Name: AQRNA-seq zur Quantifizierung kleiner RNAs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Erfahren Sie die AQRNA-seq-Methode zur absoluten Quantifizierung kleiner RNAs wie microRNAs und tRNAs. Diese Technik überwindet Limitationen traditioneller RNA-Seq-Verfahren und ermöglicht präzise Analysen in Mycobacterium bovis BCG.

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Die Autoren der vorliegenden Arbeit danken den Autoren der ursprünglichen Arbeit, die die AQRNA-seq-Technologie7 beschreibt. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (ES002109, AG063341, ES031576, ES031529, ES026856) und der National Research Foundation of Singapore über die Singapore-MIT Alliance for Research and Technology Antimicrobial Resistance IRG unterstützt.

Analyse der tRNA-Dynamik mit AQRNA-seq

<ol><li>Byron, S. A., Van Keuren-Jensen, K. R., Engelthaler, D. M., Carpten, J. D., Craig, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+RNA+sequencing+into+clinical+diagnostics%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gen%22%5BJournal%5D)">Translating RNA sequencing into clinical diagnostics: opportunities and challenges.</a> Nat Rev Gen. 17 (5), 257-271 (2016).</li>
<li>Grillone, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-coding+RNAs+in+cancer%3A+platforms+and+strategies+for+investigating+the+genomic+%26%2334%3Bdark+matter.%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Non-coding RNAs in cancer: platforms and strategies for investigating the genomic &#34;dark matter.&#34.</a> J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 117(2020).</li>
<li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).</li>
<li>Goh, J. J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+multiplexed+RNA+imaging+in+tissues+with+split-FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly specific multiplexed RNA imaging in tissues with split-FISH.</a> Nat Methods. 17 (7), 689-693 (2020).</li>
<li>Moses, L., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Museum+of+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Museum of spatial transcriptomics.</a> Nat Methods. 19 (5), 534-546 (2022).</li>
<li>Cummings, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+genetic+diagnosis+in+Mendelian+disease+with+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Improving genetic diagnosis in Mendelian disease with transcriptome sequencing.</a> Sci Transl Med. 9 (386), 5209(2017).</li>
<li>Hu, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mapping+of+the+cellular+small+RNA+landscape+with+AQRNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Quantitative mapping of the cellular small RNA landscape with AQRNA-seq.</a> Nat Biotech. 39 (8), 978-988 (2021).</li>
<li>Alon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoding+bias+in+high-throughput+multiplex+sequencing+of+miRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Barcoding bias in high-throughput multiplex sequencing of miRNA.</a> Genome Res. 21 (9), 1506-1511 (2011).</li>
<li>Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bias+in+ligation-based+small+RNA+sequencing+library+construction+is+determined+by+adaptor+and+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure.</a> PLoS One. 10 (5), e0126049(2015).</li>
<li>Pang, Y. L. J., Abo, R., Levine, S. S., Dedon, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+cell+stresses+induce+unique+patterns+of+tRNA+up-+and+down-regulation%3A+tRNA-seq+for+quantifying+changes+in+tRNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Diverse cell stresses induce unique patterns of tRNA up- and down-regulation: tRNA-seq for quantifying changes in tRNA copy number.</a> Nuc Acids Res. 42 (22), e170(2014).</li>
<li>Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+frequencies+of+post-transcriptional+modifications+in+tRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs.</a> RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+impact+of+RNA+secondary+structure+across+the+Arabidopsis+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulatory impact of RNA secondary structure across the Arabidopsis transcriptome.</a> Plant Cell. 24 (11), 4346-4359 (2012).</li>
<li>García-Nieto, P. E., Wang, B., Fraser, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+diversity+is+a+systematic+source+of+variation+in+RNA-sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome diversity is a systematic source of variation in RNA-sequencing data.</a> PLOS Comput Biol. 18 (3), e1009939(2022).</li>
<li>FASTQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fastp%3A+an+ultra-fast+all-in-one+FASTQ+preprocessor%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor.</a> Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R%3A+a+language+and+environment+for+statistical+computing%5BTitle%5D)+AND+%22R+Foundation+for+Statistical+Computing%22%5BJournal%5D)">R: a language and environment for statistical computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2022).</li>
<li>Ougland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AlkB+restores+the+biological+function+of+mRNA+and+tRNA+inactivated+by+chemical+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">AlkB restores the biological function of mRNA and tRNA inactivated by chemical methylation.</a> Mol Cell. 16 (1), 107-116 (2004).</li>
<li>Bernhardt, H. S., Tate, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+soup+or+vinaigrette%3A+did+the+RNA+world+evolve+at+acidic+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Direct%22%5BJournal%5D)">Primordial soup or vinaigrette: did the RNA world evolve at acidic pH.</a> Biol Direct. 7, 4(2012).</li>
<li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+local+alignment+search+tool%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic local alignment search tool.</a> J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet.+J%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet. J. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
</ol>

P.C.D. ist Erfinder von zwei Patenten (PCT/US2019/013714, US 2019/0284624 A1), die sich auf das veröffentlichte Werk beziehen.

Der Arbeitsablauf zur Vorbereitung der AQRNA-seq-Bibliothek wurde entwickelt, um die Erfassung von RNAs in einer Probe zu maximieren und den Polymeraseabfall während der reversen Transkriptionzu minimieren 7. Durch eine zweistufige Linker-Ligation werden neuartige DNA-Oligos (Linker 1 und Linker 2) im Überschuss ligiert, um die RNA in der Probe vollständig zu ergänzen. Überschüssige Linker können effizient mit RecJf, einer 5'- bis 3'-Exonuklease, die für einzelsträngige DNAs spezifisch ist, entfer...

Next-Generation-Sequencing (NGS), auch bekannt als massiv parallele Sequenzierung, ist eine DNA-Sequenzierungstechnologie, die DNA-Fragmentierung, Ligation von Adapter-Oligonukleotiden, Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierte Amplifikation, Sequenzierung der DNA und Reassemblierung der Fragmentsequenzen zu einem Genom umfasst. Die Anpassung von NGS an Sequenz-RNA (RNA-seq) ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Identifizierung und Quantifizierung von RNA-Transkripten und deren Varianten1. Innovative Entwicklungen bei Arbeitsabläufen zur Vorbereitung von RNA-Bibliotheken und bioinformatischen Analysepipelines, gepaart mit Fortschritten bei Laborinstrumenten, haben das Repertoire an RNA-Seq-Anwendungen erweitert und sind über die Exomsequenzierung hinaus zu fortschrittlichen funktionellen Omics-Anwendungen wie nicht-kodierendem RNA-Profiling2, Einzelzellanalyse3, räumlicher Transkriptomik 4,5 und alternativer Spleißanalyse6 vorangeschrittenunter anderem. Diese fortschrittlichen RNA-seq-Methoden decken komplexe RNA-Funktionen durch quantitative Analyse des Transkriptoms in normalen und erkrankten Zellen und Geweben auf.
Trotz dieser Fortschritte in der RNA-seq schränken mehrere wichtige technische Merkmale die quantitative Leistungsfähigkeit der Methode ein. Während die meisten RNA-seq-Methoden eine präzise und genaue Quantifizierung von Änderungen der RNA-Spiegel zwischen experimentellen Variablen (d. h. biologischen Proben und/oder physiologischen Zuständen) ermöglichen, können sie keine quantitativen Vergleiche der Konzentrationen von RNA-Molekülen in einer Probe liefern. Zum Beispiel können die meisten RNA-seq-Methoden die relative Anzahl der Kopien einzelner tRNA-Isoakzeptormoleküle in einem zellulären Pool exprimierter tRNAs nicht genau quantifizieren. Wie in der Begleitpublikation7 hervorgehoben, ergibt sich diese Einschränkung des RNA-seq aus mehreren Merkmalen der RNA-Struktur und der Biochemie der Bibliotheksvorbereitung. Zum Beispiel wird die Aktivität der Ligationsenzyme, die zum Anhängen der 3'- und 5'-End-Sequenzierungslinker an RNA-Moleküle verwendet werden, stark von der Identität der terminalen Nukleotide der RNA und der Sequenzierungslinker beeinflusst. Dies führt zu großen Schwankungen in der Effizienz von Linker-Ligationen und zu tiefgreifenden künstlichen Steigerungen der Sequenzierungs-Reads 8,9,10.
Eine zweite Reihe von Einschränkungen ergibt sich aus den inhärenten strukturellen Eigenschaften von RNA-Molekülen. Insbesondere die Bildung der RNA-Sekundärstruktur und dynamische Veränderungen in den Dutzenden von posttranskriptionellen RNA-Modifikationen des Epitranskriptoms können zu einem Polymeraseabfall oder einer Mutation während der reversen Transkription führen. Diese Fehler führen zu einer unvollständigen oder verkürzten cDNA-Synthese oder einer veränderten RNA-Sequenz. Während diese beiden Phänomene ausgenutzt werden können, um Sekundärstrukturen oder einige Modifikationen zu kartieren, verschlechtern sie die quantitative Genauigkeit von RNA-seq, wenn nachfolgende Bibliotheksvorbereitungsschritte keine verkürzten cDNAs erfassen oder wenn die Datenverarbeitung mutierte Sequenzen auswirft, die nicht mit einem Referenzdatensatz übereinstimmen11,12. Darüber hinaus verringert die immense chemische, längen- und strukturelle Vielfalt von RNA-Transkripten sowie der Mangel an Werkzeugen zur gleichmäßigen Fragmentierung langer RNAs die Anwendbarkeit der meisten RNA-seq-Methoden auf alle RNA-Spezies13.
Die AQRNA-seq-Methode (absolute Quantifizierung RNA-Sequenzierung) wurde entwickelt, um mehrere dieser technischen und biologischen Einschränkungen zu beseitigen, die die quantitative Genauigkeit einschränken7. Durch die Minimierung sequenzabhängiger Verzerrungen bei der Erfassung, Ligation und Amplifikation während der Vorbereitung der RNA-Sequenzierungsbibliotheken erreicht AQRNA-seq eine überlegene Linearität im Vergleich zu anderen Methoden und quantifiziert 75 % einer Referenzbibliothek von 963 miRNAs mit 2-facher Genauigkeit. Diese lineare Korrelation von Sequenzierung, Lesezahl und RNA-Abundanz wird auch bei der Analyse eines Pools variabler Länge von RNA-Oligonukleotidstandards und in Bezug auf orthogonale Methoden wie Northern Blot beobachtet. Die Etablierung der Linearität zwischen der Anzahl der Sequenzierungs-Reads und der RNA-Abundanz ermöglicht AQRNA-seq eine genaue, absolute Quantifizierung aller RNA-Spezies innerhalb einer Probe.
Im Folgenden finden Sie eine Beschreibung des Protokolls für den Workflow zur Vorbereitung von AQRNA-seq-Bibliotheken und der zugehörigen nachgelagerten Datenanalyse-Pipeline. Die Methode wurde angewendet, um die Dynamik der tRNA-Abundanz während der hungerinduzierten Ruhephase und der anschließenden Wiederbelebung im Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Guérin (BCG) Modell der Tuberkulose aufzuklären. Die Ergebnisse wurden für die explorative Visualisierung der Sequenzierungsdaten vorgestellt, zusammen mit anschließenden Clustering- und differentiellen Expressionsanalysen, die erkennbare Muster in der tRNA-Abundanz aufdeckten, die mit verschiedenen Phänotypen assoziiert sind.

<table><tbody><tr><td>2-Ketoglutarat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75890</td><td>Bereiten Sie eine Arbeitslösung (1 M) vor und lagern Sie sie bei -20° ordm; C</td></tr><tr><td>2100 Bioanalysator Messgerät</td><td>Agilent</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Adenosin 5'-Triphosphat (ATP)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (Komponente #: N0437AVIAL)</td><td>NEB M0437M enthält T4 RNA Ligase 1 (30 U/&mu; L), T4-RNA-Ligase-Reaktionspuffer (10X), PEG 8000 (1X) und ATP (100 mM); Bereiten Sie eine Arbeitslösung (10 mM) vor und lagern Sie sie bei -20 μ ordm; C</td></tr><tr><td>AGAROSE GPG/LE</td><td>AmericanBio</td><td>AB00972-00500</td><td>Bei Raumtemperatur lagern</td></tr><tr><td>Ammonium-Eisen(II)-sulfat-Hexahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2262</td> Eine <td>Arbeitslösung (0,25 M) herstellen und bei -20 μg lagern; C</td></tr><tr><td>Bioanalysator für die Analyse kleiner RNAs</td><td>Agilent</td><td>5067-1548&nbsp;</td><td>Die Small-RNA-Analyse dient zur Überprüfung der Qualität von Input-RNAs und der Effizienz enzymatischer Reaktionen (z.B. Linker-1-Ligation)</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA; 10 mg/ml) &nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000</td><td>Dieses Produkt wurde am 15.12.2022 eingestellt und durch Rekombinantes Albumin, Molecular Biology Grade (NEB B9200) ersetzt.</td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td><td>Macron Feinchemikalien</td><td>4441-10</td><td></td></tr><tr><td>Demethylase&nbsp;</td><td>ArrayStar</td><td>AS-FS-004</td><td>Demethylase wird mit der rtStar tRNA Vorbehandlung & Erststrang-cDNA-Synthesekit (AS-FS-004)</td></tr><tr><td>Desoxynukleotid (dNTP) Solution Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L (Komponente #: N0447LVIAL)</td><td>Dieser dNTP-Lösungsmix enthält äquimolare Konzentrationen von dATP, dCTP, dGTP und dTTP (jeweils 10 mM)</td></tr><tr><td>Digitaler Dual-Heizblock</td><td>VWR Scientific Products</td><td>13259-052</td><td>Der Heizblock wird mit dem QIAquick&nbsp; Gel-Extraktions-Kit&nbsp;</td></tr><tr><td>DyeEx&nbsp; 2.0 Spin Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>63204&nbsp;</td><td>Wirksam bei der Entfernung kurzer Reste (z. B. Oligos mit einer Länge von weniger als 10 bp)</td></tr><tr><td>Elektrophorese-Netzteil</td><td>Bio-Rad Labrotories</td><td>PowerPac 300</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf PCR Röhrchen (0,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>0030124537</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Röhrchen (0,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>022363611</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Röhrchen (1,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Röhrchen (2 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>022363352</td><td></td></tr><tr><td>Ethylalkohol (Ethanol), reines</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023&nbsp;</td><td>Das reine Ethanol wird mit dem Oligo Clean and Concentrator Kit von Zymo Research verwendet</td></tr><tr><td>Gel Imaging System</td><td>Alpha Innotech</td><td>FluorChem 8900</td><td></td></tr><tr><td>Gel Loading Dye, Purple (6X), kein SDS</td><td>New England Biolabs</td><td>N0556S (Komponente #: B7025SVIAL)</td><td>NEB N0556S enthält Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder und Gel Loading Dye, Purple (6X), kein SDS</td></tr><tr><td>GENESYS 180 UV-Vis Spektralphotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>840-309000</td><td>Das Spektralphotometer wird zur Messung der Oligokonzentrationen nach dem Beerschen Gesetz</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td> verwendet<td>. Bereiten Sie eine Arbeitslösung (1 M; pH = 8 mit NaOH) vor und lagern Sie sie bei -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Salzsäure (HCl) & nbsp;</td><td>VWR Scientific Produkte</td><td>BDH3028&nbsp;</td><td>Bereiten Sie eine Arbeitslösung (5 M) vor und lagern Sie sie bei Umgebungstemperatur</td></tr><tr><td>Isopropylalkohol (Isopropanol), reines</td><td>Macron Feinchemikalien</td><td>3032-16</td><td>Isopropanol wird mit dem QIAquick verwendet&nbsp; Gel-Extraktions-Kit&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td> Eine <td>Arbeitslösung (0,5 M) herstellen und bei -20 μm lagern; C</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spektralphotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2 (10X)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0264L (Komponente #: B7002SVIAL)</td><td>NEB M0264L enthält RecJf (30 U/&mu; L) und NEBuffer 2 (10X); Lagerung bei -20 °; C</td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser (nicht DEPC-behandelt)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9938&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Oligo Clean & Konzentrator-Kit&nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>D4061&nbsp;</td><td>Bei Raumtemperatur lagern</td></tr><tr><td>PEG 8000 (50%ige Lösung)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (Komponente #: B1004SVIAL)</td><td>NEB M0437M enthält T4 RNA Ligase 1 (30 U/&mu; L), T4-RNA-Ligase-Reaktionspuffer (10X), PEG 8000 (1X) und ATP (100 mM); Bereiten Sie eine Arbeitslösung (10 mM) vor und lagern Sie sie bei -20 μ ordm; C</td></tr><tr><td>Peltier Thermocycler</td><td>MJ Research</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:choloroform:isoamyl&nbsp; Alkohol 25:24:1 pH = 5,2&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J62336&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript Puffer (5X)</td><td>TaKaRa</td><td>2680A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript Reverse Transkriptase</td><td>TaKaRa</td><td>2680A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick&nbsp; Gel-Extraktions-Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Dieses Kit benötigt einen Heizblock und Isopropanol, um mit</td></tr><tr><td>Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder</td><td>New England</td><td>Biolabs N0551S (Komponente #: N0551SVIAL)</td><td></td></tr><tr><td>Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N0556S (Komponente #: N0556SVIAL)</td><td>NEB N0556S enthält Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder und Gel Loading Dye, Purple (6X), kein SDS</td></tr><tr><td>RecJf&nbsp; (30 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0264L (Komponente #: M0264LVIAL)</td><td>NEB M0264L enthält RecJf (30 U/&mu; L) und NEBuffer 2 (10X); Lagerung bei -20 °; C</td></tr><tr><td>RNase Inhibitor (murin; 40 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0314L&nbsp;( Komponente #: M0314LVIAL)</td><td>Bei -20 Grad lagern; C</td></tr><tr><td>SeqAMP&nbsp; DNA-Polymerase&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>638509&nbsp;</td><td>TaKaRa 638509 enthält SeqAMP&nbsp; DNA-Polymerase&nbsp; und SeqAMP&nbsp; PCR-Puffer (2X)</td></tr><tr><td>SeqAMP&nbsp; PCR-Puffer (2X)&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>638509&nbsp;</td><td>TaKaRa 638509 enthält SeqAMP&nbsp; DNA-Polymerase&nbsp; und SeqAMP&nbsp; PCR-Puffer (2X)</td></tr><tr><td>Garnelen-Alkalische Phosphatase (1 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371L&nbsp;( Komponente #: M0371LVIAL)</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; S5881</td><td>Arbeitslösung (5 M) herstellen und bei Raumtemperatur</td></tr><tr><td>lagern T4 DNA-Ligase (400 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L&nbsp;( Komponente #: M0202LVIAL)</td><td>NEB M0202L enthält T4-DNA-Ligase (400 U/&mu; L) und T4-DNA-Ligase-Reaktionspuffer (10X)</td></tr><tr><td>T4-DNA-Ligase-Reaktionspuffer (10X)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L&nbsp;( Komponente #: B0202SVIAL)</td><td>NEB M0202L enthält T4 DNA Ligase (400 U/&mu; L) und T4 DNA Ligase Reaktionspuffer (10X)</td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 1 (30 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (Komponente #: M0437MVIAL)</td><td>NEB M0437M enthält T4 RNA Ligase 1 (30 U/&mu; L), T4-RNA-Ligase-Reaktionspuffer (10X), PEG 8000 (1X) und ATP (100 mM)</td></tr><tr><td>T4-RNA-Ligase-Reaktionspuffer (10X)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (Komponente #: B0216SVIAL)</td><td>NEB M0437M enthält T4 RNA Ligase 1 (30 U/&mu; L), T4-RNA-Ligase-Reaktionspuffer (10X), PEG 8000 (1X) und ATP (100 mM)</td></tr></tbody></table>

aqrna-seq zur quantifizierung kleiner rnas

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

AQRNA-seq bietet eine direkte lineare Beziehung zwischen den Lesezahlen der Sequenzierung und der Anzahl kleiner RNA-Kopien in einer biologischen Probe und ermöglicht so eine genaue Quantifizierung des Pools kleiner RNAs. Das hier beschriebene Verfahren zur Vorbereitung der AQRNA-seq-Bibliothek beinhaltet die Verwendung von kundenspezifisch entwickelten Sequenzierungslinkern und einen Schritt zur Reduzierung von Methylierungs-RNA-Modifikationen, die die Prozessivität der reversen Transkription blockieren, was zu einer erhöhten Ausbeute an cDNAs in voller Länge führt. Darüber hinaus wird eine detaillierte Implementierung der begleitenden Bioinformatik-Pipeline vorgestellt. Diese Demonstration von AQRNA-seq wurde durch eine quantitative Analyse der 45 tRNAs in Mycobacterium bovis BCG durchgeführt, die an 5 ausgewählten Tagen über einen Zeitraum von 20 Tagen mit Nährstoffentzug und 6 Tagen Wiederbelebung entnommen wurden. Die laufenden Bemühungen zur Verbesserung der Effizienz und Strenge von AQRNA-seq werden hier ebenfalls erörtert. Dazu gehört die Erforschung von Methoden zur Vermeidung der Gelaufreinigung, zur Minderung von Primer-Dimer-Problemen nach der PCR-Amplifikation und zur Erhöhung des Anteils von Reads in voller Länge, um ein genaueres Read-Mapping zu ermöglichen. Zukünftige Verbesserungen von AQRNA-seq werden sich auf die Erleichterung der Automatisierung und Hochdurchsatzimplementierung dieser Technologie zur Quantifizierung aller kleinen RNA-Spezies in Zell- und Gewebeproben verschiedener Organismen konzentrieren.

Mycobacterium bovis BCG (bacilli de Calmette et Guérin) Stamm 1173P2, die exponentiell wuchsen, wurden einer Zeitreihe (0, 4, 10 und 20 Tage) von Nährstoffmangel unterzogen, gefolgt von einer 6-tägigen Wiederbelebung in nährstoffreichem Medium, wie zuvor in Hu et al.7 beschrieben. Kleine RNAs wurden aus Bakterienkulturen mit drei biologischen Replikaten zu jedem der fünf festgelegten Zeitpunkte isoliert. Die Illumina-Bibliotheken wurden unter Verwendung des oben beschriebenen AQRNA-seq-Ve...

Die absolute Quantifizierung der RNA-Sequenzierung (AQRNA-seq) ist eine Technologie, die entwickelt wurde, um die Landschaft aller kleinen RNAs in biologischen Gemischen zu quantifizieren. Hier werden sowohl die Bibliotheksvorbereitung als auch die Datenverarbeitungsschritte von AQRNA-seq demonstriert, wobei Veränderungen im Transfer-RNA (tRNA)-Pool in Mycobacterium bovis BCG während der hungerinduzierten Dormanzphase quantifiziert werden.

AQRNA-seq zur Quantifizierung kleiner RNAs

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate ...

Bei der AQRNA-Sequenzierung werden kleine RNAs wie microRNAs, tRNAs und tRNA-Fragmente in praktisch jeder Zell- oder Gewebeprobe quantitativ abgebildet. Es kann verwendet werden, um einige der 170 bekannten tRNA-Modifikationen zu kartieren, aber es gibt auch andere Methoden, die spezifischer für die Kartierung sind. Sie können AQRNA-seq verwenden, um Krankheitsbiomarker im RNome zu entdecken und Proteintranslationsmechanismen auf Systemebene zu untersuchen.Die meisten RNA-Seq-Methoden können die Häufigkeit einzelner RNA-Moleküle in einer Probe nicht genau quantifizieren. Dies wird sowohl durch strukturelle Eigenschaften der RNA, wie z.B. Sekundärstrukturen, posttranskriptionelle Modifikationen, als auch durch die Biochemie der Bibliotheksvorbereitung verursacht, wie z.B. tausendfache Ligationsverzerrungen, die durch die terminalen Nukleotide auf den RNAs induziert werden. AQRNA-seq wurde entwickelt, um mehrere technische und biologische Herausforderungen zu überwinden und die genaue Quantifizierung der RNA-Häufigkeit in der Probe einzuschränken.Im Vergleich zu anderen Themen erreicht es eine Linearität zwischen Nachzählungen und Kopienzahlen von RNA-Molekülen, es quantifiziert 75%

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

MicroRNAs (miRNAs) sind eine weit verbreitete Klasse von regulatorischen Molekülen. Hier beschreiben wir eine miRNA-Klonierungsmethode, die auf zwei potenten Ligationsschritten beruht, gefolgt von einer Hochdurchsatz-Sequenzierung. Unsere Methode ermöglicht eine genaue genomweite Quantifizierung von miRNAs.

Hoch effiziente Ligation kleine RNA-Moleküle für MicroRNA Quantifizierung von Hochdurchsatz-Sequenzierung

Zirkulierende microRNAs haben in letzter Zeit als vielversprechend und neue Biomarker für verschiedene Krebsarten und anderen Krankheiten. Das Ziel dieses Artikels ist es, drei verschiedene Sonden-basierten Echtzeit-PCR-Plattformen und Methoden, die zur Verfügung zu quantifizieren und zu bestimmen, die Fülle der zirkulierenden microRNAs sind zu diskutieren.

Sonde-basierte Echtzeit-PCR Ansätze zur quantitativen Messung von microRNAs

Ein Protokoll zur Quantifizierung von bakteriellen 16S rRNA-Genen und Transkripten aus Küstensedimenten mittels Echtzeit-PCR wird bereitgestellt. Die Methodik umfasst die Co-Extraktion von DNA und RNA; Herstellung von DNA-freier RNA; und Quantifizierung von 16S rRNA-Genen und -Transkripten mittels RT-q-PCR, einschließlich Standardkurvenkonstruktion.

Gleichzeitige DNA-RNA-Extraktion aus Küstensedimenten und Quantifizierung von 16S rRNA-Gene und Transkripte von Real-time PCR

Wir beschreiben eine zielgerichtete RNA-Sequenzierungsmethode, die die Vorbereitung indizierter cDNA-Bibliotheken, Hybridisierung und Erfassung mit benutzerdefinierten Sonden und Datenanalyse umfasst, um ausgewählte Transkripte auf Genexpression, Mutationen und Genfusionen zu untersuchen. Targeted RNAseq ermöglicht die kostengünstige und schnelle Auswertung ausgewählter Transkripte auf einem Desktop-Sequenzierer.

RNA-Sequenzierung Assay Gezieltes Genexpression und Genomic Änderungen an Charakterisieren

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die Zuordnung Pre-mRNA 3' End-Verarbeitung Websites.

3' Ende Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung mit A-seq2

Hier beschreiben wir eine schrittweise Strategie zur Isolierung kleiner RNAs, zur Anreicherung von microRNAs und zur Vorbereitung von Proben für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz. Anschließend wird beschrieben, wie Sequenzlesevorgänge verarbeitet und mithilfe von Open-Source-Tools an microRNAs ausgerichtet werden.

Eine vollständige Pipeline zum Isolieren und Sequenzieren von MicroRNAs und deren Analyse mithilfe von Open Source Tools

Circular RNAs (circRNAs) sind nicht-kodierende RNAs, die eine Rolle bei der Transkriptionsregulation und der Vermittlung von Wechselwirkungen zwischen Proteinen spielen können. Nach Der Bewertung verschiedener Parameter für den Aufbau von CircRNA-Sequenzierungsbibliotheken wurde ein Protokoll unter Verwendung der gestrandeten Gesamt-RNA-Bibliotheksvorbereitung mit RNase R-Vorbehandlung erstellt und hier vorgestellt.

Identifizierung von kreisförmigen RNAs mittels RNA-Sequenzierung

Wir präsentieren ein detailliertes reparaturbasiertes Analyseprotokoll für kleine RNA-Bibliotheken mit weniger Voreingenommenheit als Standardmethoden und einer erhöhten Empfindlichkeit für 2'-O-Methyl-RNAs. Dieses Protokoll kann mit hausgemachten Reagenzien befolgt werden, um Kosten zu sparen oder Kits für die Bequemlichkeit zu verwenden.

Verbesserung der kleinen RNA-Seq: Weniger Voreingenommenheit und bessere Detektion von 2'-O-Methyl RNAs

Hier wird ein Protokoll zur Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) von Pflanzengeweben vorgestellt. LCM ist eine mikroskopische Technik zur kontaminationsfreien Isolierung von Gewebebereichen. Das Verfahren umfasst Gewebefixierung, Paraffineinbettung, Schnitt, LCM und RNA-Extraktion. RNA wird in der nachgeschalteten gewebespezifischen, zeitlich aufgelösten Analyse von Transkriptomen eingesetzt.

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequenzierung für räumliche und zeitliche gewebespezifische Genexpressionsanalyse in Pflanzen

Diese Arbeit präsentiert eine Methode zur schnellen und präzisen Quantifizierung der Bauchpigmentierung von Drosophila melanogaster mittels digitaler Bildanalyse . Diese Methode rationalisiert die Vorgänge zwischen der Phänotyp-Erfassung und der Datenanalyse und umfasst die Probenmontage, die Bilderfassung, die Pixelwert-Extraktion und die Merkmalsmessung.

Quantifizierung der Bauchpigmentierung in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Erfahren Sie die AQRNA-seq-Methode zur absoluten Quantifizierung kleiner RNAs wie microRNAs und tRNAs. Diese Technik überwindet Limitationen traditioneller RNA-Seq-Verfahren und ermöglicht präzise Analysen in Mycobacterium bovis BCG.

AQRNA-seq zur Quantifizierung kleiner RNAs

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