Name: Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskopie: Bildgebung der Selbstorganisation von DNA-Drei-Punkt-Stern-Motiven mittels photothermischem Off-Resonanz-Klopfen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Erfahren Sie die hochgeschwindige Rasterkraftmikroskopie mit Photothermal Off-Resonance Tapping zur Bildgebung der Selbstorganisation von DNA-Drei-Punkt-Stern-Motiven. Diese Methode ermöglicht schnellere Datenakquisition für biomolekulare Interaktionen.

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<meta charset="utf8"></head><body>Verbesserte Bildgebung von DNA-Sternmotiven durch PORT-Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskopie

<ol><li>Ando, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+atomic+force+microscopy+and+its+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">High-speed atomic force microscopy and its future prospects.</a> Biophysical Reviews. 10 (2), 285-292 (2017).</li>
<li>Uchihashi, T., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+high-speed+atomic+force+microscopy+to+real-time+visualization+of+dynamic+biomolecular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta.+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Applications of high-speed atomic force microscopy to real-time visualization of dynamic biomolecular processes.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 229-240 (2018).</li>
<li>Eghiaian, F., Rico, F., Colom, A., Casuso, I., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+atomic+force+microscopy%3A+Imaging+and+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">High-speed atomic force microscopy: Imaging and force spectroscopy.</a> FEBS Letters. 588 (19), 3631-3638 (2014).</li>
<li>Umeda, K., McArthur, S. J., Kodera, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+resolution+in+high-speed+atomic+force+microscopy+for+studying+biological+macromolecules+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal resolution in high-speed atomic force microscopy for studying biological macromolecules in action.</a> Microscopy. 72 (2), 151-161 (2023).</li>
<li>Nievergelt, A. P., Banterle, N., Andany, S. H., Gönczy, P., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+photothermal+off-resonance+atomic+force+microscopy+reveals+assembly+routes+of+centriolar+scaffold+protein+SAS-6%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">High-speed photothermal off-resonance atomic force microscopy reveals assembly routes of centriolar scaffold protein SAS-6.</a> Nature Nanotechnology. 13 (8), 696-701 (2018).</li>
<li>Heath, G. R., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+AFM+height+spectroscopy+reveals+%C2%B5s-dynamics+of+unlabeled+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-speed AFM height spectroscopy reveals µs-dynamics of unlabeled biomolecules.</a> Nature Communications. 9, 4983(2018).</li>
<li>Ando, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndo%2C+T+%22High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+in+Biology%22">High-Speed Atomic Force Microscopy in Biology</a>. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2022).</li>
<li>Fukuda, S., Ando, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faster+high-speed+atomic+force+microscopy+for+imaging+of+biomolecular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Faster high-speed atomic force microscopy for imaging of biomolecular processes.</a> Review of Scientific Instruments. 92 (3), 033705(2021).</li>
<li>Jiao, F., Cannon, K. S., Lin, Y. -C., Gladfelter, A. S., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hierarchical+assembly+of+septins+revealed+by+high-speed+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The hierarchical assembly of septins revealed by high-speed AFM.</a> Nature Communications. 11 (1), 5062(2020).</li>
<li>PeakForce Tapping. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/microscopes/materials-afm/afm-modes/peakforce-tapping.html">https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/microscopes/materials-afm/afm-modes/peakforce-tapping.html</a> (2023).</li>
<li>Wang, S., Hao, C. Principle and application of peak force tapping mode atomic force microscope. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+S+%22International+Conference+on+Cognitive-based+Information+Processing+and+Applications+%28CIPA+2021%29%22">International Conference on Cognitive-based Information Processing and Applications (CIPA 2021)</a>. , Springer. Singapore. 671-679 (2022).</li>
<li>Krotil, H. -U., Stifter, T., Waschipky, H., Weishaupt, K., Hild, S., Marti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+force+mode%3A+a+new+method+for+the+investigation+of+surface+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Surface+and+Interface+Analysis%22%5BJournal%5D)">Pulsed force mode: a new method for the investigation of surface properties.</a> Surface and Interface Analysis. 27 (5-6), 336-340 (1999).</li>
<li>Rosa-Zeiser, A., Weilandt, E., Hild, S., Marti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+simultaneous+measurement+of+elastic%2C+electrostatic+and+adhesive+properties+by+scanning+force+microscopy%3A+pulsed-force+mode+operation%5BTitle%5D)+AND+%22Measurement+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">The simultaneous measurement of elastic, electrostatic and adhesive properties by scanning force microscopy: pulsed-force mode operation.</a> Measurement Science and Technology. 8 (11), 1333(1997).</li>
<li>De Pablo, P. J., Colchero, J., Gómez-Herrero, J., Baró, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jumping+mode+scanning+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Jumping mode scanning force microscopy.</a> Applied Physics Letters. 73 (22), 3300-3302 (1998).</li>
<li>Umeda, N., Ishizaki, S., Uwai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+attractive+force+microscope+using+photothermal+vibration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vacuum+Science+%26+Technology+B%22%5BJournal%5D)">Scanning attractive force microscope using photothermal vibration.</a> Journal of Vacuum Science & Technology B. 9 (2), 1318-1322 (1991).</li>
<li>Avakyan, N., Conway, J. W., Sleiman, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+ordering+of+blunt-ended+DNA+tiles+on+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Long-range ordering of blunt-ended DNA tiles on supported lipid bilayers.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (34), 12027-12034 (2017).</li>
<li>Wang, R., Kuzuya, A., Liu, W., Seeman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blunt-ended+DNA+stacking+interactions+in+a+3-helix+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Blunt-ended DNA stacking interactions in a 3-helix motif.</a> Chemical Communications. 46 (27), 4905-4907 (2010).</li>
<li>Parikka, J. M., Sokołowska, K., Markešević, N., Toppari, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+large+2D+lattices+out+of+DNA-tiles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Constructing large 2D lattices out of DNA-tiles.</a> Molecules. 26 (6), 1502(2021).</li>
<li>He, Y., Chen, Y., Liu, H., Ribbe, A. E., Mao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+hexagonal+DNA+two-dimensional+%282D%29+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of hexagonal DNA two-dimensional (2D) arrays.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (35), 12202-12203 (2005).</li>
<li>Lipid-DNA Method. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://sabatinilab.wi.mit.edu/sabatini_public/reverse_transfection/lipid_dna_method.htm">http://sabatinilab.wi.mit.edu/sabatini_public/reverse_transfection/lipid_dna_method.htm</a> (2023).</li>
<li>Pyne, A. L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base-pair+resolution+analysis+of+the+effect+of+supercoiling+on+DNA+flexibility+and+major+groove+recognition+by+triplex-forming+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Base-pair resolution analysis of the effect of supercoiling on DNA flexibility and major groove recognition by triplex-forming oligonucleotides.</a> Nature Communications. 12 (1), 1053(2021).</li>
<li>Kielar, C., Zhu, S., Grundmeier, G., Keller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+tip+effects+in+single-molecule+high-speed+atomic+force+microscopy+using+DNA+origami+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of tip effects in single-molecule high-speed atomic force microscopy using DNA origami substrates.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 59 (34), 14336-14341 (2020).</li>
<li>Nievergelt, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-range+HS-AFM+imaging+of+DNA+self-assembly+through+in+situ+data-driven+control%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Methods%22%5BJournal%5D)">Large-range HS-AFM imaging of DNA self-assembly through in situ data-driven control.</a> Small Methods. 3 (7), 1900031(2019).</li>
<li>Caroprese, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+flexibility+dominates+over+binding+strength+for+supramolecular+crystallinity%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Structural flexibility dominates over binding strength for supramolecular crystallinity.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Welcome to Mao Group. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.chem.purdue.edu/mao/index.html">https://www.chem.purdue.edu/mao/index.html</a> (2023).</li>
<li>Nievergelt, A. P., Andany, S. H., Adams, J. D., Hannebelle, M. T., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Components+for+high-speed+atomic+force+microscopy+optimized+for+low+phase-lag%5BTitle%5D)+AND+%222017+IEEE+International+Conference+on+Advanced+Intelligent+Mechatronics+%28AIM%29%22%5BJournal%5D)">Components for high-speed atomic force microscopy optimized for low phase-lag.</a> 2017 IEEE International Conference on Advanced Intelligent Mechatronics (AIM). , Munich, Germany. (2017).</li>
<li>SPM Controller/Software. EPFL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.epfl.ch/labs/lbni/spm-controller-software/">https://www.epfl.ch/labs/lbni/spm-controller-software/</a> (2023).</li>
<li>Open Hardware. EPFL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.epfl.ch/labs/lbni/openhardware/">https://www.epfl.ch/labs/lbni/openhardware/</a> (2023).</li>
<li>AFM head for small cantilevers with photothermal drive. EPFL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.epfl.ch/labs/lbni/smallleverhead/">https://www.epfl.ch/labs/lbni/smallleverhead/</a> (2023).</li>
<li>AFM head for small cantilevers with photothermal drive. BioLever. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.keybond.com.tw/index.php?route=product/category&path=87_89_88&lang_code=zh-TW">https://www.keybond.com.tw/index.php?route=product/category&path=87_89_88&lang_code=zh-TW</a> (2023).</li>
<li>BioLever. AppNano. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.appnano.com/product-page/biolever">https://www.appnano.com/product-page/biolever</a> (2023).</li>
<li>Python Scripting. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://gwyddion.net/documentation/user-guide-en/pygwy.html">http://gwyddion.net/documentation/user-guide-en/pygwy.html</a> (2023).</li>
<li>Stahl, S. W., Puchner, E. M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothermal+cantilever+actuation+for+fast+single-molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Photothermal cantilever actuation for fast single-molecule force spectroscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 80 (7), 073702(2009).</li>
<li>Kangül, M., Asmari, N., Andany, S. H., Penedo, M., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+feedback+performance+in+off-resonance+AFM+modes+through+pulse+train+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">Enhanced feedback performance in off-resonance AFM modes through pulse train sampling.</a> arXiv. , (2023).</li>
<li>Giessibl, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+Modern+Physics%22%5BJournal%5D)">Advances in atomic force microscopy.</a> Reviews of Modern Physics. 75 (3), 949-983 (2003).</li>
<li>Ando, T. High-Speed Atomic Force Microscopy (AFM). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndo%2C+T+%22Encyclopedia+of+Biophysics%22">Encyclopedia of Biophysics</a>. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>AC10DS</td><td>Olympus</td><td>BL-AC10FS-A2</td><td>Abgekündigt&nbsp;</td></tr><tr><td>Biometra Compact XS/S</td><td>Biometra GmbH</td><td>846-025-199&nbsp;</td><td>Elektrophorese&nbsp; Einheit</td></tr><tr><td>Biometra TRIO</td><td>Biometra GmbH</td><td>207072X</td><td>Thermocycler zum Glühen</td></tr><tr><td>Kundenspezifischer AFM-Aufbau</td><td>Labor für Bio-Nano-Instrumentierung, Interfakultäres Bioengineering Institut, School of Engineering, Ecole Polytechnique F&eacute; d&eacute; rale Lausanne</td><td></td><td>Erhältlich über das Labor für Bio-Nano-Instrumentierung</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ITW Reagenzien</td><td>A5097</td><td>Im Glühpuffer</td></tr><tr><td>Laser Power Meter</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>Digital Handheld Optik&nbsp; Leistungs- und Energiezählerkonsole</td></tr><tr><td>Lively 3AP Netzteil, MP-310</td><td>Major Science</td><td>MP-310</td><td>Elektrophorese Netzteil</td></tr><tr><td>MgAc2</td><td>ABCR GmbH</td><td>AB544692</td><td>In Glühpuffer</td></tr><tr><td>TBE</td><td>Thermo Scientific</td><td>327330010</td><td>Laufpuffer für die Elektrophorese</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610719</td><td>In Glühpuffer</td></tr></tbody></table>

hochgeschwindigkeits-rasterkraftmikroskopie: bildgebung der selbstorganisation von dna-drei-punkt-stern-motiven mittels photothermischem off-resonanz-klopfen

High-Speed Atomic Force Microscopy Imaging of DNA Three-Point-Star Motif Self Assembly Using Photothermal Off-Resonance Tapping

In dieser Untersuchung wurde der dynamische Assemblierungsprozess von DNA-3-Punkt-Stern-Motiven zu stabilen Inseln unter Ausnutzung der Fähigkeiten des HS-PORT AFM erfolgreich beobachtet. Diese Technik ermöglichte es uns, den Zusammenbau dieser Strukturen in Echtzeit zu erfassen. In Abbildung 2A,B erhalten wir eine klare Bildabtastung bei 100 Hz bzw. 200 Hz Zeilenraten für eine PORT-Rate von 100 kHz (800 nm x 800 nm Scangröße). Dies entspricht 3,9 bzw. 1,95 Oszillationszyklen pro Pixel. Die Bildgebung mit höheren Geschwindigkeiten ohne gleichzeitige Erhöhung der PORT-Rate, die mindestens einen Oszillationszyklus pro Pixel ermöglichen würde, wird die Bildqualität jedoch drastisch reduzieren, wie in Abbildung 2C zu sehen ist (0,78 eines Oszillationszyklus pro Pixel). Die Abbildungsgeschwindigkeit wird durch die Geschwindigkeit begrenzt, mit der der Cantilever-Abtaster die Oberfläche mit geeigneter Spitzen-Abtast-Kraftregelung abtastet, da die Rate der Topographieänderung zu schnell wird, um sie mit der Oberflächenabtastrate zu verfolgen.
Neben der Einstellung einer ausreichend hohen PORT-Rate ist es wichtig, dass die PORT-Kurven die Informationen enthalten, die zur Steuerung der Kräfte erforderlich sind. Insbesondere der hydrodynamische Widerstand und die geringe Detektionsbandbreite können die aufgebrachte Kraft verschleiern. Abbildung 3 zeigt die Auslenkung des Cantilevers in unterschiedlichen Abständen von der Oberfläche der Probe und die Anregungsfrequenzraten unter Verwendung eines Durchschnitts von 4096 Kurven, um das Rauschen zu reduzieren. Die blauen Kurven in Abbildung 3A (für 100 kHz PORT-Rate) und Abbildung 3D (für 500 Hz PORT-Rate) stellen die Cantilever-Bewegung dar, wenn der Cantilever weit von der Oberfläche entfernt ist und frei oszilliert (ohne die Oberfläche während eines Oszillationszyklus zu berühren). Die roten Kurven zeigen die Auslenkung des Auslegers, wenn der Ausleger nahe der Oberfläche schwingt und intermittierend die Oberfläche berührt, um die Probe zu untersuchen. Um die wahre Wechselwirkungskurve und damit die Tip-Sample-Wechselwirkung zu erhalten, subtrahieren wir die blaue Kurve von der roten Kurve, um jeweils Abbildung 3B,E zu erhalten. Ein Beispiel für eine klare Wechselwirkungskurve, die für die zerstörungsfreie Bildgebung von Bioproben erforderlich ist, ist in Abbildung 3B dargestellt. Diese Konfiguration führt zu der guten Bildqualität in Abbildung 3C, wo die PORT-Rate 100 kHz beträgt. Wenn wir die Anregungsfrequenz in der Nähe der Cantilever-Resonanz erhöhen, verschlechtert sich die Rückkopplungsregelung irgendwann, selbst wenn der Cantilever-Generator eine ausreichende Amplitudenschwingung aufweist, um sich nach Erhöhung der Anregungslaserleistung von der Oberfläche zu lösen (Abbildung 3E). Liegt die PORT-Frequenz zu nahe an der Cantilever-Resonanzfrequenz, begrenzt die Cantilever-Resonanz das Zeitverhalten der Cantilever-Dynamik. Die Auslegerbiegung stellt daher die Wechselwirkung zwischen Spitze und Probe nicht mehr genau dar, und die Wechselwirkungskurve, die wir erhalten, ist verdeckt. Dies führt zu einer Verschlechterung der Bildqualität, wie in Abbildung 3F dargestellt.
Eine beeinträchtigte Wechselwirkungskurve bei höheren PORT-Frequenzen könnte auch aufgrund der verringerten Betätigungseffizienz bei höheren Frequenzen33 auftreten, die derzeit einer der limitierenden Faktoren kommerzieller Hochgeschwindigkeits-AFM-Ausleger ist. Diese Abnahme erreicht schließlich einen Schwellenwert im Roll-off, bei dem eine ordnungsgemäße Abbildung behindert wird: Die Schwingungsamplitude kann nicht ausreichen, um sich von der Oberfläche zu lösen, und die Spitze ist immer in Kontakt, wodurch die Probenstrukturen beschädigt werden. Um der Abnahme der Amplitude entgegenzuwirken, die bei höheren PORT-Raten verursacht wird, haben wir eine Erhöhung der Laserleistung untersucht. Wir haben einen PORT-Kopf verwendet, der höhere Laserleistungen erreichen kann, um diesen Effekt besser beobachten zu können. Die Laserleistung des Anregungslasers, die wir mit einem Leistungsmesser gemessen haben, wurde in die DC- und AC-Komponenten aufgeteilt. Die Gesamtleistung wird gesteuert, indem in der Software die Spitze-Spitze-Spannung (Spitze-Spitze-AC-Eingang) und die Gleichspannung (DC-Offset-Eingang) eingestellt werden, die an den Steuerkreis der Laserdiode gesendet wird. Abbildung 4A zeigt die Peak-to-Peak-Cantilever-Schwingungsamplitude, die sich aus einem erhöhten Peak-to-Peak-AC-Eingang ergibt. Erwartungsgemäß korreliert die Schwingungsamplitude gut mit dem AC-Eingangswert. Es ist wichtig zu beachten, dass diese Peak-to-Peak-Amplituden höher sind als das, was normalerweise in der PORT-Bildgebung verwendet wird. Bei der Abbildung fragiler Proben liegt die AC-Amplitude in der Größenordnung von 10-30 nm. Abbildung 4B zeigt die Peak-to-Peak-Cantilever-Schwingungsamplitude für erhöhte DC-Offset-Eingänge. Die Schwingungsamplitude von Spitze zu Spitze bleibt über den DC-Offset-Spannungsbereich ziemlich konstant. Wir führen die kleinen Schwankungen auf Nichtlinearitäten in der Detektion zurück. Abbildung 4C zeigt die Zunahme der AC- und DC-Laserleistungskomponenten, die sich aus dem zunehmenden Spitze-Spitze-Wechselstrom ergibt. Abbildung 4D zeigt die Zunahme der AC- und DC-Laserleistungskomponenten, die sich aus dem zunehmenden DC-Eingangsoffset ergibt.
Die Auswirkungen einer Erhöhung des Spitze-Spitze-AC-Eingangs und des DC-Offset-Eingangs wurden separat getestet, um die jeweiligen Auswirkungen auf die Gesamtleistung und die Schwingungsamplitude zu bestimmen. Eine Erhöhung der Laserleistung führt dazu, dass die Probe gestört wird, wahrscheinlich durch Temperaturerhöhung, während eine Erhöhung der Schwingungsamplitude die Aufprallkraft auf die Probeerhöht 5. Wenn Sie ausschließlich den Spitze-Spitze-AC-Eingang erhöhen, hat dies einen geringeren Einfluss auf die Gesamtzunahme der Laserleistung, wie in Abbildung 4C gezeigt, und erhöht überwiegend die Auslegerschwingungsamplitude (und damit die Aufprallkraft), wie in Abbildung 4A gezeigt. Eine Erhöhung des DC-Offset-Eingangs hat einen größeren Effekt auf die Erhöhung der Laserleistung, wie in Abbildung 4D gezeigt, wodurch die Probe erwärmt wird, aber ein vernachlässigbarer Einfluss auf die Ablenkungsamplitude hat, wie in Abbildung 4B zu sehen ist. Die Bildergebnisse sind in Abbildung 4E,F dargestellt. Abbildung 4E zeigt DNA 3PS für den niedrigsten Spitze-Spitze-AC-Eingang (linkes Bild, blau eingekreist) und den höchsten Spitze-Spitze-AC-Eingang (rechtes Bild, rot eingekreist), was vermutlich durch die höheren Kräfte zu einer Beschädigung der Probe führt. Abbildung 4F zeigt DNA 3PS für den niedrigsten DC-Offset-Eingang (linkes Bild, blau eingekreist) und den höchsten DC-Offset-Eingang (rechtes Bild, rot eingekreist), bei dem Strukturen beschädigt werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66470/66470fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Der Aufbau des HS-AFM. (A) Der PORT-Kopf am Scanner und die Basis des AFM mit dem (i) Knopf zum Einstellen des ausgelesenen Laserfokus am Ausleger, (ii) dem Knopf zum Einstellen der Position des ausgelesenen Lasers am Ausleger, (iii) dem Knopf zum Einstellen der horizontalen Position des Lasers auf der Fotodiode, (iv) dem Knopf zum Einstellen der vertikalen Position des Lasers auf der Fotodiode, und (v) Knöpfe zum Einstellen der Position des photothermischen Antriebslasers auf dem Ausleger. (B) Eine Nahaufnahme des Auslegers in der Querschnittsansicht des Kopfes mit dem Probentisch, wobei (vi) die Federklammer ist, die den Ausleger hält. Der Kanal für die Flüssigkeitsinjektion ist rot markiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66470/66470fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66470/66470fig02.jpg"> 
Abbildung 2: DNA-3PS-Probe, die mit AC10 bei einer PORT-Rate von 100 kHz und unterschiedlichen Zeilenraten abgebildet wurde. (A) 100 Hz (3,9 Oszillationszyklen pro Pixel), (B) 200 Hz (1,95 Oszillationszyklen pro Pixel) und (C) 500 Hz (0,78 Oszillationszyklen pro Pixel). Die Bilder wurden bei Sollwerten von 350 pN oder weniger aufgenommen. Maßstabsleiste 200 nm. Nach der Bildgebung wurde eine Kraftkurve zur Ermittlung der Ablenkungsempfindlichkeit erstellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66470/66470fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66470/66470fig03v3.jpg"> 
Abbildung 3: Cantilever-Ablenkung, Wechselwirkungskurve und Bildqualität bei 100 KHz und 500 kHz PORT-Raten. (A) Cantilever-Auslenkung (Cantilever-freie Oszillation in blauer Nähe, aber ohne Berührung der Oberfläche und die Oszillation des Cantilevers, wenn der Cantilever intermittierend in Kontakt mit der Oberfläche in Rot ist), (B) Wechselwirkungskurve und (C) entsprechende Bildqualität für 100 kHz PORT-Rate. (D) Cantilever-Auslenkung (Cantilever-freie Oszillation in der Nähe, aber ohne Berührung der Oberfläche in blau, und die Oszillation des Cantilevers, wenn der Cantilever intermittierend in Kontakt mit der Oberfläche ist, in rot), (E) Wechselwirkungskurve und (F) entsprechende Bildqualität für 500 kHz PORT-Rate. Die Bilder wurden mit einer Zeilenrate von 100 Hz aufgenommen. Maßstabsbalken 200 nm. Nach der Bildgebung wurde eine Kraftkurve zur Ermittlung der Ablenkungsempfindlichkeit erstellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66470/66470fig03largev3.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66470/66470fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Auswirkung der Spitze-Spitze-AC-Eingangsspannung und der DC-Offset-Eingangsspannung. Auswirkung der Erhöhung der (A) Spitze-Spitze-AC-Eingangsspannung und der (B) DC-Offset-Eingangsspannung auf die Spitze-Spitze-Schwingung des Cantilevers. Auswirkung der Erhöhung der (C) Spitze-Spitze-AC-Eingangsspannung und der (D) DC-Offset-Eingangsspannung auf die AC- und DC-Laserleistung. Bildqualität bei minimaler (blau eingekreister) und maximaler (rot eingekreister) (E) Spitze-Spitze-AC-Eingangsspannung und (F) DC-Offset-Eingangsspannung. Beim Erhöhen der Spitze-Spitze-AC-Eingangsspannung wurde die DC-Offset-Eingangsspannung bei 600 mV gehalten. Beim Erhöhen der DC-Offset-Eingangsspannung wurde die Spitze-Spitze-AC-Eingangsspannung bei 200 mV gehalten. Die Integrität der Probe ist bei der Hochleistungskonfiguration beeinträchtigt. Die PORT-Rate wurde bei 100 kHz und die Zeilenrate bei 100 Hz gehalten. Maßstabsleiste 200 nm. Nach der Bildgebung wurde eine Kraftkurve zur Ermittlung der Ablenkungsempfindlichkeit erstellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66470/66470fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskopie: Bildgebung der Selbstorganisation von DNA-Drei-Punkt-Stern-Motiven mittels photothermischem Off-Resonanz-Klopfen

High-speed atomic force microscopy (HS-AFM) is a popular molecular imaging technique for visualizing single-molecule biological processes in real-time due ...

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A-Tapping-Modus Rasterkraftmikroskop (AFM)-Methode zur Visualisierung von Plasmid-DNA, cytoplasmatische Proteine ​​und DNA-Protein-Komplexen beschrieben. Das Verfahren umfasst das alternative Ansätze zur Vorbereitung der Proben für AFM folgenden biochemischen Manipulation. DNA mit spezifischen Protein interagiert Regionen sind in der Nähe-physiologischen Puffer Bedingungen beobachtet.

Visualisierung von rekombinanten DNA-und Protein-Komplexe mit Atomic Force Microscopy

Dieses Video beschreibt eine Methode, um die Assemblierung von Fusionsprotein-Kondensaten auf DNA-Molekülen an bestimmten Loci mit Hilfe von Einzelmolekül-Bildgebung zu visualisieren. Diese Kondensate werden durch LCD-LCD- und LCD-DBD-Wechselwirkungen gebildet, die die Rekrutierung von RNA-Polymerase II und eine verbesserte Gentranskription ermöglichen.

Einzelmolekül-Bildgebung zur Visualisierung der Ansammlung von Fusionsprotein-Kondensaten auf DNA-Vorhängen

In diesem Video demonstrieren wir statische Rasterkraftmikroskopie, um zusammengesetzte Nukleosomen zu visualisieren. Dieses hochauflösende bildgebende Verfahren ermöglicht die Untersuchung der Nukleosomenstruktur.

Statische Rasterkraftmikroskopie zur Visualisierung und Charakterisierung von zusammengesetzten Nukleosomen

In diesem Video demonstrieren wir Hochgeschwindigkeits-Zeitraffer-Rasterkraftmikroskopie, AFM und bildgebende Techniken, um die Dynamik von Nukleosomenkomplexen zu untersuchen. Während die AFM-Spitze über die Oberfläche des Nukleosoms scannt, erkennt sie Veränderungen in der Nukleosomenhöhe und zeichnet die DNA-Enthüllung im Laufe der Zeit auf.

Hochgeschwindigkeits-Zeitraffer-Rasterkraftmikroskopie zur Erfassung der Nukleosomendynamik

Hier beschreiben wir die Instrumentierung und Verfahren zum Nachweis einzelner fluoreszenzmarkierten Proteinmoleküle in Wechselwirkung mit einem einzelnen DNA-Molekül zwischen den zwei optisch eingeschlossene Mikrokügelchen suspendiert.

Die Kombination von Einzelmolekül-Imaging und Manipulation für das Studium der Protein-DNA-Wechselwirkungen

Semiflexiblen Polymere zeigen einzigartige mechanische Eigenschaften, die ausgiebig von Lebewesen angewendet werden. Systematische Studien über Biopolymere sind jedoch beschränkt, da Eigenschaften wie Polymer Steifigkeit nicht zugänglich sind. Dieses Manuskript wird beschrieben, wie diese Einschränkung durch programmierbare DNA-Nanoröhren, experimentelle Studien über die Auswirkungen der Glühfaden Steifigkeit ermöglicht umgangen wird.

DNA-Nanoröhren als ein vielseitiges Werkzeug, semiflexiblen Polymere zu studieren

Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll für T4 Ligatur und Geruchsstoffen Seite Reinigung der kleine kreisförmige DNA-Moleküle, Glühen und native Seitenanalyse der kreisförmigen Platten, Montage und AFM Imaging von 1D und 2D DNA Nanostrukturen sowie Agarose-gel Elektrophorese und Zentrifugation Reinigung des endlichen DNA Nanostrukturen.

Stabile DNA-Motive, 1D und 2D Nanostrukturen aus kleinen kreisförmigen DNA-Moleküle gebaut

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Charakterisierung von Nukleosom Partikel auf der Einzelmolekül-Ebene mit statischen und Zeitraffer Rasterkraftmikroskopie (AFM) bildgebende Verfahren. Die Oberfläche Funktionalisierung beschriebene Methode ermöglicht die Erfassung der Struktur und Dynamik der Nukleosomen in hoher Auflösung im Nanobereich.

Erforschung der Struktur und Dynamik der Nukleosomen mit Atomic Force Microscopy Imaging

Hier beschreiben wir eine magnetische Hochgeschwindigkeitspinzette, die nanomechanische Messungen an kraftsensitiven Biomolekülen mit einer maximalen Rate von 1,2 kHz durchführt. Wir stellen seine Anwendung auf DNA-Haarnadeln und SNARE-Komplexe als Modellsysteme vor, aber es wird auch auf andere Moleküle anwendbar sein, die an mechanobiologischen Ereignissen beteiligt sind.

Hochgeschwindigkeits-Magnetpinzette für nanomechanische Messungen an kraftempfindlichen Elementen

In diesem Artikel wird ein detailliertes experimentelles Verfahren zur Rekonstitution von nukleosomenhaltigen DNA-Fesseln für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie vorgestellt. Des Weiteren werden mehrere nachgelagerte Experimente beschrieben, die durchgeführt werden können, um das Bindungsverhalten von Chromatin-interagierenden Proteinen zu visualisieren und Veränderungen der physikalischen Eigenschaften von Nukleosomen zu analysieren.

In-situ-Nukleosomenassemblierung für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie

Dieses Protokoll demonstriert die Durchführung eines Einzelmolekül-Assays zur Live-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase. Sie beschreibt (1) die Herstellung eines DNA-Substrats, (2) die Reinigung der fluoreszenzmarkierten Drosophila melanogaster CMG-Helikase, (3) die Vorbereitung einer mikrofluidischen Durchflusszelle für die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) und (4) den Einzelmolekül-DNA-Entwindungsassay.

Einzelmolekül-Echtzeit-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase

Erfahren Sie die hochgeschwindige Rasterkraftmikroskopie mit Photothermal Off-Resonance Tapping zur Bildgebung der Selbstorganisation von DNA-Drei-Punkt-Stern-Motiven. Diese Methode ermöglicht schnellere Datenakquisition für biomolekulare Interaktionen.

Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskopie: Bildgebung der Selbstorganisation von DNA-Drei-Punkt-Stern-Motiven mittels photothermischem Off-Resonanz-Klopfen (Video) | JoVE Journal

Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskopie: Bildgebung der Selbstorganisation von DNA-Drei-Punkt-Stern-Motiven mittels photothermischem Off-Resonanz-Klopfen

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