Name: Erzeugung neuronaler Netzhaut aus humanen pluripotenten Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Erfahren Sie eine optimierte 3D-Induktionsmethode zur Erzeugung neuronaler Netzhaut aus humanen pluripotenten Stammzellen. Dieses Protokoll reduziert Organoid-Adhäsion und Fusion erheblich und verbessert Effizienz sowie Reproduzierbarkeit für die Augenheilkunde.

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Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von der institutionellen Ethikkommission des chinesischen Allgemeinen Krankenhauses der Volksbefreiungsarmee genehmigt. Die WA09 (H9) ESC-Linie wurde vom WiCell Research Institute bezogen.
1. Nährmedien und Reagenzienvorbereitung
<ol><li>Humanes ESC-Nährmedium und Durchgangslösung<ol><li>Erhaltungsmedium (MM): 500 ml vollständiges MM (Basalmedium + 5x Ergänzung; siehe Materialtabelle) aseptisch herstellen. 5x Supplement bei Raumtemperatur (RT) oder über Nacht bei 2-8 °C auftauen. Vor Gebrauch gut umrühren, bis das Präparat frei von Trübung ist.</li>
		<li>1% extrazelluläre Matrix (ECM): Verwenden Sie eine vorgekühlte Pipettenspitze und sterile Röhrchen, um 200 μl ECM (siehe Materialtabelle) pro Röhrchen auf Eis abzugeben. Lagern Sie die Röhrchen in einem -20 °C Gefrierschrank. ECM auf Eis schmelzen und mit vorgekühltem DMEM/F12 bei 1:100 verdünnen.</li>
		<li>0,5 mM pH = 8,0 EDTA: Um 500 ml 0,5 mM EDTA herzustellen, fügen Sie 500 μl 0,5 M EDTA und 0,9 g NaCl zu 500 ml 1x Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) hinzu (siehe Materialtabelle). Gründlich mischen und bei 2-8 °C lagern.</li>
	</ol></li>
	<li>Retinales Differenzierungsmedium<ol><li>Wachstumsfaktorfreies chemisch definiertes Medium (gfCDM): Bereiten Sie das gfCDM vor, indem Sie 45 % des modifizierten Dulbecco-Mediums GlutaMAX (IMDM-GlutaMAX) von Iscove, 45 % F12-GlutaMAX (F12-Glutamax) von Ham, 10 % Knockout-Serumersatz (KSR), 1 % Cholesterin-Lipidkonzentrat und 450 μM Thioglycerin kombinieren (siehe Materialtabelle).</li>
	</ol></li>
	<li>Kleinmolekulare Verbindungen<ol><li>Y-27632 2HCl: Fügen Sie 50 mg Y-27632-Pulver zu 3,122 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzu. Y-27632 (siehe Materialtabelle) in einer Konzentration von 50 mM bei -80 °C abgeben und 2 Jahre lang lichtgeschützt lagern. Verdünnen Sie das Stammmaterial 2.500 Mal (20 μM) zur Verwendung, was 0,4 μl Y-27632 pro ml gfCDM entspricht.</li>
		<li>IWR1-endo: Fügen Sie 2,4424 ml DMSO hinzu, um 10 mg IWR1-endo aufzulösen (siehe Materialtabelle), um eine 10 mM Stammlösung zu erhalten. Aliquote abgeben und bis zu 2 Jahre bei -80 °C lagern. Fügen Sie 0,3 μl 10 mM IWR1-endo pro ml gfCDM für die 3 μM-Konzentration für die Induktion hinzu.</li>
		<li>SB431542: Um 50 mM SB431542 zuzubereiten, fügen Sie 10 mg SB431542 (siehe Materialtabelle) zu 0,5203 ml DMSO hinzu und mischen Sie gründlich. Bei -80 °C in Lösungsmittel maximal 2 Jahre lagern. Für die Herstellung von SB431542 in einer Arbeitskonzentration von 10 μM werden 2 μl der 50 mM-Stammlösung zu 10 ml gfCDM gegeben.</li>
		<li>LDN-193189 2HCl: 5 mg LDN-193189 2HCl (siehe Materialtabelle) in 10,4297 ml DMSO lösen, um 1 mM Stammlösung zu erhalten. Bei -20 °C oder -80 °C lagern (wie vom Hersteller empfohlen). Fügen Sie 0,1 μl des Stammmaterials zu jeweils 10 ml gfCDM hinzu, was 100 nM LDN-193189 für die Induktion ergibt.</li>
		<li>Rekombinantes humanes morphogenetisches Knochenprotein 4 (BMP4): Rekonstitution bei 50-200 μg/ml in 4 mM HCl (siehe Materialtabelle). Nach der Rekonstitution bei 2 °C bis 8 °C 1 Monat oder -20 °C 1 Jahr lang lagern. Führen Sie die Induktion von NR mit 1,5 nM BMP4 durch.</li>
	</ol></li>
	<li>Langfristiges NR-Kulturmedium<ol><li>Retinsäure (RA): Messen Sie 6 mg RA-Pulver (siehe Materialtabelle) und fügen Sie es zu 3,9941 ml DMSO hinzu. In Aliquots von 5 mM bei -80 °C lagern und innerhalb von 3 Monaten verbrauchen. Um eine Arbeitskonzentration von 0,5 μM zu erreichen, fügen Sie 10 μl des Mastermixes zu 100 ml neuronalem Netzhautdifferenzierungsmedium (NRDM) hinzu. Kurz vor Gebrauch hinzufügen. Anmerkungen: Während der Zubereitung und Lagerung vor Licht schützen.</li>
		<li>Taurin: Fügen Sie Taurinpulver (siehe Materialtabelle) mit einem Gewicht von 200 mg zu 7,9904 ml DMSO hinzu, um eine 200 mM Stammlösung zu erhalten. Dosieren und bei 2-8 °C lagern. Eine Arbeitskonzentration von 0,1 mM Taurin wird durch Zugabe von 50 μl der Stammlösung pro 100 ml NRDM erreicht.</li>
		<li>NRDM: Komponieren Sie NRDM mit DMEM/F12-GlutaMAX-Medium, 1 % N2-Ergänzung, 10 % fötalem Rinderserum, 0,5 mM RA und 0,1 mM Taurin (siehe Materialtabelle). Bei 2-8 °C bis zu 2 Wochen oder 6 Monate bei -20 °C lagern, um die Aktivität der Komponenten zu gewährleisten.</li>
	</ol></li>
	<li>Blockierungspuffer: 1:9 mit DPBS verdünnen, um eine 10%ige Arbeitslösung für den Gebrauch zu erhalten (siehe Materialtabelle). Bei -20 °C bis zu 5 Jahre lagern. HINWEIS: Führen Sie alle anderen Verfahren in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II durch, um die Sterilität zu gewährleisten, mit Ausnahme des Wiegens. Wenn während des Vorbereitungsprozesses gewogene Reagenzien hinzugefügt werden müssen, verwenden Sie 0,22-μm-Filter für die Filtration.</li>
</ol>2. Kultivierung von H9-ESCs
<ol><li>Auftauen von H9-ESCs<ol><li>Geben Sie 1 ml 1 % ECM in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. 1 h in einem Inkubator bei 37 °C in einer 5 % CO2 -Atmosphäre inkubieren. Anmerkungen: Vermeiden Sie die Zugabe von ECM entlang der Bohrlochwände, da es an der Oberfläche haften bleiben kann.</li>
		<li>Nehmen Sie einen H9-ESC-Kryoröhrchen-Fond aus dem Flüssigstickstofftank und schütteln Sie ihn 30 s lang schnell in 37 °C warmem Wasser. HINWEIS: Lassen Sie die Durchstechflasche nicht vollständig auftauen.</li>
		<li>Nehmen Sie die Durchstechflasche heraus und sterilisieren Sie sie vorsichtig mit 75% desinfizierendem Alkoholspray. Geben Sie das aufgetaute H9-ESC aus dem Kryofläschchen in ein 15-ml-Röhrchen mit 9 ml MM mit 10 μM Y-27632.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 190 × g für 5 min bei RT. Entfernen Sie vorsichtig den größten Teil des Überstands mit einer 1-ml-Pipette, wobei ca. 50 μl Überstand übrig bleiben, um Zellverlust zu vermeiden.</li>
		<li>Geben Sie 1 ml MM mit 10 μM Y27632 in das Zellsediment und resuspendieren Sie das Zellsediment vorsichtig mit einer 1-ml-Pipette, indem Sie 5-10 Mal auf und ab pipettieren.</li>
		<li>Entfernen Sie die ECM-Beschichtung nach 1 Stunde Inkubation. Geben Sie 2 ml vorgewärmtes MM mit 10 μM Y-27632 in jede Vertiefung.</li>
		<li>Geben Sie 0,5 ml Zellsuspension pro Well ab. Schütteln Sie die Platte vorsichtig seitlich, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten.</li>
		<li>Die Platte wird bei 37 °C unter 5 % CO2 mindestens 24 h inkubiert, ohne sie zu berühren.</li>
		<li>Wechseln Sie das Medium täglich. Wenn die Klondichte 70 % und mehr erreicht, ist eine Passage erforderlich.</li>
	</ol></li>
	<li>Passage von H9-ESCs<ol><li>Bereiten Sie die ECM-beschichtete Platte wie oben beschrieben vor (Schritt 2.1.1) und fügen Sie 2 ml MM pro Vertiefung hinzu.</li>
		<li>Entfernen Sie das verbrauchte Medium von den 6-Well-Platten. Waschen Sie jede Mulde zweimal mit 1 ml DPBS.</li>
		<li>Waschen Sie jede Mulde zweimal, indem Sie langsam 1 ml EDTA hinzufügen und 4-7 Minuten lang bei RT mit 1 ml EDTA inkubieren. HINWEIS: Untersuchen Sie die 6-Well-Platte während der Inkubation 3 Minuten lang unter einem Mikroskop. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort, wenn sich die meisten Zellen von der Schale lösen. Vermeiden Sie eine lange Inkubationszeit, um negative Auswirkungen auf die Zellen zu reduzieren.</li>
		<li>EDTA verwerfen und 1 ml MM hinzufügen, um die Verdauung abzubrechen.</li>
		<li>Klopfen Sie vorsichtig auf die Well-Platte, bis sich die Mehrheit der Zellen abgelöst hat.</li>
		<li>Übertragen Sie die Zellsuspension vorsichtig mit einer 5-ml-Pipette in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Suspendieren Sie die H9-ESC-Kolonien vorsichtig 3-5 Mal auf und ab, um sie mit einer Pasteur-Pitette zu mischen. 20-100 μl Zellsuspension in eine neue ECM-beschichtete 6-Well-Kulturschale geben und hin und her schütteln.</li>
		<li>Wenn die Zelldichte unter dem Mikroskop als ausreichend angesehen wird, wird die Platte bei 37 °C unter 5 % CO2 mindestens 24 h lang inkubiert, ohne sie zu berühren.</li>
		<li>Wechseln Sie täglich die Medien. Bei einer Klondichte von 70 % und mehr ist eine Passage erforderlich.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Erzeugung menschlicher NRs
HINWEIS: Sobald die Kolonien eine Konfluenz von etwa 70 % erreicht haben, können sie mit den in Abbildung 1 beschriebenen Verfahrensschritten auf die Differenzierung in Netzhautorganoide (ROs) ausgerichtet werden.
<ol><li>Tag 0 - Bildung des Embryoidkörpers (EB)<ol><li>Nachdem Sie die Zellen mit 2 ml DPBS gewaschen haben, geben Sie 0,5 ml CDS (siehe Materialtabelle) mit 20 μM Y27632 in die Vertiefung. 3 min bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Inkubator inkubieren. HINWEIS: Unter einem Mikroskop prüfen. Verkürzen Sie die Inkubationszeit so weit wie möglich, um schädliche Auswirkungen auf die Zellen zu vermeiden.</li>
		<li>Verdau durch Zugabe von 3 ml MM mit 20 μM Y27632 abbrechen. Bei 190 × g 5 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen.</li>
		<li>Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml gfCDM mit 20 μM Y27632 und zählen Sie die Zellen. Fügen Sie das entsprechende Volumen für 1,2 × 106 Zellen (1,2 × 104 Zellen pro Well) zu 10 ml gfCDM hinzu, das mit 20 μM Y-27632, 3 μM IWR1-endo, 10 μM SB431542 und 100 nM LDN-193189 vorintegriert ist (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Geben Sie 100 μl Zellsuspension in jede Vertiefung von konischen Vertiefungen mit 96 V-Boden. Legen Sie die Platte bis zum 6. Tag in einen befeuchteten 5% CO2 -Inkubator. HINWEIS: Bewegen Sie das Geschirr mindestens 24 Stunden lang nicht, um die Haftung von EBs zu verbessern.</li>
	</ol></li>
	<li>Tag 6 - Netzhaut-Induktion<ol><li>An Tag 6 werden 10 ml gfCDM mit 55 ng/ml BMP4 hinzugefügt, um einen vollständigen Wechsel des Nährmediums auf den EBs zu ermöglichen. Stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. HINWEIS: Pipettieren Sie in Richtung der Wände der konischen Vertiefung mit 96 V-Boden, um Luftblasen zu vermeiden. Vermeiden Sie die Aufnahme von Organoiden beim Wechsel des Mediums.</li>
		<li>Führen Sie an Tag 9, Tag 12 und Tag 15 einen halben bis mittleren Wechsel durch. Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums durch frisches gfCDM, um das BMP4 allmählich zu verdünnen.</li>
	</ol></li>
	<li>Tag 18 - Langfristige NR-Kultur<ol><li>Übertragen Sie die gebildeten EBs am 18. Tag vorsichtig mit 5-ml-Pasteurpipetten in 15-ml-Zentrifugenröhrchen und spülen Sie sie erneut vorsichtig mit NRDM aus. Übertragen Sie die EBs auf adsorptionsarme 6-Well- oder 24-Well-Platten (siehe Materialtabelle). Stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator.</li>
		<li>Ersetzen Sie das Medium alle 3 Tage durch frisches NRDM. HINWEIS: Schalten Sie das Licht während des Medienwechsels aus, da die RA lichtempfindlich ist. Entfernen Sie schlecht differenzierte Organoide und trennen Sie anhaftende Organoide unter einem Mikroskop.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Analyse menschlicher NRs
<ol><li>Montage der ROs<ol><li>Wählen Sie verschiedene Generationen von H9-ESCs aus, um drei Chargen von ROs zu induzieren. HINWEIS: Drei Platten mit der Anzahl der sich bildenden NRs für jede der drei bewerteten Methoden (Kuwahara et al.12, Döpper et al.27 und die modifizierte Methode in der vorliegenden Studie) werden berechnet, um die Induktionserfolgsrate zu bewerten. Die Induktion gilt als erfolgreich, wenn die Lichtmikroskopie am 30. Tag die Bildung neuroepithelähnlicher Strukturen zeigt.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunfluoreszenzfärbung von ROs<ol><li>Übertragen Sie 3-5 ROs auf 1,5 ml-Röhrchen. Überschüssiges Medium abpipettieren und die ROs einmal mit 1 ml DPBS bei RT waschen. Lassen Sie die ROs sinken und entfernen Sie vorsichtig die DPBS. 1 ml 4%iges Paraformaldehyd (siehe Materialtabelle) pro 1,5-ml-Röhrchen zugeben und bei 4 °C fixieren. HINWEIS: ROs an Tag 6 und Tag 18, fix 2 h. Fixieren Sie für 12 h an Tag 30 und 14 h an Tag 60.</li>
		<li>Nach der Fixierung mit Gradientenalkohol dehydrieren. Lassen Sie die ROs jeweils 15 Minuten in 50 %, 60 % und 70 % Alkohol und anschließend jeweils 10 Minuten in 80 %, 90 %, 95 %, 100 % und 100 % Alkohol stehen. Fügen Sie dann eine 1:1-Mischung aus 100% Alkohol und Xylol für 10 Minuten hinzu, gefolgt von Xylol zweimal für jeweils 10 Minuten.</li>
		<li>Legen Sie die ROs 40 Minuten lang in Metallformen, die mit geschmolzenem Paraplast gefüllt sind (siehe Materialtabelle), und schrecken Sie die Formen dann auf Eis ab, um die ROs zu fixieren. Legen Sie Einbettboxen in die Formen und frieren Sie sie über Nacht bei -20 °C ein. Lösen Sie anschließend vorsichtig die Einbettungsboxen. Lagern Sie sie schließlich bei RT.</li>
		<li>Erstellen Sie kontinuierliche Abschnitte (5 μm Dicke) mit einem Paraffinschneider. Fixieren Sie die Schichten auf Adhäsionsmikroskop-Objektträgern, trocknen Sie sie und lagern Sie sie bei RT.</li>
		<li>Führen Sie vor der Antigenreparatur eine Entparaffinierung und Rehydrierung durch12,27.</li>
		<li>10 ml 20x pH 6,0 Citrat Antigen Retrieval Solution (siehe Materialtabelle) zu 190 ml ddH2O (doppelt destilliertes H2O) geben. In der Mikrowelle auf hoher Stufe 4 Minuten erhitzen, bis sie kochen. Nach dem Hinzufügen von Paraffinabschnitten erhitzen Sie die Abschnitte 20 Minuten lang im niedrigen Modus, um die Antigenreparatur abzuschließen.</li>
		<li>Lassen Sie die Paraffinabschnitte in einem belüfteten Bereich auf natürliche Weise abkühlen und legen Sie sie dann in eine feuchte Kammer.</li>
		<li>Verwenden Sie einen Pap-Stift (siehe Materialtabelle), um die Abschnitte zu skizzieren. Inkubieren Sie mit 0,2 % Triton X-100 bei RT für 30 Minuten, um die Membranen zu brechen, gefolgt von dreimaligem Waschen der Objektträger mit TPBS für jeweils 5 Minuten.</li>
		<li>Mit 10 % Eselserum, verdünnt in DPBS bei RT, 1 h in einer feuchten Kammer mit 10 μl pro Färbebereich blockieren.</li>
		<li>Fügen Sie primäre Antikörper hinzu, die in 10% Eselserum verdünnt sind. Über Nacht bei 4 °C in einer Feuchtigkeitskammer inkubieren. Waschen Sie die Proben dreimal mit TPBS für jeweils 10 Minuten, um den ungebundenen Antikörper zu entfernen. HINWEIS: Primäre Antikörper sind wie folgt: Anti-PAX6 (1: 250), Anti-SOX2 (1: 200), Anti-KI67 (1: 200), Anti-CHX10 (1: 200), Anti-β Tubulin III (1: 250) und Anti-NESTIN (1: 200) (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Mit in DPBS verdünnten Sekundärantikörpern 1 h bei RT in einer befeuchteten Kammer inkubieren. Wiederholen Sie den Waschschritt mit TPBS dreimal für jeweils 10 Minuten. HINWEIS: Im Dunkeln aufbewahren, um ein Abschrecken des fluoreszierenden Sekundärantikörpers zu verhindern. Sekundäre Antikörper sind Alexa Fluor 488, konjugiert mit Esel-Anti-Maus-IgG und Alexa Fluor 568, konjugiert mit Esel-Anti-Kaninchen-IgG in einer Verdünnung von 1:400 (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Inkubieren Sie mit DPBS, das DAPI (1: 500; siehe Materialtabelle) enthält, 10 Minuten lang bei RT im Dunkeln. Dreimal mit TPBS für jeweils 10 min waschen.</li>
		<li>Geben Sie eine angemessene Menge Anti-Fluoreszenz-Versiegelung (siehe Materialtabelle) auf den Objektträger und decken Sie ihn mit Deckgläsern ab.</li>
		<li>Visualisieren Sie mit einem flussähnlichen quantitativen Gewebezellanalysator (siehe Materialtabelle) oder ähnlichem.</li>
		<li>Lagern Sie Objektträger nach mikroskopischer Analyse bei -20 °C im Dunkeln.</li>
	</ol></li>
</ol>

Verbesserte 3D-Differenzierung der neuronalen Netzhaut von menschlichen embryonalen Stammzellen

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<li>Bose, R., Banerjee, S., Dunbar, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+neurological+disorders+in+3D+organoids+using+human-derived+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Modeling neurological disorders in 3D organoids using human-derived pluripotent stem cells.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 640212(2021).</li>
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<li>Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+organoids%3A+cultivation%2C+differentiation%2C+and+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation.</a> Front Cell Neurosci. 15, 638439(2021).</li>
<li>Zerti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+simple+method+to+enhance+the+generation+of+cone+and+rod+photoreceptors+in+pluripotent+stem+cell-derived+Retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids.</a> Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((transcriptome+profiling%2C+and+functional+validation+of+cone-rich+human+Retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).</li>
<li>Yamasaki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+Chk1+inhibitor+and+BMP4+cooperatively+promotes+retinal+tissue+formation+in+self-organizing+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture.</a> Regen Ther. 19, 24-34 (2022).</li>
<li>Döpper, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+protocol+for+3D+Retinal+organoids%2C+immunostaining+and+signal+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120(2020).</li>
<li>Norrie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoblastoma+from+human+stem+cell-derived+Retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids.</a> Nat Commun. 12 (1), 4535(2021).</li>
</ol>

Alle Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Menschliche ROs können die Entwicklung der fetalen Netzhaut räumlich und zeitlich rekapitulieren, und frühe ROs weisen in äquivalenten Entwicklungsstadien einen hohen Grad an Ähnlichkeit mit der fetalen Netzhaut auf15. In Bezug auf Gewebemorphologie und molekulare Expression spiegelt die menschliche RO den tatsächlichen Wachstumsstatus des Netzhautgewebes genau wider und bietet enorme und beispiellose Möglichkeiten in den Bereichen Krankheitsmodellierung, Wirkstoffscreening und regenerative Medizi...

Das Auge dient als primäre Informationsquelle unter den menschlichen Sinnesorganen, wobei die Netzhaut das wichtigste visuelle Sinnesgewebe in Säugetieraugen ist1. Retinopathie ist eine der wichtigsten globalen Ursachen für Augenkrankheiten, die zur Erblindung führen2. Weltweit leiden etwa 2,85 Millionen Menschen an unterschiedlich starken Sehstörungen aufgrund einer Retinopathie3. Daher ist die Untersuchung seiner Pathogenese entscheidend für eine frühzeitige Diagnose und rechtzeitige Behandlung. Die meisten Studien zur menschlichen Retinopathie haben sich hauptsächlich auf Tiermodelle konzentriert 4,5,6. Die menschliche Netzhaut ist jedoch ein komplexes, vielschichtiges Gewebe, das aus verschiedenen Zelltypen besteht. Herkömmliche zweidimensionale (2D) Zellkultur- und Tiermodellsysteme sind in der Regel nicht in der Lage, die normale räumlich-zeitliche Entwicklung und den Arzneimittelstoffwechsel der nativen menschlichen Netzhaut originalgetreu zu rekapitulieren 7,8.
In jüngster Zeit haben sich 3D-Kulturtechniken entwickelt, um gewebeähnliche Organe aus pluripotenten Stammzellen (PSCs) zu erzeugen9,10. Retinale Organoide (ROs), die aus menschlichen PSCs in einem 3D-Suspensionskultursystem erzeugt werden, enthalten nicht nur sieben retinale Zelltypen, sondern weisen auch eine ausgeprägte geschichtete Struktur auf, die der menschlichen Netzhaut in vivo ähnelt 11,12,13. Humane PSC-abgeleitete ROs haben an Popularität und weit verbreiteter Verfügbarkeit gewonnen und sind derzeit die besten In-vitro-Modelle zur Untersuchung der Entwicklung und Erkrankung der menschlichen Netzhaut14,15. In den letzten Jahrzehnten haben zahlreiche Forscher gezeigt, dass sich menschliche PSCs, einschließlich embryonaler Stammzellen (ESCs) und induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs), mithilfe verschiedener Induktionsprotokolle in ROs differenzieren können. Diese Fortschritte bergen ein enormes Potenzial in der Retinopathie für die Krankheitsmodellierung, das Wirkstoffscreening und stammzellbasierte Therapien 16,17,18.
Die Erzeugung von neuronaler Netzhaut (NR) aus humanen pluripotenten Stammzellen (PSCs) ist jedoch ein komplexer, umständlicher und zeitaufwändiger Prozess. Darüber hinaus können Variationen von Charge zu Charge bei Gewebeorganoiden zu einer geringeren Reproduzierbarkeit der Ergebnisse führen 19,20. Zahlreiche intrinsische und extrinsische Faktoren können die Ausbeute an retinalen Organoiden (ROs) beeinflussen, wie z. B. die Anzahl oder Spezies der Ausgangszellen und die Verwendung von Transkriptionsfaktoren und niedermolekularen Verbindungen 21,22,23. Seit der Erzeugung der ersten menschlichen RO durch das Sasai-Labor11 wurden im Laufe der Jahre mehrere Modifikationen vorgeschlagen, um die Einfachheit und Wirksamkeit des Induktionsprozesses zu verbessern 13,21,24,25. Leider wurde bis heute kein Goldstandardprotokoll für die Erzeugung von ROs in allen Labors festgelegt. In der Tat gibt es ein gewisses Maß an Diskrepanz bei ROs, das sich aus verschiedenen Induktionsmethoden ergibt, sowie große Unterschiede in der Expression von Netzhautmarkern und der Robustheit ihrer Struktur22,26. Diese Probleme können die Probenentnahme und die Interpretation der Studienergebnisse erheblich erschweren. Daher ist ein konsolidierteres und robusteres Differenzierungsprotokoll erforderlich, um die Effizienz bei minimaler Heterogenität der RO-Erzeugung zu maximieren.
Diese Studie beschreibt ein optimiertes Induktionsprotokoll, das auf einer Kombination von Kuwahara et al.12 und Döpper et al.27 mit detaillierten Anweisungen basiert. Die neue Methode reduziert die Wahrscheinlichkeit der Organoidvesikulation und -fusion signifikant und erhöht die Erfolgsrate bei der Erzeugung von NR. Diese Entwicklung ist vielversprechend für die Modellierung von Krankheiten, das Screening von Medikamenten und Zelltherapieanwendungen für Netzhauterkrankungen.

<table><tbody><tr><td>0,01 M TPBS</td><td>Servicebio</td><td>G0002</td><td>Waschscheiben</td></tr><tr><td>4 % Paraformaldehyd</td><td>Servicebio</td><td>G1101-500ML</td><td>Fix Netzhaut-Organoide</td></tr><tr><td>5 mL Pasteur-Pipette</td><td>NEST Biotechnologie</td><td>318516</td><td>Pipette Netzhaut-Organoide</td></tr><tr><td>96 konische Vertiefungen mit V-Boden</td><td>Sumitomo Bakelit</td><td>MS-9096VZ</td><td></td></tr><tr><td>Adhäsionsmikroskop-Objektträger</td><td>CITOTEST</td><td>188105</td><td>Fix-Scheiben</td></tr><tr><td>AggreWell medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5893</td><td>Medium</td></tr><tr><td>Wasserfreies Ethanol</td><td>SINOPHARM</td><td>10009218</td><td>Dehydrierung</td></tr><tr><td>Anti-CHX10</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-365519</td><td>Primärantikörper</td></tr><tr><td>Antifade Lösung</td><td>ZSGB-BIO</td><td>ZLI-9556</td><td></td></tr><tr><td>Anti-KI67</td><td>Abcam</td><td>ab16667</td><td>Primärer Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-NESTIN</td><td>Sigma</td><td>N5413</td><td>Primärer Antikörper</td></tr><tr><td>Antineuronal Klasse III &beta;-Tubulin (TUJ1)</td><td>Beyotime</td><td>AT809</td><td>Primärer Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-PAX6</td><td>Abcam</td><td>ab195045</td><td>Primärer Antikörper</td></tr><tr><td>Zelldissoziationslösung (CDS)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7922</td><td>Zelldissoziation</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Selleckchem</td><td>S2924</td><td>GSK-3&alpha;/&beta; Hemmer</td></tr><tr><td>Cholesterin Lipid Konzentrat</td><td>Gibco</td><td>12531018</td><td>250-fach;</td></tr><tr><td>Citrat Antigen Retrieval Solution</td><td>Servicebio</td><td>G1202-250ML</td><td>20&times;, pH 6.0</td></tr><tr><td>CS10</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>1001061</td><td>Cell Freezing Medium</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>Nukleare Gegenfärbung</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td>Medium</td></tr><tr><td>DMEM/F12-GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td>Medium</td></tr><tr><td>Esel Anti-Maus Alexa Fluor Plus 488</td><td>Invitrogen</td><td>A32766</td><td>Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>Esel Anti-Kaninchen Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A10042</td><td>Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>Ethylendiamin Tetraessigsäure (EDTA)</td><td>Biosharp</td><td>BL518A</td><td>0,5 M, pH 8,0, Zelldissoziation</td></tr><tr><td>Extrazelluläre Matrix (ECM)</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Beschichtungsplatten</td></tr><tr><td>F12-Glutamax</td><td>Gibco</td><td>31765035</td><td>Medium</td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>A5669701</td><td></td></tr><tr><td>Flow-like tissue cell quantitative analyzer</td><td>TissueGnostics</td><td>TissueFAXS Plus</td><td>Scan-Schnitte</td></tr><tr><td>IMDM-GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31980030</td><td>Medium</td></tr><tr><td>IWR1-endo</td><td>Selleckchem</td><td>S7086</td><td>Wnt-Inhibitor</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Ersatz</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189 2HCl</td><td>Selleckchem</td><td>S7507</td><td>BMP-Inhibitor</td></tr><tr><td>24-Well-Platten mit geringer Adhäsion</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platten mit geringer Adhäsion</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Erhaltungsmedium (MM)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>Medium</td></tr><tr><td>N2 Ergänzung</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Normales Eselsserum</td><td>Solarbio</td><td>SL050</td><td>Blocking-Puffer</td></tr><tr><td>Paraplast</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td>Gewebeeinbettung</td></tr><tr><td>PBS pH 7,4 basisch (1x)</td><td>Gibco</td><td>C10010500BT</td><td>Ohne Ca+,Mg+</td></tr><tr><td>Rekonbinantes menschliches Knochenmorphogenetisches Protein-4(rhBMP4)</td><td>R& D</td><td>314-BP</td><td>Schlüsselproteinfaktor</td></tr><tr><td>Retinsäure</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Pulver, vor Licht schützen</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Selleckchem</td><td>S1067</td><td>ALK5-Inhibitor</td></tr><tr><td>SU5402</td><td>Selleckchem</td><td>S7667</td><td>Tyrosinkinase-Inhibitor</td></tr><tr><td>Super PAP Pen</td><td>ZSGB-BIO</td><td>ZLI-9305</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma</td><td>T0625-10G</td><td></td></tr><tr><td>Thioglycerol</td><td></td><td>Sigma M1753</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Permeabilisierung</td></tr><tr><td>WA09 embryonale Stammzelllinie</td><td>WiCell Research</td><td></td><td>Institute Zelllinie</td></tr><tr><td>Xylol</td><td>SINOPHARM</td><td>10023418</td><td>Entparaffinierung</td></tr><tr><td>Y-27632 2HCL</td><td>Selleckchem</td><td>S1049</td><td>ROCK-Inhibitor</td></tr></tbody></table>

erzeugung neuronaler netzhaut aus humanen pluripotenten stammzellen

Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells

Die Retinopathie ist weltweit eine der Hauptursachen für Erblindung. Die Untersuchung seiner Pathogenese ist für die frühzeitige Diagnose und rechtzeitige Behandlung der Retinopathie unerlässlich. Leider behindern ethische Barrieren das Sammeln von Beweisen von Menschen. In jüngster Zeit haben zahlreiche Studien gezeigt, dass humane pluripotente Stammzellen (PSCs) unter Verwendung verschiedener Induktionsprotokolle in retinale Organoide (ROs) differenziert werden können, die in der Retinopathie ein enormes Potenzial für die Krankheitsmodellierung, das Wirkstoffscreening und stammzellbasierte Therapien haben. Diese Studie beschreibt ein optimiertes Induktionsprotokoll zur Erzeugung einer neuralen Netzhaut (NR), das die Wahrscheinlichkeit von Vesikulation und Fusion signifikant reduziert und die Erfolgsrate der Produktion bis zum 60. Tag erhöht. Basierend auf der Fähigkeit von PSCs, sich nach der Dissoziation selbst zu reorganisieren, kombiniert mit bestimmten komplementären Faktoren, kann diese neue Methode die NR-Differenzierung spezifisch vorantreiben. Darüber hinaus ist der Ansatz unkompliziert, kostengünstig, weist eine bemerkenswerte Wiederholbarkeit und Effizienz auf, bietet ermutigende Aussichten für personalisierte Modelle von Netzhauterkrankungen und bietet ein reichliches Zellreservoir für Anwendungen wie Zelltherapie, Wirkstoffscreening und Gentherapietests.

Eine grafische Übersicht über das geänderte Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. H9-ESCs wurden zur Erzeugung von ROs verwendet, wenn die Zellen auf eine Dichte von 70 % bis 80 % gezüchtet wurden. Einzelzellsuspensionen von H9-ESCs in konischen Vertiefungen mit 96 V-Boden aggregierten sich an Tag 1 und bildeten bis Tag 6 gut umschriebene runde EBs. Mit zunehmender Kulturzeit nahm das Volumen der EBs allmählich zu. Am Tag 30 wurden während der langfristigen NR-Differenzierung deutlich ne...

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein optimiertes 3D-System zur Induktion neuronaler Netzhaut, das die Adhäsion und Fusion von Netzhautorganoiden mit hoher Wiederholbarkeit und Effizienz reduziert.

Erzeugung neuronaler Netzhaut aus humanen pluripotenten Stammzellen

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of ...

Unsere Gruppe konzentriert sich auf das Verständnis der Pathogenese und die Behandlung menschlicher Netzhauterkrankungen. Unser Protokoll beschreibt eine optimierte Induktionstechnik zur Erzeugung einer neuronalen Netzhaut, die die Wahrscheinlichkeit von Vaskulation und Fusion signifikant reduziert, um die Erfolgsrate der Netzhautproduktion bis zum 60. Tag zu erhöhen. Die modifizierte Methode ist einfacher und effizienter bei der Erzeugung der neuronalen Netzhaut, die sich als besseres Krankheitsmodell für das Screening von Medikamenten und die Zelltherapie erweisen kann.In Zukunft wollen wir die Auswirkungen physikalisch-chemischer Faktoren auf die Netzhautentwicklung und den zugrunde liegenden Mechanismus mit unserem Netzhaut-Organoid-Modell untersuchen.

generating-neural-retina-from-human-pluripotent-stem-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Neuroblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen neuronalen Vorläuferzellen und neuronalen Zelltypen in sich entwickelnden ZNS für neuronale Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

Protokolle für die neuronale Differenzierung von pluripotenten menschlichen Stammzellen (hPSCs) sind oft zeitaufwendig und erfordern erhebliche Zellkultur Fähigkeiten. Hier haben wir ein kleines Molekül-basierte Differenzierung Verfahren zu einem multititre Plattenformat angepasst, die eine einfache, schnelle und effiziente Erzeugung von menschlichen Nervenzellen in einer kontrollierten Art und Weise.

Schnelle und effiziente Erzeugung von Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem Multititre Platte Format

Aus Stammzellen gewonnene retinale Pigmentepithelzellen (RPE) können für mehrere Anwendungen verwendet werden, einschließlich zellbasierter Therapien für Netzhautdegeneration, Krankheitsmodellierung und Medikamentenstudien. Hier stellen wir ein einfaches Protokoll zur reproduzierbaren Gewinnung von RPE aus Stammzellen vor.

Effiziente Ableitung von Retinapigmentepithel-Zellen aus Stammzellen

Hier präsentieren wir ein von der Community akzeptiertes Protokoll im Multimedia-Format für die subretinale Injektion eines Bolus von RPE-Zellen in Ratten und Mäuse. Dieser Ansatz kann zur Bestimmung von Rettungspotenzialen, Sicherheitsprofilen und Überlebenskapazitäten von transplantierten RPE-Zellen nach Implantation in Tiermodellen der Netzhautdegeneration verwendet werden.

Darstellende Subretinale Injektionen in Nagetiere zu retinalen Pigmentepithelzellen in Suspension liefern

Dieses Protokoll beschreibt die retinalen Pigment Epithelzellen (RPE) aus pluripotenten Stammzellen zu produzieren. Die Methode verwendet eine Kombination von Wachstumsfaktoren und kleine Moleküle, um die Differenzierung von Stammzellen in unreifen RPE in vierzehn Tagen und Reifen, funktionale RPE nach drei Monaten zu lenken.

Schnelle, gezielte Differenzierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen

Die Produktion von spezialisierten netzhautzellen aus pluripotenten Stammzellen ist ein Wendepunkt in der Entwicklung der Stammzell-Therapie für Erkrankungen der Netzhaut. Der vorliegende Beitrag beschreibt eine einfache Methode für eine effiziente Erzeugung von retinalen Organellen und retinalen Pigment Epithel für Grund-, translationalen und klinischen Forschung.

Definierten Xeno-frei und Feeder-freie Kulturbedingungen für die Generation der menschlichen iPSC-abgeleitete Retinal Zellmodellen

Wir beschreiben eine Methode um eine netzhautgewebe bestehend aus retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen gezüchtet auf menschliche amniotic Membranen und deren Vorbereitung für die Verpflanzung in Tiermodellen zu konstruieren.

Engineering-Transplantation geeignet retinalen Pigment Epithel Gewebe abgeleitet aus humanen embryonalen Stammzellen

Mit einer selbstorganisierenden Methode entwickeln wir ein Protokoll mit dem Zusatz von COCO, das die Bildung von Photorezeptoren signifikant erhöhen könnte.

Gerichtete Induktion retinaler Organoide aus humanen pluripotenten Stammzellen

Hier beschreiben wir ein optimiertes retinale Organoid-Induktionssystem, das für verschiedene humane pluripotente Stammzelllinien geeignet ist, netzhautähnliche Gewebe mit hoher Reproduzierbarkeit und Effizienz zu erzeugen.

Retinale Organoid-Induktionssystem zur Ableitung von 3D-Netzhautgewebe aus humanen pluripotenten Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Differenzierung von hiPS-Zellen in Augenfeld-Cluster und zur Erzeugung neuro-retinaler Organoide unter Verwendung vereinfachter Kulturbedingungen, die sowohl adhärente als auch Suspensionskultursysteme umfassen. Auch andere Augenzelltypen, wie das RPE und das Hornhautepithel, können aus reifen Augenfeldern in Netzhautkulturen isoliert werden.

Erzeugung retinaler Organoide aus gesunden und netzhautspezifischen, human-induzierten pluripotenten Stammzellen

Erfahren Sie eine optimierte 3D-Induktionsmethode zur Erzeugung neuronaler Netzhaut aus humanen pluripotenten Stammzellen. Dieses Protokoll reduziert Organoid-Adhäsion und Fusion erheblich und verbessert Effizienz sowie Reproduzierbarkeit für die Augenheilkunde.

Erzeugung neuronaler Netzhaut aus humanen pluripotenten Stammzellen

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