Name: Epithelzellinfektionsanalysen mit Shigellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 56 s
Description: Erfahren Sie Infektionsanalysen mit Epithelzellen zur Untersuchung von Shigella-Adhäsion, Invasion und intrazellulärer Replikation. Diese Methode unterstützt die Entwicklung wirksamer Therapeutika gegen Shigella-Infektionen.

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Die Unterstützung der Autoren umfasst die Abteilung für Pädiatrie des Massachusetts General Hospital, den Executive Committee on Research Interim Support Funding (ISF) Award 2022A009041, den National Institute of Allergy and Infectious Diseases Grant R21AI146405 und den National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Grant Nutrition Obesity Research Center at Harvard (NORCH) 2P30DK040561-26. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung über die Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.

Protokolle zur Analyse von Shigelleninfektionen in Dickdarmepithelzellen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Dieses Protokoll beschreibt eine Reihe von drei standardisierten Assays zur Untersuchung der Shigella-Adhärenz, Invasion und intrazellulären Replikation von Darmepithelzellen. Obwohl es sich bei diesen Methoden lediglich um modifizierte Versionen klassischer Gentamicin-Assays handelt, die zur Untersuchung der Invasion und intrazellulären Replikation verschiedener bakterieller Krankheitserreger in Wirtszellen verwendet werden 49,50,51, müssen bei der Untersuchung von Shigella besondere Überlegungen angestellt werden.
Shigellen sind fakultative Anaerobier, die bei 37 °C in reichhaltigem Medium mit Belüftung43 optimal wachsen. Bei der Durchführung dieser Assays zur Untersuchung der Auswirkungen verschiedener Umweltsignale oder Metaboliten auf Shigella-Infektionen wird empfohlen, Shigella über Nacht in Rich Media zu züchten und dann vor der Infektion in definierte oder ergänzte Medien zu subkultivieren. Die maximale Virulenzgenexpression tritt während der logarithmischen Wachstumsphase auf 52,53. Daher sind die Subkultivierung von Shigella-Kulturen über Nacht und das Zulassen des Bakterienwachstums in die exponentielle Phase (OD600 ~ 0,7) notwendige Schritte, um die Virulenz von Shigella richtig zu beurteilen. Darüber hinaus ist die Virulenzgenexpression temperaturabhängig. Um die Spezifität für die Expression nur während der Wirtsinfektion zu gewährleisten, werden Virulenzgene bei wirtsphysiologischen Temperaturen (37 °C) induziert und bei niedrigeren Temperaturen (z. B. 30 °C) streng unterdrückt54. Um die Expression von Virulenzgenen zu gewährleisten, müssen bakterielle Subkulturen und Infektionen bei 37 °C durchgeführt werden, wobei darauf zu achten ist, dass die Temperatur nicht unter 37 °C fällt. Ein großes Virulenzplasmid mit 220 Kilobasen, das die molekulare Maschinerie kodiert, die für die Invasion und Epithelzellinfektion erforderlich ist, ist eine wesentliche Virulenzdeterminante für alle Shigella spp.5. Wiederholtes Passieren und längeres Wachstum bei 37 °C fördern die Instabilität des Virulenzplasmids, was zu einem Plasmidverlust führt und Shigella-Zellen avirulentmacht 55. Um die Aufrechterhaltung des Virulenzplasmids und die Expression wichtiger Virulenzgene zu gewährleisten, wird empfohlen, Bakterien alle zwei Wochen direkt aus dem Gefrierschrank auf frische TSB + Kongo-rote Indikatorplatten zu restaurieren. Kongo-Rot-Agar kann verwendet werden, um zwischen wildtyp-virulenten (roten, CR+) Kolonien und avirulenten (weißen, CR-) Kolonien zu unterscheiden, die das Virulenzplasmid45 verloren haben. Wenn wiederholt eine Instabilität des Virulenzplasmids beobachtet wird, können Shigella-Kulturen über Nacht bei 30 °C inkubiert werden, um einen Verlust des Virulenzplasmids zu verhindern, gefolgt von einer Subkultivierung bei 37 °C, um die Virulenzgenexpression zu fördern43. Wenn schließlich Analysen mit Mutanten und/oder komplementären Stämmen durchgeführt werden, in denen Antibiotikamarker in diesen Bakterienstämmen vorhanden sind, wird empfohlen, die geeignete Antibiotikaauswahl während der bakteriellen Übernacht- und Subkultivierungsschritte zu verwenden.
Die Verwendung von HT-29-Epithelmonoschichten hat viele Vorteile für die Untersuchung der molekularen Mechanismen der Shigella-Pathogenese in vitro. Da Shigella ein an den Menschen angepasster Erreger ist, spiegeln Kleintiermodelle die charakteristische Pathogenese der Shigellose, die beim Menschen beobachtet wurde, nicht genau wider36. Die Verwendung standardisierter Protokolle für die Infektion von humanen Zelllinien ermöglicht somit die quantitative Untersuchung einzelner Schritte der bakteriellen Pathogenese, um das molekulare Zusammenspiel zwischen diesem Erreger und seinem nativen Wirt zu charakterisieren. In der Vergangenheit wurden HeLa-Zellen hauptsächlich zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen in vitro verwendet 25,56,57. HeLa-Zellen sind jedoch eine immortalisierte Gebärmutterhalskrebs-Zelllinie, bei der es sich um nicht-native Wirtszellen für enterische bakterielle Krankheitserreger handelt. Daher haben sich In-vitro-Studien zur enterischen Pathogenese auf die Verwendung von Dickdarm-Adenokarzinom-Zelllinien (z. B. HT-29, Caco-2 und T84) verlagert, die die intestinale Epithelmorphologie getreuer rekapitulieren und auf Transwells als epitheliale Monoschichten mit differenzierten apikalen und basolateralen Oberflächen gezüchtet werden können 58,59,60. Obwohl jede Zelllinie ihre individuellen Stärken und Schwächen hat, werden HT-29-Zellen in den hier beschriebenen Assays aufgrund phänotypischer Ähnlichkeiten mit intestinalen Enterozyten und einer robusten Expression von Zelloberflächenrezeptoren und proinflammatorischen Zytokinen verwendet 58,59,61. Bei jedem dieser diskutierten Modelle handelt es sich jedoch um von Krebs abgeleitete Zelllinien mit abweichenden Stoffwechsel- und Wachstumsphänotypen, die den natürlichen physiologischen Zustand des Dickdarmepithels in vivo nicht genau darstellen 58. Jüngste Fortschritte in der menschlichen Gewebekulturtechnik haben die Kultivierung menschlicher Darmstammzellen, die aus Gewebebiopsien gewonnen wurden, zu Organoiden oder einzelnen zweidimensionalen Zellmonoschichten ermöglicht, die die verschiedenen Zelltypen im menschlichen Magen-Darm-Trakt (GI) rekapitulieren 62,63,64 . Darmorganoide können so unterschieden werden, dass sie Enterozyten, schleimproduzierende Becherzellen, M-Zellen und andere gewebespezifische Zelltypen umfassen. Jüngste Studien haben die Verwendung dieser Organoidmodelle zur Untersuchung enterischer Krankheitserreger validiert, einschließlich verschiedener Shigella spp., Salmonella enterica und Escherichia coli pathovars 62,63,64. Obwohl Organoide genauere Modelle des menschlichen GI-Epithels sind und sogar unter verschiedenen Nährstoffbedingungen kultiviert werden können, um die Weltbevölkerung zu repräsentieren65, erfordert ihre relative Komplexität eine erhebliche Ausbildung und technisches Fachwissen, was im Vergleich zu herkömmlichen Krebszelllinien zu höheren Kosten und längeren Kultivierungszeiten führt58.
Dieses Protokoll beschreibt Methoden mit mittlerem Durchsatz, bei denen zwei 6-Well-Platten für insgesamt 12 Monolayer verwendet werden, die für die Prüfung zur Verfügung stehen. Experimente können jedoch leicht skaliert werden, um die Anzahl der Monoschichten zu erhöhen, die ausgesät werden, um zusätzliche technische Replikate unterzubringen, oder um zusätzliche Shigella-Mutanten und Umweltsignale zu testen. Gewebekulturplatten mit mehr Wells (z. B. 12-Well- oder 24-Well-Platten) können auch mit entsprechenden Anpassungen verwendet werden, um Wells mit kleineren Durchmessern zu berücksichtigen. Unter den in Schritt 3.2 beschriebenen HT-29-Wachstumsbedingungen reichen die HT-29-Titer aus, um nach der Kultivierung aus einem T75-Kolben etwa sechs 6-Well-Platten zu säen, wobei genügend Zellen verbleiben, um die HT-29-Zellkultur aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus sind die Aussaat von HT-29-Monoschichten und die Vorbereitung der inokulierenden Bakterienschritte zwischen bakteriellen Adhärenz-, Invasions- und intrazellulären Replikationsassays identisch. So können Assays, die dieselben Shigella-Stämme oder Subkulturbedingungen testen, problemlos parallel durchgeführt werden, um gleichzeitig die Rolle jeder experimentellen Bedingung in verschiedenen Schritten der Shigella-Infektion zu untersuchen.
Die Erholungstiter für adhärente (Schritt 4), eingedrungene (Schritt 5) und intrazelluläre Bakterien (Schritt 6) werden durch Ausplattierung serieller Verdünnungen infizierter HT-29-Zellen nach der Lyse bestimmt, was eine quantitative Bewertung der Effizienz jedes Stadiums der Shigella-Infektion ermöglicht. Die Zentrifugationsschritte in den Invasions- und intrazellulären Replikationsassays, die auf klassischen Assays 49,50,51 basieren, fördern den bakteriellen Kontakt mit den Wirtszellen für eine sofortige Invasion und erhöhen die Invasionsraten. Somit "überspringt" die Zentrifugation den Adhärenzschritt, der sich später als wichtiger Aspekt der Shigella-Infektion herausstellte 17,18,19,66. Es ist wichtig zu beachten, dass der Zentrifugenschritt nicht mit polarisierten Epithelzellen durchgeführt werden kann, die auf Transwells ausgesät wurden. Für den Adhärenz-Assay wird die Adhärenz jedoch nicht durch Zentrifugation erzwungen, und den infizierten HT-29-Zellen wird vor der Lyse kein Gentamicin zugesetzt, was die Zählung adhärenter Bakterienzellen ermöglicht. Das Volumen des Gewebekulturmediums wird auf 1 ml reduziert (im Gegensatz zu 2 ml für die Invasions- und intrazellulären Replikationsassays), um einen effizienteren Kontakt der Bakterien mit den HT-29-Zellen zu ermöglichen. Darüber hinaus kann es je nach Adhärenzrate während der 3-stündigen Inkubation zu einer gewissen Invasion und intrazellulären Replikation kommen, aber die Menge ist typischerweise vernachlässigbar (z. B. nur 0,05 % der wiedergewonnenen Bakterienpopulation nach der Wirtszelllyse). Um jedoch adhärente und intrazelluläre Bakterien während der 3-stündigen Inkubation richtig zu berücksichtigen, wird empfohlen, parallele Assays durchzuführen, bei denen zusätzlich zum angegebenen Protokoll eine zweite Platte mit 50 μg/ml Gentamicin in 2 ml DMEM pro Vertiefung für insgesamt 45 Minuten inkubiert wird (15 Minuten Inkubation, Waschen, frisches DMEM + Gentamycin für 30 Minuten), um extrazelluläre Bakterien gründlich zu lysieren. Nach der HT-29-Zelllyse, wie im Protokoll angegeben, können die intrazellulären Bakterien wie oben erwähnt gezählt werden und stellen die Anzahl der Bakterien dar, die eingedrungen sind. Dieser Wert kann dann ohne Gentamicin-Behandlung von den von der Platte gezählten Bakterien abgezogen werden, um anhaftende und eingedrungene Bakterien angemessen zu bestimmen. Parallele Analysen können auch durchgeführt werden, um einen besseren Einblick in die intrazelluläre Replikation von Shigella in HT-29-Zellen nach der Invasion zu erhalten, z. B. unter Verwendung mehrerer Zeitpunkte zur Durchführung intrazellulärer Wachstumskurven. Schließlich können neben der Zählung intrazellulärer Bakterien nach einer 18-stündigen Gentamicin-Inkubation die Kulturüberstände gesammelt und auf die Zytokinsekretion infizierter HT-29-Zellen analysiert werden. Zum Beispiel ist IL-8 ein Chemokin, das von Epithelzellen sezerniert wird und weitgehend dazu dient, PMNs an den Ort der Infektion zu rekrutieren. Die Menge an IL-8, die in die Kulturmedien infizierter HT-29-Zellen sezerniert wird, kann mit einem IL-8-ELISA-Assay67 analysiert werden.
Gallensalze haben sich als wichtiges Virulenzsignal für Shigellen während des Transports durch das menschliche GI-System erwiesen und können verwendet werden, um bakterielle Wachstumsmedien in diesen Protokollen zu ergänzen, um typische GI-Bedingungen zu replizieren. Natürlich werden Gallensalze in den Zwölffingerdarm oder den oberen Teil des Dünndarms eingeführt, um die Verdauung zu unterstützen. und im terminalen Ileum oder Ende des Dünndarms werden 95 % der Gallensalze entfernt und wieder in den Kreislauf zurückgeführt, um sich schließlich in der Gallenblaseabzulagern 68. Gallensalze haben normalerweise eine Konzentration zwischen 0,2 % und 2,0 % (w/v) im Dünndarm und sind von Natur aus bakterizid. Shigella widersteht jedoch zusammen mit den meisten Darmbakterien Gallensalzen und nutzt die Signale, um die Infektion zu verstärken47. Mehrere Studien haben dokumentiert, wie die Exposition gegenüber Gallensalzen, manchmal in Verbindung mit anderen Dünndarmsignalen wie Glukose, das Überleben von Shigellen und die Virulenzregulation vor der Infektion beeinflusst. Es wurde gezeigt, dass Shigella gegen Gallensalze resistent ist, die Genexpression verändert und einen Biofilm unter Bedingungen bildet und verteilt, die die Dünndarmpassage reproduzieren17,69. Die Studien haben gezeigt, dass diese Veränderungen zu einem hypervirulenten Phänotyp führen, bei dem Adhärenz und Invasion bei einer nachfolgenden Dickdarminfektion durch Shigella induziert werden 17,18,19,48,66. Daher dokumentieren die oben beschriebenen Bedingungen, wie Shigellen in Gallensalzen subkultiviert werden, um die Dünndarmpassage vor der Durchführung der Adhärenz-, Invasions- oder intrazellulären Replikationsassays nachzuahmen. Die angegebene TSB-Formulierung enthält zugesetzte Glukose im Vergleich zu typischer Luria-Bouillon (LB)17. Wenn LB verwendet wird, ist es daher wichtig, die Medien auch mit Glukose (0,5%-2,0% [w/v]) zu ergänzen, um die Glukosesignale im Dünndarm angemessen zu berücksichtigen17. Darüber hinaus werden, wie oben erwähnt, alle Shigella-Subkulturen gewaschen, um Gallensalze zu entfernen und den Übergang zum Dickdarm für Infektionsanalysen nachzuahmen.
Traditionell und wie in den obigen Ergebnissen (Abbildung 1 und Abbildung 2) hervorgehoben, sind Infektionstests wertvoll, um die Rolle eines bestimmten Gens bei der Shigella-Infektion zu bestimmen. Der Phänotyp verschiedener Mutanten kann jedoch ohne eine angemessene Ergänzung der bakteriellen Nährmedien nicht wirklich gewürdigt werden. Wie frühere Forschungen gezeigt haben, verändern Gallensalze die Genexpression von S. flexneri signifikant, einschließlich Genen für den zentralen Stoffwechsel, Transkriptionsfaktoren, Zuckertransportern, Arzneimittelresistenz und Virulenzgenen, die entweder auf dem Chromosom oder dem Virulenzplasmid17 kodiert sind. Diese Gene geben Aufschluss darüber, wie Shigella Gallensalze als Signal verwendet, um die Genexpression zu verändern und sich auf eine eventuelle Infektion des Dickdarms vorzubereiten, und nachfolgende Mutationsanalysen müssen daher in den entsprechenden ergänzten bakteriellen Wachstumsmedien durchgeführt werden, bevor die Auswirkungen auf die Virulenz in den Adhärenz-, Invasions- und intrazellulären Replikationsassays untersucht werden. Wie oben in Abbildung 1 und Abbildung 2 zu sehen ist, hatte die ΔVF-Mutation keinen Einfluss auf die Adhärenz, aber auf die Invasion und die intrazelluläre Replikation. Da die Mutation die Invasion und die intrazelluläre Replikation verstärkte, laufen derzeit Experimente, um festzustellen, wie das Genprodukt die Infektion reguliert. Die Mutantenanalysen dienen als Beispiel dafür, wie neue Erkenntnisse über die Shigella-Pathogenese untersucht werden können, insbesondere unter Bedingungen, die den menschlichen Magen-Darm-Trakt besser replizieren. Geeignete Komplementationsanalysen werden empfohlen, um die Phänotypen verschiedener Mutanten zu validieren.
In Kombination beschreiben diese Verfahren quantitative Experimente, die wichtige Einblicke in die molekularen Mechanismen der Shigella-Adhärenz , Invasion und Replikation in HT-29-Dickdarmepithelzellen liefern, indem sie die natürliche Umgebung des menschlichen Magen-Darm-Trakts während der Infektion am besten nachahmen. Zukünftige Studien können die Mutanten und experimentellen Bedingungen erweitern, um ein besseres Verständnis dafür zu erlangen, wie sich Shigella auf menschliche Wirte vorbereitet und diese effektiv infiziert. Trotz jahrzehntelanger Forschung gibt es noch so viel mehr über die Shigella-Infektion zu entdecken.

Durchfallerkrankungen, die durch bakterielle Krankheitserreger verursacht werden, sind eine erhebliche globale Gesundheitsbelastung. Im Jahr 2016 waren Durchfallerkrankungen weltweit für 1,3 Millionen Todesfälle verantwortlich und waren die vierthäufigste Todesursache bei Kindern unter fünf Jahren 1,2. Der gramnegative, enterische bakterielle Erreger Shigella ist der Erreger der Shigellose, einer der Hauptursachen für Durchfalltodesfälle weltweit3. Shigellose verursacht jedes Jahr eine signifikante Morbidität und Mortalität bei Kindern aus Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen 4,5, während Infektionen in Ländern mit hohem Einkommen mit Ausbrüchen in Kindertagesstätten, lebensmittelbedingten und wasserbedingten Ausbrüchen zusammenhängen 6,7,8,9. Die ineffektive Entwicklung von Impfstoffen 10 und die steigenden Raten von Antibiotikaresistenzen (AMR)11,12 haben das Management von großflächigen Shigella-Ausbrüchen erschwert. Jüngste Daten der Centers for Disease Control and Prevention zeigen, dass fast 46 % der Shigella-Infektionen in den Vereinigten Staaten im Jahr 2020 eine Arzneimittelresistenz aufwiesen13,14, während die Weltgesundheitsorganisation Shigella zu einem vorrangigen AMR-Erreger erklärt hat, für den dringend neue Therapien benötigt werden15.
Shigella-Infektionen werden leicht über den fäkal-oralen Weg übertragen, wenn kontaminierte Lebensmittel oder Wasser aufgenommen werden, oder durch direkten menschlichen Kontakt. Shigella hat sich zu einem effizienten, an den Menschen angepassten Krankheitserreger entwickelt, mit einer infektiösen Dosis von 10-100 Bakterien, die ausreicht, um Krankheiten zu verursachen16. Während der Dünndarmpassage ist Shigella Umweltsignalen wie erhöhter Temperatur und Galleausgesetzt 17. Der Nachweis dieser Signale induziert transkriptionelle Veränderungen, um Virulenzfaktoren zu exprimieren, die die Fähigkeit der Bakterien verbessern, den menschlichen Dickdarm zu infizieren 17,18,19. Shigella dringt nicht von der apikalen Oberfläche in das Dickdarmepithel ein, sondern durchquert die Epithelschicht und folgt der Aufnahme in spezialisierte antigenpräsentierende Mikrofaltenzellen (M-Zellen) innerhalb des follikelassoziierten Epithels 20,21,22. Nach der Transzytose werden Shigella-Zellen von residenten Makrophagen phagozytiert. Shigella entkommt schnell dem Phagosom und löst den Zelltod der Makrophagen aus, was zur Freisetzung von entzündungsfördernden Zytokinen führt 5,23,24. Shigella dringt dann von der basolateralen Seite in Dickdarmepithelzellen ein, lysiert die makropinozytäre Vakuole und etabliert eine replikative Nische im Zytoplasma 5,25. Proinflammatorische Zytokine, insbesondere Interleukin-8 (IL-8), rekrutieren polymorphkernige neutrophile Leukozyten (PMNs) an den Ort der Infektion, was die epithelialen Tight Junctions schwächt und eine bakterielle Infiltration der Epithelaushaut ermöglicht, um die basolaterale Infektion zu verschlimmern5. Die PMNs zerstören die infizierte Epithelschleimhaut, um die Infektion einzudämmen, was zu den charakteristischen Symptomen einer bazillären (blutigen) Ruhr führt5. Obwohl die Invasions- und intrazellulären Replikationsmechanismen gründlich charakterisiert wurden, zeigen neue Forschungsergebnisse wichtige neue Konzepte bei Shigella-Infektionen, einschließlich der Virulenzregulation während des gastrointestinalen (GI) Transits17, der Adhärenz19, des verbesserten basolateralen Zugangs durch Barrierepermeabilität26 und der asymptomatischen Übertragung bei unterernährten Kindern27.
Die Fähigkeit von Shigella spp., Durchfallerkrankungen zu verursachen, ist auf Menschen und nicht-menschliche Primaten (NHP) beschränkt28. Shigella-Darminfektionsmodelle wurden für Zebrafische29, Mäuse30, Meerschweinchen31, Kaninchen21, 32, 33 und Schweine34, 35 entwickelt. Keines dieser Modellsysteme kann jedoch die während einer menschlichen Infektion beobachteten Krankheitsmerkmale genau reproduzieren36. Obwohl NHP-Modelle der Shigellose zur Untersuchung der Shigella-Pathogenese etabliert wurden, sind diese Modellsysteme teuer in der Implementierung und erfordern künstlich hohe infektiöse Dosen, die bis zu neun Größenordnungen höher sind als die infektiöse Dosis des Menschen 37,38,39,40,41,42. Daher erfordert die bemerkenswerte Anpassung von Shigella an die Infektion menschlicher Wirte die Verwendung von Zellkulturen menschlichen Ursprungs, um physiologisch relevante Modelle für eine genaue Untersuchung der Shigella-Pathogenese zu erstellen.
Hier werden detaillierte Verfahren beschrieben, um die Raten der Shigella-Adhärenz, Invasion und Replikation innerhalb von HT-29-Dickdarmepithelzellen zu messen. Mit diesen standardisierten Protokollen können die molekularen Mechanismen, durch die bakterielle Virulenzgene und Umweltsignale jeden Schritt der Shigella-Infektion beeinflussen, untersucht werden, um die dynamische Wirt-Pathogen-Interaktionsbeziehung besser zu verstehen.

<table><tbody><tr><td>0,22 μm m PES-Filter</td><td>Millipore-Sigma SCGP00525</td><td></td><td>Steriler Polyethersulfon-Filter zur Sterilisation von Medien bis zu 50 mL 14</td></tr><tr><td>mL Kulturröhrchen</td><td>Corning</td><td>352059</td><td>17 mm x 100 mm Polypropylen-Reagenzgläser mit Kappe</td></tr><tr><td>50 mL konische Röhrchen</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>50 mL Zentrifugenröhrchen aus klarem Polypropylen mit konischem Boden und auslaufsicherer Kappe</td></tr><tr><td>6-Well-Gewebekulturplatten</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>Die Platten sind für eine optimale Zelladhäsion behandelt</td></tr><tr><td>Gallensalze</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8756</td><td>1:1 Verhältnis von Cholat zu Desoxycholat</td></tr><tr><td>Kongorot-Farbstoff</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6277</td><td>Ein anionischer Diazofarbstoff auf Benzidinbasis mit einer Reinheit von >85 %</td></tr><tr><td>Countess Zellzählkammer-Objektträger</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Zur Verwendung mit dem Countess Automated Cell Counter</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>A, ein hochpolares organisches Reagenz</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiziertes Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td>DMEM wird mit hohem Glukosegehalt, Natriumpyruvat, GlutaMAX und Phenol Red</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td> <td>ergänztSigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td>Hitzeinaktiviertes, steriles</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3632</td><td>Stammkonzentration beträgt 50 mg/ml</td></tr><tr><td>HT-29 Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td>Adenokarzinom-Zelllinie; kolorektal in Herkunft</td></tr><tr><td>Paraffinfolie</td><td>Bemis</td><td>PM999</td><td>Labor-Siegelfolie</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>100 mm x 15 mm Petrischalen für feste</td></tr><tr><td>Medien Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td>1x Konzentration; pH 7,4</td></tr><tr><td>Select Agar</td><td>Invitrogen</td><td>30391023</td><td>Eine Mischung aus Polysacchariden, die aus Zellwänden von Rotalgen extrahiert werden, um bakterielle Beschichtungsmedien</td></tr><tr><td>herzustellen T75-Kolben</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td>Gewebekulturkolben</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Ein gängiges nichtionisches Tensid und Emulgator&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypanblau-Fleck</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Ein Farbstoff zum Nachweis toter Gewebekulturzellen; nur lebende Zellen können den Farbstoff ausschließen</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Reagenz zur Zelldissoziation zur Erhaltung und Passage von Zelllinien</td></tr><tr><td>Tryptische Sojabrühe (TSB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8907</td><td>Bakterielle Wachstumsmedien</td></tr></tbody></table>

epithelzellinfektionsanalysen mit shigellen

Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella

Der an den Menschen angepasste bakterielle Erreger Shigella verursacht jedes Jahr Millionen von Infektionen, erzeugt langfristige Wachstumseffekte bei pädiatrischen Patienten und ist weltweit eine der Hauptursachen für Durchfalltode. Eine Infektion führt zu wässrigem oder blutigem Durchfall, da der Erreger den Magen-Darm-Trakt durchquert und die Epithelzellen infiziert, die den Dickdarm auskleiden. Angesichts der erschütternden Zunahme von Antibiotikaresistenzen und des derzeitigen Mangels an zugelassenen Impfstoffen sind standardisierte Forschungsprotokolle für die Untersuchung dieses gewaltigen Erregers von entscheidender Bedeutung. Hier werden Methoden vorgestellt, um die molekulare Pathogenese von Shigella anhand von In-vitro-Analysen der bakteriellen Adhärenz, Invasion und intrazellulären Replikation in Dickdarmepithelzellen zu untersuchen. Vor Infektionsanalysen wurde der Virulenzphänotyp der Shigella-Kolonien durch die Aufnahme des Kongorotfarbstoffs auf Agarplatten verifiziert. Supplementierte Labormedien können auch während der Bakterienkultivierung in Betracht gezogen werden, um In-vivo-Bedingungen nachzuahmen. Bakterienzellen werden dann in einem standardisierten Protokoll verwendet, um Dickdarmepithelzellen in Gewebekulturplatten bei einer etablierten Infektionsvielfalt mit Anpassungen zur Analyse jedes Infektionsstadiums zu infizieren. Für Adhärenz-Assays werden Shigella-Zellen mit reduzierten Medienkonzentrationen inkubiert, um den bakteriellen Kontakt mit Epithelzellen zu fördern. Sowohl für Invasions- als auch für intrazelluläre Replikationsassays wird Gentamicin in verschiedenen Zeitintervallen angewendet, um extrazelluläre Bakterien zu eliminieren und die Beurteilung der Invasion und/oder die Quantifizierung intrazellulärer Replikationsraten zu ermöglichen. Alle Infektionsprotokolle zählen adhärente, eingedrungene und/oder intrazelluläre Bakterien auf, indem infizierte Epithelzelllysate seriell verdünnt und bakterielle koloniebildende Einheiten relativ zu den Infektionstitern auf Kongo-Rotagarplatten plattiert werden. Zusammen ermöglichen diese Protokolle eine unabhängige Charakterisierung und Vergleiche für jedes Stadium der Shigella-Infektion von Epithelzellen, um diesen Erreger erfolgreich zu untersuchen.

Adhärenz-, Invasions- und intrazelluläre Replikationsassays wurden durchgeführt, um den Wildtyp (WT) von S. flexneri 2457T mit S. flexneri ΔVF (ΔVF) zu vergleichen, einer Mutante, von der angenommen wird, dass sie die Virulenz von Shigella negativ reguliert. Da Shigella Gallensalze als Signal zur Regulierung der Virulenz verwendet 17,18,47, wurden Experimente nach bakterieller Subkultur in TSB-Medien sowie TSB durchgeführt, das mit 0,4% (w/v) Gallensalzen ergänzt wurde 18. Die Exposition gegenüber Gallensalzen während des Subkulturschritts dient als Vorbehandlung, um die Dünndarmpassage vor einer Dickdarminfektion zu replizieren 17,18,47. Abbildung 1 analysiert die Wirkung der ΔVF-Mutation auf die Fähigkeit von S. flexneri, an HT-29-Dickdarmepithelzellen zu haften. Die prozentuale Adhärenz wird auf der y-Achse aufgetragen und stellt das Verhältnis der zurückgewonnenen Bakterien nach der HT-29-Lyse dar, standardisiert auf die Anzahl der Eingangsbakterien. Wie erwartet zeigten sowohl S. flexneri WT- als auch ΔVF-Stämme eine signifikante Zunahme der Adhärenz, wenn sie mit Gallensalz-Supplementierung subkultiviert wurden, im Vergleich zu TSB ohne Gallensalz-Supplementierung18. Es gab jedoch keinen Unterschied in der Adhärenz an HT-29-Zellen zwischen WT- und ΔVF-Mutantenstämmen innerhalb jeder Subkulturbedingung. Diese Daten deuten darauf hin, dass die ΔVF-Mutation keinen Einfluss auf die Fähigkeit von S. flexneri hat, mit oder ohne Gallensalzvorbehandlung an HT-29-Epithelzellen zu haften.
In Abbildung 2 wurde die Wirkung der ΔVF-Mutation auf die Fähigkeit von S. flexneri analysiert, in HT-29-Dickdarmepithelzellen mit oder ohne Gallensalzvorbehandlung einzudringen (Abbildung 2A) und sich zu replizieren (Abbildung 2B). Die prozentuale Wiederfindung ist auf der y-Achse dargestellt und stellt das Verhältnis der zurückgewonnenen Bakterienzellen nach HT-29-Zelllyse dar, standardisiert auf die Anzahl der Eingangsbakterien. In Abbildung 2A wurde ein signifikanter Anstieg der Fähigkeit von WT S. flexneri 2457T erwartet, nach Vorexposition mit Gallensalzen in HT-29-Zellen einzudringen48, während die S. flexneri ΔVF-Mutante im Vergleich zum WT-Stamm einen geringeren Anstieg der Invasion nach Gallensalzen vor der Exposition aufwies. Die ΔVF-Mutante hatte erhöhte Invasionsraten von HT-29-Zellen im Vergleich zu den WT, die in TSB subkultiviert wurden, hatte aber ähnliche Invasionsraten wie WT, wenn sie in TSB subkultiviert wurde, die mit Gallensalzen ergänzt wurde (Abbildung 2A). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die ΔVF-Mutation die Fähigkeit von S. flexneri erhöht, in HT-29-Zellen einzudringen, was die Wirkung der Gallensalze vor der Exposition verringert, obwohl die Invasionsfähigkeit der ΔVF-Mutante nach der Gallensalz-Subkultur weiter zunahm.
Insgesamt wurden nach der Inkubation über Nacht 10-mal mehr Bakterien gefunden (Abbildung 2B) als nach der 90-minütigen Inkubation (Abbildung 2A), was die Unterschiede bei der Überwachung des intrazellulären Wachstums bzw. der Invasion zeigt. Wenn infizierte HT-29-Zellen 18 Stunden lang inkubiert wurden, um eine intrazelluläre Replikation der Bakterien zu ermöglichen (Abbildung 2B), verringerte sich die Wirkung der Gallensalz-Vorbehandlung sowohl für die WT- als auch für die ΔVF-Stämme . Die reduzierte Wirkung der Gallensalz-Vorbehandlung während der intrazellulären Replikation war jedoch für die ΔVF-Mutante dramatischer. Da der Anstieg der intrazellulären Replikation beider Stämme bei Vorexposition gegenüber Gallensalzen geringer war als der Anstieg der Invasionsraten unter den gleichen Bedingungen, stellen wir die Hypothese auf, dass Gallensalze einen größeren Einfluss auf die frühen Schritte der Pathogenese von S. flexneri haben. Die ΔVF-Mutante zeigte eine prozentuale Erholung von der Replikation über Nacht in HT-29-Zellen im Vergleich zu WT (Abbildung 2B) nach beiden Subkulturbedingungen. Die prozentualen Wiederfindungen der ΔVF-Mutante waren jedoch unabhängig von den Gallensalzen vor der Exposition ähnlich. Diese Datentrends deuten darauf hin, dass sich die ΔVF-Mutante im Vergleich zu WT effizienter in HT-29-Zellen repliziert und dass Gallensalze vor der Exposition die Fähigkeit der ΔVF-Mutante , sich intrazellulär zu replizieren, nicht beeinflussen, wie es bei WT beobachtet wurde (Abbildung 2B). Da der Unterschied zwischen den mutierten und WT-Stämmen in der Präexpositionsbedingung der Gallensalze während des 90-minütigen Invasionsassays nicht beobachtet wurde, stellen wir die Hypothese auf, dass das vom deletierten VF-Gen kodierte Produkt auch die Replikation von S. flexneri in HT-29-Zellen regulieren kann. Zusammengenommen zeigen beide Analysen, dass die ΔVF-Mutante im Vergleich zu WT virulenter ist, was darauf hindeutet, dass das VF-Genprodukt ein negativer Regulator der Virulenz von S. flexneri ist.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66426/66426fig01.jpg"> Abbildung 1: Gallensalze induzierten vor der Exposition die Adhärenz von S. flexneri an HT-29-Zellen. S. flexneri 2457T WT- und ΔVF-Mutantenzellen wurden entweder in TSB oder TSB subkultiviert, die mit 0,4% (w/v) Gallensalzen (TSB+BS) Medien ergänzt wurden. Die Bakterien wurden dann bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 100 auf HT-29-Zellen aufgebracht und 3 Stunden lang inkubiert, um die Adhärenz zu untersuchen. Nach der Inkubation wurden infizierte HT-29-Zellen gewaschen und lysiert, und serielle Verdünnungen der zurückgewonnenen Bakterien wurden plattiert, um koloniebildende Einheiten pro ml (KBE/ml) zu zählen. Die Anzahl der adhärenten Bakterien wird relativ zu den Eingabebakterientitern aufgetragen, um die prozentuale Adhärenz zu ermitteln. Die Daten sind repräsentativ für ein biologisches Replikat mit drei technischen Replikaten (einzelnen Punkten). Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) an. Die statistische Signifikanz wurde durch einen Student's t-Test bestimmt (*p &lt; 0,05; ***p &lt; 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66426/66426fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66426/66426fig02.jpg"> Abbildung 2: Gallensalze vor der Exposition erhöhten die Invasion von WT S. flexneri und die intrazelluläre Replikation. S. flexneri 2457T WT- und ΔVF-Mutantenzellen wurden entweder in TSB oder TSB subkultiviert, die mit Gallensalzmedien (TSB+BS) ergänzt wurden. Die Bakterien wurden dann bei einem MOI von 100 auf HT-29-Zellen aufgebracht, auf die Zellen zentrifugiert und 45 Minuten lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und extrazelluläre Bakterien wurden durch Zugabe von Gentamicin zum DMEM lysiert, um ausschließlich intrazelluläre Bakterien zurückzugewinnen. Nach 90 min (A, bakterielle Invasion) oder 18 h (B, intrazelluläre Replikation) Inkubationen wurden infizierte HT-29-Zellen gewaschen und lysiert, und serielle Verdünnungen der zurückgewonnenen Bakterien wurden plattiert, um koloniebildende Einheiten pro ml (KBE/ml) zu zählen. Die Anzahl der intrazellulären Bakterien wird relativ zu den eingegebenen Bakterientitern aufgetragen, um die prozentuale Wiederfindung zu ermitteln. Die Daten sind repräsentativ für ein biologisches Replikat mit jeweils drei technischen Replikaten (einzelnen Punkten). Fehlerbalken zeigen SEM an. Die statistische Signifikanz wurde durch den t-Test eines Studenten bestimmt (*p &lt; 0,05). Bitte beachten Sie die Unterschiede in den y-Achsenskalen zwischen den Panels (A) und (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66426/66426fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Das vorliegende Protokoll beschreibt Infektionsassays zur Abfrage der Shigella-Adhärenz, -Invasion und -intrazellulären Replikation unter Verwendung von In-vitro-Epithelzelllinien.

Epithelzellinfektionsanalysen mit Shigellen

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, ...

Shigella ist ein bedeutender globaler Krankheitserreger, der jedes Jahr verheerende Infektionsraten verursacht. Shigella infiziert den Magen-Darm-Trakt und verursacht Durchfall oder Ruhr. Unsere Forschung zielt darauf ab, unser Verständnis von Infektionen zu verbessern, um wirksamere Therapeutika wie Impfstoffe und andere antimikrobielle Produkte zu entwickeln.Erstens ermöglichen uns Tiermodelle und neue Gewebekulturtechniken, die Physiologie der Shigella-Infektion besser zu verstehen und die Komplexität des menschlichen Magen-Darm-Trakts originalgetreu zu reproduzieren. Zweitens hat die Charakterisierung klinischer Shigella-Isolate dazu beigetragen, die Vielfalt dieser Gattung zu erfassen, wichtige Virulenzgene zu identifizieren und unser Verständnis der Infektion zu verbessern. Wir haben gastrointestinale Signale wie Gallensalze und Glukose verwendet, um zu verstehen, wie Shigella den Transit im Dünndarm überlebt und die Virulenzgenexpression für Infektionen im Dickdarm reguliert.Wir haben gezeigt, wie Shigella Gallensalzen widersteht, und haben gezeigt, dass Shigella Adhärenzproteine produziert, um den Kontakt mit Epithelzellen zu initiieren, um eine Infektion auszulösen. Diese Protokolle wurden entwickelt, um Schlüsselaspekte der Epithelinfektion wie Adhärenz, Invasion und intrazelluläres Überleben von Shigellen zu untersuchen. Wir führen diese Protokolle mit einer Standard-Epithelzelllinie durch, haben aber auch die Methoden für anspruchsvolle humane GI-Modelle angepasst, die jetzt verfügbar sind.Diese Protokolle betrachten jede Phase der Infektion unabhängig, was entscheidend ist, um die wichtigsten Schritte bei der Shigella-Infektion zu verstehen. Sie heben auch hervor, dass kombinierte Analysen ein besseres Verständnis der Shigella-Infektion auf ganzheitlicher Ebene ermöglichen können.

epithelial-cell-infection-analyses-with-shigella

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Vonaesch, P. et al., Immunfluoreszenzanalyse der Stressgranulatbildung nach bakterieller Herausforderung von Säugetierzellen. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video demonstriert die Infektion von Epithelzellen mit dem pathogenen Bakterium Shigella flexneri und die daraus resultierende zelluläre Reaktion des Wirts. Bakterielle Effektorproteine stören die Wirtstranslation und lösen die Bildung membranloser Organellen aus, sogenannte Stressgranulate, die die adaptive Reaktion der Zelle auf...

Stressgranulatbildung während der Shigella-Infektion von krebsartigen Epithelzellen

Source: Poore, K., et al. Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates an in vitro assay to assess Shigella invasion and intracellular replication in human colonic epithelial monolayers. It highlights steps for infection, antibiotic selection, host cell lysis, and recovery of intracellular bacteria for downstream analysis.

Intracellular Replication Assay for Shigella in Human Colonic Epithelial Cells

Dieses Video demonstriert eine Technik zum Nachweis der lokalen und globalen Kalziumionenreaktion bei einer Shigelleninfektion von menschlichen Epithelzellen. Shigella dringt in die Wirtszellen ein und setzt Invasionseffektoren frei, die sich auf den intrazellulären Kalziumspiegel auswirken. Die Amplitude und Frequenz des lokalen und globalen zytosolischen Calciums werden mit Hilfe eines Fluoreszenzindikators untersucht.

Ein bildgebendes Verfahren zur Untersuchung der Kalziumreaktion in bakterieninfizierten Zellen

Wir beschreiben ein Verfahren zum Verfolgen der endomembrane Bruch hervorgerufen durch die intrazelluläre...

Single Cell Messungen Vacuolar Rupture durch intrazelluläre Erreger verursacht

Um Krankheitserreger Verbreitung entgegenzuwirken, Wirtszellen neu zu organisieren, um Bakterien ihre Zellskelett compartmentalize und induzieren Autophagie. Verwendung Shigella Infektion von Gewebekulturzellen, Wirt und Pathogen Determinanten dieses Verfahren zugrunde liegen, werden identifiziert und charakterisiert. Mit Zebrafisch-Modelle von Shigella-Infektion, sind die Rolle der entdeckten Moleküle und Mechanismen in vivo untersucht.

Verwendung von<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Zum Autophagie-Zytoskelett Interaktionen zu untersuchen

Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, um Kalzium (Ca2 +) Reaktionen hervorgerufen durch HeLa-Zellen infiziert durch Shigellazu visualisieren. Durch die Optimierung der Parameter der bakteriellen Infektion und Bildgebung mit Ca2 + fluoreszierende Sonden, sind atypische globaler und lokaler Ca2 + Signale über einen grossen Bereich der Infektion Kinetik durch Bakterien verursachten gekennzeichnet.

Ca2 + Antworten Imaging während der Shigella Infektion von Epithelzellen

M-Zellen in einem spezialisierten Follikel-assoziierte Epithel Peyer-Plaques eine wichtige Rolle spielen für die Schleimhaut Immunüberwachung im Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe. Hier beschreiben wir die Auswertungsverfahren für die bakterielle Transzytose von...

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Wir beschreiben die schnelle Isolierung von primären murinen Typ II Alveolarepithelzellen (AECII) mittels Durchflusszytometrie negative Selektion. Diese AECII zeigen eine hohe Rentabilität und Reinheit und sind für ein breites Spektrum von funktionellen und molekularen Untersuchungen hinsichtlich ihrer Rolle bei der respiratorischen Erkrankungen wie Autoimmun-und Infektionskrankheiten geeignet.

Durchflusszytometrische Isolation of Primary Murine Type II Alveolarepithelzellen für Funktionelle und Molekulare Studien

Die Infektion des Menschen durch Entamoeba histolytica führt zu Amöbenruhr, eine Hauptursache für Durchfall in tropischen Ländern. Infektion durch Pathogen-Interaktionen mit Darmepithelzellen eingeleitet, provoziert die Öffnung der Zell-Zell-Kontakte und somit Durchfall, manchmal gefolgt von Leberinfektion. Dieser Artikel bietet ein Modell, um die frühen Wirt-Pathogen-Interaktionen zu bewerten, um unser Verständnis der Pathogenese Amöbenruhr zu verbessern.

Die Analyse der epithelialen Schäden Produziert von<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infektion

Erfahren Sie Infektionsanalysen mit Epithelzellen zur Untersuchung von Shigella-Adhäsion, Invasion und intrazellulärer Replikation. Diese Methode unterstützt die Entwicklung wirksamer Therapeutika gegen Shigella-Infektionen.

Epithelzellinfektionsanalysen mit Shigellen

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