren.

Protokoll für die Isolierung von primären humanen Hepatozyten und entsprechende Hauptpopulationen von Nicht-parenchymale Leberzellen

Dieses Verfahren wurde für die Entwicklung fortgeschrittener 3D-Leberkulturen in vitro eingeführt, die eine physiologisch relevantere Bewertung der genotoxischen Gefahren im Zusammenhang mit Nanomaterial-Expositionen sowohl über ein akutes als auch ein langfristiges, wiederholtes Dosisregime ermöglichen können.

Erweiterte 3D-Lebermodelle für In-vitro-Genotoxizitätstests nach langfristiger Nanomaterial-Exposition

Dieses Protokoll stellt ein biomimetisches 3D-Modell mit begleitendem fibrotischen Stromfach dar. Hergestellt mit physiologisch relevanten Hydrogelen in Verhältnissen, die die biophysikalischen Eigenschaften der stromalen extrazellulären Matrix imitieren, ein aktiver Mediator von zellulären Wechselwirkungen, Tumorwachstum und Metastasierung.

Ein biomimetisches Modell für Leberkrebs zur Untersuchung von Tumor-Stroma-Wechselwirkungen in einer 3D-Umgebung mit tunablen biophysikalischen Eigenschaften

Aus Maushepatozyten wurde ein langfristiges Ex-vitro-3D-Organoidkultursystem etabliert. Diese Organoide können durch Lentivirus-Infektion der shRNA /ektopischen Konstruktion, siRNA-Transfektion und CRISPR-Cas9-Engineering durchpasst und genetisch manipuliert werden.

Etablierung und genetische Manipulation von murinen Hepatozyten-Organoiden

Hier stellen wir eine nicht-genetische Methode zur Erzeugung humaner autologer Lebersphäroide unter Verwendung mononukleärer Zellen vor, die aus peripherem Blut im stationären Zustand isoliert wurden.

Humane Lebersphäroide aus peripherem Blut für Studien zu Lebererkrankungen

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von schnellen und reproduzierbaren endodermalen Leberorganoiden (eHEPOs). Mit diesem Protokoll können eHEPOs innerhalb von 2 Wochen hergestellt werden und langfristig (mehr als 1 Jahr) expandieren, ohne ihre Differenzierung und Funktionalität zu verlieren.

Erzeugung von funktionellen endodermalen Leberorganoiden

Wir bieten einen umfassenden Überblick und eine Verfeinerung bestehender Protokolle für die Bildung von Organoiden des hepatozellulären Karzinoms (HCC), die alle Stadien der Organoidkultivierung umfassen. Dieses System dient als wertvolles Modell für die Identifizierung potenzieller therapeutischer Ziele und die Bewertung der Wirksamkeit von Wirkstoffkandidaten.

Entwicklung und Optimierung eines humanen hepatozellulären Karzinom-Patienten-abgeleiteten Organoidmodells zur Identifizierung potenzieller Zielmoleküle und zur Wirkstoffforschung

Jüngste technische Fortschritte ermöglichten die skalierte Produktion einer In-vitro-Plattform für Anwendungen im Bereich des Arzneimittelstoffwechsels und der Toxizität. Ein rein humanes 2D+ Lebersystem (TV2D+) liefert physiologisch relevante Ergebnisse mit herkömmlichen zweidimensionalen Kulturmethoden. Dieses Protokoll unterstützt Endbenutzer bei der Einrichtung, Wartung und Anwendung des Systems.

Ein rein humanes Leberkultursystem für Anwendungen in der Arzneimittelentwicklung

Dieses Protokoll stellt eine optimierte zweistufige Kollagenase-Leberperfusionstechnik in einem Rattenmodell vor und zeigt die Verwendung von isolierten Hepatozyten für die in vitro Langzeitkultur von 3D-Organoiden.

Perfusion der Rattenleber und Isolierung primärer Hepatozyten: ein altes Verfahren, das für die hochmoderne 3D-Organoidkultur entscheidend ist

Erfahren Sie, wie Stammzellen zur Erzeugung von Leberorganoiden und Assembloiden eingesetzt werden. Diese Miniaturisierungstechniken ermöglichen die Untersuchung von Morphogenese und Zellmigration für die regenerative Medizin.

In-vitro-Kultivierungstechniken zur Modellierung der Leberorganogenese, zum Aufbau von Assembloiden und zum Design synthetischer Gewebe unter Verwendung menschlicher Zelllinien (Video) | JoVE Journal

In-vitro-Kultivierungstechniken zur Modellierung der Leberorganogenese, zum Aufbau von Assembloiden und zum Design synthetischer Gewebe unter Verwendung menschlicher Zelllinien

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