Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskopie: Bildgebung der Selbstorganisation von DNA-Drei-Punkt-Stern-Motiven mittels photothermischem Off-Resonanz-Klopfen

In unserem Labor entwickeln wir neue Messtechnologien für die nanoskalige Biologie. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die Entwicklung der Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskopie, um dynamische biologische Prozesse auf der Nanometerskala zu untersuchen. Und dafür haben wir kürzlich einen neuen Bildgebungsmodus entwickelt, den wir Photothermal Off Resonance Tapping (PORT) nennen.

In diesem Modus verwenden wir einen speziellen Antriebslaser, um die Ausleger sehr kontrolliert mit hoher Geschwindigkeit zu betätigen, wodurch wir die Daten bis zu zwei Größenordnungen schneller als beim herkömmlichen Off-Resonanz-Klopfen erhalten. Der Goldstandard im Bereich der Hochgeschwindigkeits-AFM ist die Resonanzmoden-Bildgebung. In diesem Modus wird der Cantilever mit dieser Resonanzfrequenz betätigt, was bedeutet, dass die Cantilever-Position nicht gesteuert werden kann, sondern nur seine Schwingungsamplitude.

Bei AFM mit normaler Geschwindigkeit werden Aus-Resonanz-Moden immer häufiger. Allerdings ist hier die Betätigungsfrequenz begrenzt, was diese Abbildungsmodi recht langsam macht. Durch die Verwendung eines Sekundärlasers zur Betätigung des Auslegers können wir höhere Betätigungsfrequenzen erreichen, was höhere Abbildungsgeschwindigkeiten bedeutet.

Dieser Ansatz ermöglicht es uns, die Vorteile anderer Off-Resonanz-Besetzungsmodi beizubehalten, was bedeutet, dass wir das Gleichgewicht zwischen Abbildungsempfindlichkeit und -geschwindigkeit optimieren können. Wir sind in der Bildgeschwindigkeit durch das höchste Porträt begrenzt. Wenn wir das Porträt vergrößern möchten, müssen wir die Laserleistung erhöhen, um die gleiche Betätigungsamplitude beizubehalten.

Dies kann zu einer schlechten Kraftkontrolle und einer Beschädigung der Probe führen. Die Erhöhung der Bandbreite der Ausleger durch Reduzierung ihrer Größe und durch Verbesserung der Laserabsorptionseffizienz wird es uns ermöglichen, höhere Portraten zu erreichen und gleichzeitig einen angemessenen Probenabstand zu gewährleisten. Dieser Fortschritt wird schnellere Bildraten ermöglichen, was für die Untersuchung der Feinheiten der Montagedynamik von entscheidender Bedeutung ist.

Reinigen und bereiten Sie zunächst die Ausleger vor. Montieren Sie Ausleger an einer Halterung, die mit dem Rasterelektronenmikroskopie- oder REM-System kompatibel ist. Erhitzen Sie dann das Vorläufergas, das für das Gasinjektionssystem verwendet werden soll, um die neue Spitze wachsen zu lassen.

Sobald das Vakuum unter 10 hoch minus fünf Millibar fällt, spülen Sie die Gaseinspritzleitung 10 Mal für jeweils zwei Sekunden, um die Restluft aus der Düsenleitung zu entfernen. Verwenden Sie das SEM, um das Ende des Auslegers zu lokalisieren. Kippen Sie den Halter in einen Winkel, um den Ausleger für die Rasterkraftmikroskopie korrekt auszurichten.

Passen Sie die Position und den Fokus des REM an, um eine klare Sicht auf die Spitze des Cantilevers zu erhalten, an der die Kohlenstoffnanospitze gezüchtet wird. Stellen Sie als Nächstes die Abscheidungsparameter in der Software ein, um die neue Spitze zu vergrößern. Initiieren Sie den Abscheidungsprozess, um die Spitze mit einer Strahlung des Elektronenstrahls auf der Cantilever-Spitze wachsen zu lassen, während das Vorläufergas injiziert wird, und stoppen Sie die Gasinjektion, sobald die Abscheidung abgeschlossen ist.

Führen Sie REM-Bildgebung nach dem Wachstum durch, um die Qualität und die Eigenschaften der neu gewachsenen Spitze, einschließlich ihres Radius und ihrer Länge, zu beurteilen. Entfernen Sie den Halter aus der REM-Kammer. Bereiten Sie zunächst ein Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskop vor.

Platzieren Sie mit einer Pinzette einen ultrakurzen Ausleger unter der Federklammer am Auslegerhalter. Geben Sie mit einer Spritze 50 Mikroliter Flüssigkeit durch die linke Flüssigkeitsöffnung. Verwenden Sie dann drei Knöpfe am AFM-Kopf, um den Ausleselaser auf dem Ausleger auszurichten.

Beobachten Sie den Schatten des Auslegers auf einem weißen Papier, während Sie die Summe maximieren. Zentrieren Sie dann den Laserspot mit den beiden dafür vorgesehenen Knöpfen auf der Fotodiode. Aktivieren Sie als Nächstes das Kontrollkästchen Anregung aktiviert in Anregung VI, um den Antriebslaser einzuschalten und auszurichten, indem Sie den Ausleger betätigen und oszillieren.

Zeigen Sie die Cantilever-Anregungs- und Ablenksignale auf einem Oszilloskop an. Verwenden Sie die Schattenmethode und maximieren Sie die Schwingungsamplitude mit den Einstellknöpfen des Antriebslasers. Um die Cantilever-Schwingungsamplitude im Anschluss einzustellen, fügen Sie dem Steuerkreis der Laserdiode in der Konfigurationsbox in Anregung VI eine Gleichspannung hinzu und geben Sie den Spitze-Spitze-AC-Eingang für den Steuerkreis der Laserdiode ein.

Um Wechselwirkungskurven zu erhalten, stellen Sie das Z-Controller-VI auf den Kontaktmodus ein, und klicken Sie auf Start, um sich der Probenoberfläche zu nähern. Sobald die Oberfläche erreicht ist, führen Sie in Rampe VI eine Kraft-Weg-Kurve durch, um die Empfindlichkeit der Ausleger-Durchbiegung zu kalibrieren. Klicken Sie auf Ziehen, um den Z-Piezo von der Oberfläche zurückzuziehen, die die Spitze nicht erreichen kann.

Wechseln Sie nach vollständigem Einzug im Z-Controller VI in den Port-Modus und schalten Sie den Anregungslaser in Anregung VI ein.Stellen Sie den Port-Modus auf die gewünschte Frequenz ein. Klare Wechselwirkungskurven wurden durch Subtraktion der freien Oszillation von der Kontaktoszillation erhalten, die für die zerstörungsfreie Bildgebung von Bioproben entscheidend ist. Bei einer Portrate von 100 Kilohertz wurde eine gute Bildqualität erreicht.

Als sich die Anregungsfrequenz jedoch der Cantilever-Resonanz näherte, verschlechterte sich die Rückkopplungssteuerung, was zu verdunkelten Wechselwirkungskurven und einer verschlechterten Bildqualität führte. Bereiten Sie zunächst eine 10 millimolare Lösung von Magnesiumacetat vor. Injizieren Sie mit einer Hamilton-Spritze 50 Mikroliter der Lösung in den Fluidikkanal des Cantilever-Halters, wodurch ein Flüssigkeitstropfen entsteht, der den Ausleger umschließt.

Stellen Sie die Scangröße im Scan-VI auf 800 x 800 Nanometer und die Zeilenrate auf 100 Hertz ein. Um die Oberfläche zu scannen, klicken Sie auf den Rahmenpfeil, um die Qualität zu überprüfen. Klicken Sie nach dem Scannen im VI des Z-Controllers auf Zurückziehen, um den Ausleger von der Oberfläche zurückzuziehen.

Entfernen Sie mit einer Hamilton-Spritze die Pufferlösung aus dem Auslegerhalter. Bereiten Sie dann eine verdünnte DNA-Dreipunktsternlösung vor und injizieren Sie 50 Mikroliter dieser Lösung in den Cantilever-Halter. Führen Sie die Bildgebung mit einem Bereich von 800 x 800 Nanometern bei einer Standard-Zeilenrate von 100 Hertz durch.

Passen Sie nach dem ersten Scan die Bildgebungsgröße und -geschwindigkeit an und scannen Sie das VI auf die angegebenen Werte für die weitere Datenerfassung. Halten Sie die Eingabe für den Sollwert im Sollwertfeld des Z-Controllers VI auf dem niedrigsten Niveau, das für eine genaue Verfolgung während des gesamten Bildgebungsprozesses erforderlich ist. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle erforderlichen Probenbereiche. Mit Hilfe dieses Protokolls wurde die Echtzeit-Assemblierung von DNA-Dreipunktsternmotiven zu stabilen Inseln mit Hilfe von Hochgeschwindigkeits-Port-AFM beobachtet.

Klare Bilder wurden bei Leitungsraten von 100 und 200 Hertz für eine Portrate von 100 Kilohertz erhalten. Höhere Bildgebungsgeschwindigkeiten ohne Erhöhung der Portraten verringerten jedoch die Bildqualität aufgrund schneller Topografieänderungen. Die Bildgebungsergebnisse des DNA-Dreipunktsterns für den niedrigsten Peak-to-Peak-AC-Eingang zeigten intakte Strukturen, während der höchste Peak-to-Peak-AC-Eingang zu einer beobachtbaren Probenschädigung aufgrund höherer Kräfte führte.

In ähnlicher Weise zeigte der niedrigste DC-Offset-Eingang intakte Strukturen, während der höchste DC-Offset-Eingang strukturelle Schäden verursachte.