Name: Differenzierung und Charakterisierung von Osteoklasten aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T14:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Lernen Sie die Differenzierung von Osteoklasten aus humanen iPSCs für Knochenforschung und Gewebetechnik. Dieses Protokoll ermöglicht zuverlässige Zellkulturmöglichkeiten für die Biologie.

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Die Autoren danken den Mitgliedern des Giachelli-Labors für ihre technische Hilfe und Unterstützung. Wir danken dem W. M. Keck Mikroskopiezentrum und dem Leiter des Keck-Zentrums, Dr. Nathanial Peters, für die Unterstützung bei der Beschaffung der konfokalen Mikroskopie- und Weitfeldmikroskopiebilder. Wir danken auch der UW Flow Core Facility und dem Leiter der Flow Core Facility, Aurelio Silvestroni, für die technische Unterstützung und Unterstützung. Abschließend bedanken wir uns bei Hannah Blümke für die Unterstützung bei Illustration und Grafikdesign.
Die Finanzierung erfolgte durch den Zuschuss der National Institutes of Health R35 HL139602-01. Wir danken auch dem NIH S10 Grant S10 OD016240 für die Instrumentenfinanzierung am W. M. Keck Center sowie dem NIH Grant 1S10OD024979-01A1 für die Instrumentenfinanzierung in der UW Flow Core Facility.

HINWEIS: Alle in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien finden Sie in der Materialtabelle. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Medien vor der Verwendung auf 37 °C voräquilibriert. Alle Zentrifugationsschritte werden bei 37 °C und im langsamsten Beschleunigungs-/Verzögerungsmodus durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben, wird der Überstand immer mit Einweg-Pasteur-Glaspipetten entfernt.
1. Auftauen und Vermehrung humaner iPS-Zellen
<ol><li>Einen Tag vor dem Auftauen der iPS-Zellen wird eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit 1 ml eines Basalmembranextrakts in einer Konzentration von 200-300 μg/ml bestrichen. Stellen Sie die Well-Platte über Nacht bei 4 °C auf.</li>
	<li>Am nächsten Tag werden die Zellen aufgetaut und mit einer P1000-Pipette in ein 15-ml-Röhrchen überführt. Tropfenweise 5-7 ml DMEM/F-12 mit 15 mM HEPES hinzufügen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min. Nehmen Sie die Zellen vorsichtig aus der Zentrifuge und achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu stören.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pasteur-Glaspipette und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml hiPSC-serumfreiem Medium (hiPSC-SFM mit 10 μM Rho-Kinase (ROCK)-Inhibitor Y-27632) unter Verwendung von P1000 mit Spitzen mit großer Bohrung.</li>
	<li>Saugen Sie den Basalmembranextrakt aus der am Vortag beschichteten Vertiefung an (Schritt 1.1) und überführen Sie 1 mL hiPSC-SFM mit 10 μM Y-27632 in die Vertiefung. Geben Sie resuspendierte iPS-Zellen in die Vertiefung, um ein Endvolumen von 2 ml pro Vertiefung zu erreichen.</li>
	<li>Schwenken Sie die Platte, um die iPSC-Aggregate gleichmäßig zu verteilen, bevor Sie sie bei 37 °C und 5 % CO2 in einen Inkubator legen.</li>
	<li>Führen Sie jeden zweiten Tag einen vollständigen Mediumwechsel mit hiPSC-SFM durch (ohne Zusatz von ROCK-Inhibitor Y-27632). iPS-Zellen erreichen in der Regel nach 3-4 Tagen der Ausbreitung eine Konfluenz von 70-80%.</li>
</ol>2. Weiterleitung von iPS-Zellen
<ol><li>Einen Tag vor der Passage von iPS-Zellen werden die Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit einem Basalmembranextrakt in einer Konzentration von 200-300 μg/ml beschichtet. Stellen Sie die Well-Platte für die Nacht auf 4 °C. HINWEIS: Vergewissern Sie sich, dass die Zellen eine Konfluenz von ca. 70-80 % erreicht haben. Stellen Sie sicher, dass iPS-Zellen nicht überkonfluent werden (mehr als 80 % Konfluenz), da dies die spontane Differenzierung fördert.</li>
	<li>Beginnen Sie mit der Passage von iPS-Aggregaten, indem Sie differenzierte Regionen oder Regionen mit vielen toten iPSC-Aggregaten unter dem Stereomikroskop entfernen, indem Sie 10-μl- oder 20-μl-Pipettenspitzen oder einen Zellschaber verwenden. Differenzierte Bereiche erscheinen dichter oder weißer. HINWEIS: Abgeschabte Zellaggregate können sich noch teilweise am Boden der Vertiefung anheften.</li>
	<li>Waschen Sie den Brunnenboden mehrmals mit einer P1000-Pipette mit breitem Bohrloch, um alle Aggregate zu entfernen, die möglicherweise noch teilweise am Boden der Vertiefung haften.</li>
	<li>Verwerfen Sie das verbrauchte Medium, in dem die iPS-Zellen kultiviert wurden und das die abgelösten iPSC-Aggregate enthält. Wiederholen Sie den Waschschritt noch zwei weitere Male mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).</li>
	<li>Als nächstes fügen Sie 1 ml 5 U/ml Dispase pro Vertiefung hinzu. Die Ränder der iPSC-Kolonien heben sich von der Well-Platte ab, was unter dem Stereomikroskop nach 3-5 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur beobachtet werden kann.</li>
	<li>Entfernen Sie Dispase vorsichtig, um zu vermeiden, dass sich leicht ablösende Aggregate lösen, und fügen Sie 1 ml DMEM/F-12 mit 15 mM HEPES hinzu. Verwenden Sie einen Einweg-Zellheber, um die Aggregate in kleine Größen zu schneiden. Die Konsistenz der iPSC-Aggregatgrößen kann mit einem Stammzell-Passage-Tool verbessert werden.</li>
	<li>Waschen Sie die in Scheiben geschnittenen iPSC-Aggregate mit dem Medium im Well ab und überführen Sie das Medium mit den Aggregaten in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit einer serologischen 5-ml-Pipette oder P1000 mit einer breiten Bohrungsspitze.</li>
	<li>Spülen Sie die Vertiefung mit DMEM/F-12 und füllen Sie das Medium in das 15-ml-Röhrchen mit den iPSC-Aggregaten um.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die in Scheiben geschnittenen iPSC-Aggregate bei 200 x g für 3 Minuten. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pasteur-Glaspipette und fügen Sie 2 ml hiPSC-SFM hinzu, um die iPS-Zellen mit einer serologischen 5-ml-Pipette oder einer P1000-Pipette mit breiter Bohrung zu lösen und zu resuspendieren.</li>
	<li>Saugen Sie den übrig gebliebenen Basalmembranextrakt von der/den vorbeschichteten Well-Platte(n) ab und geben Sie 1 ml hiPSC-SFM in jede Vertiefung der 6-Well-Platte.</li>
	<li>Übertragen Sie iPS-Zellen in neue Vertiefungen einer 6-Well-Platte, so dass das Endvolumen 2 ml hiPSC-SFM pro Well beträgt, wobei ein P1000 mit Wide-Bore-Spitzen verwendet wird. Je nach iPSC-Leitung müssen die Split-Verhältnisse optimiert werden. Hier wurde ein Split-Verhältnis von 1:6 verwendet.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Vertiefung unter dem Stereomikroskop auf schwimmende Aggregate und Aggregatgröße. Idealerweise sollte die Aggregatgröße zwischen 50-200 μm liegen.</li>
	<li>Schwenken Sie die Well-Platte, um die Zellen nach dem Transfer der Aggregate gleichmäßig auf der Platte zu verteilen, und inkubieren Sie bei 37 °C bei 5 % CO2 bis zu 70-80 % Konfluenz.</li>
</ol>3. Einfrieren von iPS-Zellen
<ol><li>Um iPSC-Zellen wieder einzufrieren, werden die Zellen wie oben beschrieben (siehe Protokollschritt "2. Passage von iPS-Geräten"). Nachdem die Zellen in Kolonien geschnitten und vom Boden der Vertiefung abgewaschen wurden (Schritt 2.10), werden die in Scheiben geschnittenen Aggregate 3 Minuten lang bei 200 x g heruntergeschleudert. Saugen Sie den Überstand ab.</li>
	<li>Geben Sie 1 ml serumfreies Kryokonservierungsmedium pro Well einer 6-Well-Platte in das 15-ml-Röhrchen und resuspendieren Sie die geschnittenen Aggregate mit einem P1000 mit einer breiten Bohrungsspitze.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen in vormarkierte Kryoröhrchen. Röhrchen verschließen und Röhrchen bei 4 °C in einen vorgekühlten Kryokonservierungsbehälter überführen. Die Zellen werden 24-48 h bei -80 °C gelagert.</li>
	<li>Füllen Sie Kryoröhrchen zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff um. HINWEIS: Eine schematische Zusammenfassung des OC-Differenzierungsprozesses ist in Abbildung 1 dargestellt.</li>
</ol>4. Induktion des Embryoidkörpers
<ol><li>Kultivieren und expandieren Sie ausreichend iPS-Zellen wie oben beschrieben für die EB-Induktion. HINWEIS: Die OC-Produktion kann durch die Erhöhung der Anzahl der Embryoidkörper erhöht werden, die wiederum eine insgesamt höhere Ausbeute an hämatopoetischen Zellen produzieren. Ein Well mit 70-80% konfluenten iPS-Zellen ergibt ca. 8,4 x 105 Zellen pro Well eines 6-Well-Platten-Wells. 12.500 einzellige iPS-Zellen werden benötigt, um einen embryoidförmigen Körper zu bilden.</li>
	<li>Saugen Sie das verbrauchte Medium aus den iPSC-Kulturen ab und spülen Sie die iPSC-Kolonien mit D-PBS.</li>
	<li>Geben Sie 0,5 ml auf Raumtemperatur vorgewärmtes Einzelzell-Dissoziationsreagenz in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte und schwenken Sie das Kulturgefäß, um die gesamte Well-Oberfläche zu beschichten. Das Kulturgefäß wird bei 37 °C für 5-8 min inkubiert.</li>
	<li>Nehmen Sie das Gefäß aus dem Inkubator, saugen Sie das Einzelzelldissoziationsreagenz ab und geben Sie 1 ml des Differenzierungsmediums der Stufe 1 in die Vertiefungen, bestehend aus hiPSC-serumfreiem Medium mit 50 ng/ml humanem morphogenetischem Knochenprotein 4 (hBMP4), 50 ng/ml humanem vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor-165 (hVEGF), 20 ng/ml humanem Stammzellfaktor (hSCF), und 10 μM Y-27632.</li>
	<li>Lösen Sie die Zellen vorsichtig ab, indem Sie die Vertiefung mit dem Medium der Stufe 1 spülen. Im Pool dissoziierte iPS-Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Geben Sie 1 ml Differenzierungsmedium der Stufe 1 in die Vertiefungen und waschen Sie alle verbleibenden Zellen ab oder verwenden Sie einen Zellschaber für Kolonien, die sich nicht leicht abwaschen lassen.</li>
	<li>Nachdem Sie alle Zellen in das Röhrchen umgefüllt haben, zentrifugieren Sie bei 200 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur, um ein Zellpellet zu bilden. Die Zellen werden in insgesamt 2 ml voräquilibriertem Differenzierungsmedium der Stufe 1 mit einer serologischen 5-ml-Pipette oder einem P1000 mit einer weiten Spitze abgesaugt und resuspendiert.</li>
	<li>Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzählgerät. Geben Sie das Medium in das 15-ml-Röhrchen, das die Einzelzellsuspension enthält, auf eine Platte mit 12.500 Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden und extrem niedrigem Aufsatz in 100 μl des Differenzierungsmediums der Stufe 1. HINWEIS: Unter dem Mikroskop erscheinen die Zellen als einzellige Suspension mit Zellen, die im gesamten Well verteilt sind.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die 96-Well-Platten 3 Minuten lang bei 100 x g. Nach dem Zentrifugieren sollten die Zellen beginnen, Sphäroiden zu ähneln, wenn sie unter dem Mikroskop betrachtet werden. Stellen Sie die Platte für 24 h in einen 37 °C warmen Inkubator.</li>
	<li>Wechseln Sie die Hälfte des Mediums an Tag 1 und Tag 2 mit dem Differenzierungsmedium der Stufe 1. Um die Effizienz zu verbessern, verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 50 μl des verbrauchten Differenzierungsmediums der Stufe 1 in eine Petrischale zu entsorgen.</li>
	<li>Nachdem Sie das Medium von der 96-Well-Platte entsorgt haben, suchen Sie unter dem Stereomikroskop nach EBs, die möglicherweise versehentlich entfernt wurden. Übertragen Sie versehentlich entfernte EBs mit einer P1000-Pipette mit weiten Spitzen auf die 96-Well-Platte.</li>
	<li>Mit einer Mehrkanalpipette 50 μl frisches Differenzierungsmedium der Stufe 1 in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit rundem Boden und extrem niedrigem Aufsatz geben.</li>
</ol>5. Hämatopoetische Differenzierung
<ol><li>Einen Tag vor Beginn der hämatopoetischen Differenzierung wird eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit 1 ml eines Basalmembranextrakts in einer Konzentration von 200-300 μg/ml beschichtet. Stellen Sie die Well-Platte über Nacht bei 4 °C auf. HINWEIS: Jede Bohrung erhält zu einem späteren Zeitpunkt dieses Protokolls 8 EBs. Abhängig von der Anzahl der präparierten EBs sind die Vertiefungen entsprechend zu beschichten.</li>
	<li>Saugen Sie den überschüssigen Basalmembranextrakt ab und füllen Sie die Vertiefungen der 6-Well-Platte mit 3 ml des Differenzierungsmediums der Stufe 2 auf, das aus einem hämatopoetischen Basalmedium besteht, dem 2 mM Ultraglutamin, 55 μM 2-Mercaptoethanol, 25 ng/ml humanes Interleukin 3 (hIL-3) und 100 ng/ml humaner Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (hM-CSF) zugesetzt werden.</li>
	<li>Verwenden Sie einen P1000 mit Spitzen mit breiter Bohrung und übertragen Sie 8 EBs in jede Vertiefung der 6-Well-Platte. Vergewissern Sie sich nach dem Übertragen mit Augenmaß oder unter dem Stereomikroskop, dass sich in jeder Vertiefung 8 EBs befinden. HINWEIS: Nach 1 Tag haften die schwimmenden EBs am Brunnenboden. In den folgenden 5-7 Tagen sollte eine schwimmende Zellpopulation aus hämatopoetischen Zellen sichtbar werden. Die hämatopoetische Differenzierungsperiode kann variiert werden, beginnend mit 7 Tagen. Die Differenzierung über 10 Tage ergab eine hämatopoetische Population, die sich aus großen CD45+-, CD14+ - und CD11b+ -Subpopulationen zusammensetzte.</li>
	<li>Nach 5-tägiger Behandlung mit dem Differenzierungsmedium der Stufe 2 führen Sie einen Mediumwechsel durch, indem Sie das verbrauchte Medium entfernen und in ein konisches 50-ml-Röhrchen abgeben. Pipettieren Sie langsam, um zu versuchen, so wenig schwimmende Zellen wie möglich zu entfernen und die Scherspannung so gering wie möglich zu halten. Das Pipettieren unter dem Stereomikroskop kann dazu beitragen, eine versehentliche Entnahme von Zellen zu vermeiden.</li>
	<li>Geben Sie sofort 1 ml frisches Differenzierungsmedium der Stufe 2 in die Vertiefungen. Um schwimmende hämatopoetische Zellen, die zu diesem Zeitpunkt des Differenzierungsprozesses bereits vorhanden sind, zurückzugewinnen, darf das abgegebene Medium nicht verworfen werden. Drehen Sie stattdessen das Röhrchen mit dem verbrauchten Medium bei 300 x g für 5 Minuten ab und saugen Sie den Überstand ab.</li>
	<li>Geben Sie frisches Differenzierungsmedium der Stufe 2 in das Röhrchen und resuspendieren Sie es, um Zellen abzulösen, die möglicherweise mit dem verbrauchten Medium übertragen wurden.</li>
	<li>Geben Sie 2 ml des frischen Differenzierungsmediums der Stufe 2 mit den gewonnenen Zellen in jede Vertiefung, die zuvor mit 1 ml des Differenzierungsmediums der Stufe 2 gefüllt war.</li>
	<li>Am 10. Tag der hämatopoetischen Differenzierung ist auf das Vorhandensein einer großen Anzahl schwimmender hämatopoetischer Zellen zu achten. Ernten Sie, indem Sie sie in einem 50-ml-Röhrchen sammeln. Sie können entweder in 10 % DMSO, 50 % FBS und 40 % Medium eingefroren oder sofort verwendet werden, um die Zellen in OCs zu differenzieren.</li>
</ol>6. M-CSF-Reifung und OC-Differenzierung
<ol><li>Samenzellen in einer Konzentration von 200.000 Zellen/cm2 auf Gewebekultur, behandelte Well-Platten und behandeln mit alpha-MEM, ergänzt mit 10% FBS und 50 ng/ml hM-CSF.</li>
	<li>Um funktionelle Assays oder Bildgebung durchzuführen, trennen Sie die gereiften M-CSF-Zellen 3 Tage nach der Aussaat ab, indem Sie sie mit einem P1000 mit einer Spitze mit breiter Bohrung mit vorgewärmtem PBS auf 37 °C waschen. Möglicherweise sind wiederholte Waschschritte erforderlich, um die Zellen vollständig zu lösen.</li>
	<li>Die abgelösten Zellen werden mit einem P1000 mit breiter Spitze in ein 15-ml-Röhrchen überführt und 5 Minuten lang bei 300 x g zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand.</li>
	<li>Resuspendieren und lösen Sie das Zellpellet mit dem OC-Differenzierungsmedium, bestehend aus alpha-MEM, ergänzt mit 10% FBS, 50 ng/ml hM-CSF und 80 ng/ml hRANKL. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzählgerät und säen Sie M-CSF-gereifte Zellen mit einer Dichte von 200.000-250.000 Zellen/cm2 in einem geeigneten Kulturgefäß für funktionelle Assays oder Bildgebung (d. h. Knochenresorptionsassays, Deckglas-Objektträger für die Bildgebung usw.) wieder aus.</li>
	<li>Differenzieren Sie mit dem OC-Differenzierungsmedium für 7-9 Tage. Führen Sie alle 2-3 Tage einen kompletten Well-Mediumwechsel mit dem frischen OC-Differenzierungsmedium durch. HINWEIS: Mehrkernige OCs treten in der Regel nach 5-7 Tagen auf.</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden Interessen gibt.

Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige und robuste Methode zur Unterscheidung von iPS-Zellen in OCs. Dennoch gibt es einige Fallstricke, die während des gesamten Differenzierungsprozesses auftreten können. Humane iPSC-Linien, die aus Zellen unterschiedlicher Gewebeherkunft erzeugt wurden, wurden mit diesem Protokoll erfolgreich differenziert33. Beim Einfrieren von iPS-Zellen (siehe Protokollschritt "3. Einfrieren von iPS-Geräten") wurde eine Vertiefung zum Zeitpunkt des Durchgangs wieder in ein Kryoröhrchen eingefroren. Beim Auftauen (siehe Protokollschritt "1. Auftauen und Vermehrung humaner iPS-Platten") wurde ein Kryoröhrchen in einer einzigen Vertiefung einer 6-Well-Platte aufgetaut. Verschiedene iPSC-Linien verhalten sich leicht unterschiedlich und die Proliferationsraten variieren. Die Split-Rate muss entsprechend angepasst werden.
Bei der Passage von iPS-Zellen oder der Dissoziation von iPS-Zellen in eine Einzelzellsuspension für die EB-Induktion ist es wichtig, alle spontan differenzierten Kolonien oder Aggregate toter Zellen zu entfernen, um die Wirksamkeit und Effizienz der mesodermalen und hämatopoetischen Differenzierung zu verbessern. Dies kann unter einem Stereomikroskop unter Verwendung eines Zellschabers, Pipettenspitzen einer P10- oder P20-Pipette oder eines Schabwerkzeugs aus einer Pasteur-Pipette35 erfolgen.
Wie oben erwähnt, beinhaltet dieses Protokoll die Dissoziation von iPSC-Kolonien in eine Einzelzellsuspension für die EB-Induktion, während bei anderen Protokollen iPS-Zellen als Aggregate belassen werden, die für die EB-Induktion zentrifugiert werden36. Es wurde berichtet, dass die Größe, die Zellzahl, die Form und die Morphologie der EB die Differenzierung beeinflussen 37,38,39. Daher stellen wir die Hypothese auf, dass die Dissoziation in eine einzellige Suspension eine bessere EB-zu-EB-Gleichmäßigkeit in Größe und Form nach der Zentrifugation und damit konsistentere Ergebnisse der hämatopoetischen Zellproduktion ermöglicht31.
Andere Methoden zur EB-Induktion wurden beschrieben. Es wurde berichtet, dass solche Methoden, die eine Einzelzellsuspension in Verbindung mit einem ROCK-Inhibitor verwenden, um das Zellüberleben zu verbessern, bei der Kontrolle der EB-Größe und des Differenzierungsergebnisses vorteilhaft sind31.
Die in diesem Protokoll beschriebene 96-Well-Platten-EB-Induktionsmethode mit rundem Boden eignet sich für die Produktion von EBs in großem Maßstab und ermöglicht die Hochskalierung der OC-Produktion. In jüngster Zeit wurden weitere neuartige Methoden zur hämatopoetischen Differenzierung ohne Induktionsschritt des Embryoidkörpers beschrieben, die das Potenzial haben, den Differenzierungsprozess zu erleichtern32. Nichtsdestotrotz sind diese Protokolle für die OC-Differenzierung noch nicht etabliert33.
Im oben erwähnten Protokoll beschreiben wir den Mediumwechsel am Tag 5 der hämatopoetischen Differenzierung. Eine kleine Anzahl von schwimmenden Zellen kann bereits am 4. bis 5. Tag der Differenzierung auftreten. Um zu vermeiden, dass schwimmende Zellen verworfen werden, sollte das Medium in einem Röhrchen aufgefangen und zentrifugiert werden, bevor es verworfen wird. Das Zellpellet am Boden des Röhrchens muss dann mit dem frischen Medium gelöst und in die Vertiefungen einer 6-Well-Platte zurückgeführt werden. Die Bedeutung der frühen Floating-Zell-Population für die OC-Differenzierung muss jedoch noch bestimmt werden.
Die Produktion von hämatopoetischen Zellen kann mittels Durchflusszytometrie beurteilt werden. Hohe Ausbeuten an CD45+-, CD14+- und CD11b+-Zellen sind für die Osteoklastendifferenzierung wünschenswert33. Es wurde berichtet, dass die Kryokonservierung von geernteten schwimmenden hämatopoetischen Zellen mit allgemein begrenzten Wiederfindungsraten und geringer Zelllebensfähigkeit eine Herausforderung darstellt40,41. Durch die Kryokonservierung hämatopoetischer Zellen in einem Kryokonservierungsmedium, das zu 50 % aus einem serumfreien hämatopoetischen Zellexpansionsmedium (siehe Materialtabelle), 40 % FBS und 10 % DMSO bestand, konnten wir Zellen mit einer Zellviabilität von ca. 90,3 % ± 2,62 SD (n = 7) nach dem Auftauen gewinnen.
Die Osteoklastogenese erfordert die Fusion mehrerer einkerniger OC-Vorläufer zu mehrkernigen Osteoklasten, die zur Mineral- und Knochenresorption fähig sind. Während murine OC-Vorläuferzelllinien lediglich die Zugabe von RANKL benötigen, um die OC-Bildung zu induzieren42, benötigen humane Vorläufer zusätzlichen M-CSF für das Überleben und die Zellproliferation43. OSCAR wurde kürzlich als zusätzlicher Rezeptor entdeckt, der an der OC-Differenzierung beteiligt ist, obwohl bisher nur Typ-I-Kollagen als Ligand identifiziert wurde. Während die Forschung an OSCAR mit iPSC-abgeleiteten OCs noch begrenzt ist, scheinen supraphysiologische in vitro RANKL- und M-CSF-Konzentrationen in einer murinen Zelllinie die Notwendigkeit einer OSCAR-Aktivierung zu umgehen44, die Aktivierung von OSCAR in vivo scheint ein notwendiges kostimulatorisches Signal für die Osteoklastogenese zu sein45. Ein weiterer Faktor, der berücksichtigt werden muss, ist die Oberfläche der Well-Platte. Es ist bekannt, dass chemische46 und physikalische47 Oberflächeneigenschaften die Osteoklastendifferenzierung beeinflussen und eine erfolgreiche Differenzierung entweder fördern oder behindern können. Eine gewisse Heterogenität innerhalb der Vorläuferpopulation scheint ebenfalls entscheidend für eine erfolgreiche Fusion von OCs zu sein, da verschiedene fusionsbezogene Faktoren wie CD47 und DC-STAMP in unterschiedlichen Stadien der Osteoklastenfusion wirken48.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll die Unterscheidung von humanem OC von iPS-Zellen ermöglicht, um die OC-Forschung zu erleichtern und zu beschleunigen.

Osteoklasten (OCs) sind hämatopoetische 1,2, vielseitige Zelltypen, die häufig von Forschern in Bereichen wie der Erforschung von Knochenkrankheiten 3,4, derKrebsforschung 5,6, dem Tissue Engineering 7,8 undder Endoprothesenforschung 9,10 verwendet werden. Nichtsdestotrotz kann die OC-Differenzierung eine Herausforderung darstellen, da die Fusion von mononukleären Vorläufern zu mehrkernigen OCs notwendig ist, um funktionelle OCs zu erzeugen11. Mehrere biologische Faktoren, wie z.B. der Rezeptoraktivator des NF-κB-Liganden (RANKL) und der Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF), sind für die OC-Differenzierung notwendig. Es wurde berichtet, dass M-CSF einen positiven Effekt auf die Zellproliferation, das Zellüberleben und die RANK-Expression hat 12,13,14. Auf der anderen Seite bindet RANKL an RANK, das nachgeschaltete Signalkaskaden aktiviert, die die Osteoklastogenese induzieren. Die Aktivierung wird über den TNF-Rezeptor-assoziierten Faktor 6 (TRAF6) vermittelt, der zum Abbau des nukleären Faktors des Kappa-Light-Polypeptid-Genverstärkers im B-Zell-Inhibitor alpha (IκB-α) führt, einem Bindungsprotein, das NF-kB-Dimerebindet 16,17. Daher werden beim Abbau von IκB-α NF-kB-Dimere freigesetzt, die dann in den Zellkern translozieren und die Expression der Transkriptionsfaktoren c-Fos und Nuclear Factor of Activated T-Cells 1 (NFATc1) induzieren. Dies wiederum löst die Transkription einer Vielzahl von Proteinen aus, die mit der OC-Differenzierung zusammenhängen15,18. Hochregulierte Proteine wie DC-Stamp und Atp6v0d2 vermitteln die Zell-Zell-Fusion von OC-Vorläufern, was zur Bildung von Synzytium führt 19,20,21.
In Bezug auf humane Primärzellen sind CD34+ und CD14+ PBMCs derzeit die am häufigsten verwendeten Zelltypen für die Differenzierung in OCs22. Dieser Ansatz ist jedoch durch die Heterogenität innerhalb der CD34+ -Population von geernteten Zellen von Spendern23 und ihre begrenzte Erweiterbarkeit begrenzt. Humane iPS-Zellen stellen eine alternative Quelle für OCs dar. Da sie unbegrenzt vermehrt werden können24, ermöglichen sie eine Erweiterbarkeit und Hochskalierung der OC-Produktion. Dies ermöglicht die Differenzierung einer großen Anzahl von OCs, was die OC-Forschung erleichtert.
Es wurden mehrere Protokolle zur Differenzierung von iPS-Zellen in OCs veröffentlicht 25,26,27. Der gesamte Differenzierungsprozess kann in einen iPSC-Propagationsteil, einen mesodermalen und einen hämatopoetischen Differenzierungsteil und eine OC-Differenzierung unterteilt werden. Die Vermehrung von iPS-Zellen vor dem Differenzierungsprozess ermöglicht die Hochskalierung der OC-Produktion vor der Differenzierung. Es existieren mehrere Ansätze zur mesodermalen und hämatopoetischen Differenzierung. Traditionell wurde die Bildung von Embryoidkörpern (EB) zur Differenzierung hämatopoetischer Zellen verwendet, aber Monolayer-basierte Ansätze stellen eine weitere hämatopoetische Differenzierungsstrategie dar, die keine EB-Induktion erfordert. Nichtsdestotrotz scheinen monolayer-basierte Systeme weiterer Optimierung zu bedürfen, da wir und andere festgestellt haben, dass EB-basierte Ansätze robuster für die Differenzierung von OCs sind.
Hier beschreiben wir die Differenzierung von OCs von humanen iPSCs mit Hilfe eines EB-basierten Protokolls. Dieses Protokoll wurde von Rössler et al.26 adaptiert und modifiziert, um die Robustheit zu erhöhen und die Kryokonservierung während des Differenzierungsprozesses zu ermöglichen. Erstens haben wir hämatopoetische Zellen nur einmal nach 10 Tagen der Differenzierung geerntet. Die hämatopoetischen Zellen wurden dann kryokonserviert, um mehr Flexibilität während des Differenzierungsprozesses zu ermöglichen. Zusätzlich haben wir die hämatopoetische Zellaussaatdichte von 1 x 105 auf 2 x 105 Zellen/cm2 für die OC-Differenzierung erhöht. Es wurde ein neueres humanes iPSC-serumfreies Medium (hiPSC-SFM, siehe Materialtabelle) verwendet, und die Beschichtung der Wells wurde mit 200-300 μg/ml eines Basalmembranextrakts (siehe Materialtabelle) anstelle von 0,1% Gelatine durchgeführt. Penicillin/Streptomycin wurde den Medien nicht hinzugefügt.
Das Protokoll von Rössler et al.26 wurde ursprünglich von einem iPSC-Protokoll auf ein Makrophagen-Differenzierungsprotokoll28 adaptiert, das die EB-Bildung zur hämatopoetischen Differenzierung nutzt. Während die EB-Bildung von Forschern seit längerer Zeit für die hämatopoetische Differenzierung verwendet wird29,30, wurden in der Literatur mehrere Methoden der EB-Induktion beschrieben, wie z. B. spontane Aggregation, Zentrifugation in einer Well-Platte mit rundem Boden, hängende Tropfenkultur, Bioreaktorkultur, konische Röhrchenkultur, langsam drehende laterale Gefäße und Mikroformgelkultur31. Dieses Protokoll verwendet die Zentrifugation von dissoziierten iPS-Zellen in einer Well-Platte mit rundem Boden, um einzelne iPSC-Zellen in die Nähe zueinander zu bringen und die Bildung von Kugeln (EB) zu ermöglichen, wie im Folgenden beschrieben.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper - Anti-Cathepsin K&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab19027</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper - APC-konjugiertes Anti-Human-CD45</td><td>BD</td><td>555485</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper - APC-konjugiertes Maus-IgG1, &kappa; Isotyp-Kontrolle</td><td>BD</td><td>555751</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper - BV711-konjugierter Anti-Human-CD14</td><td>BD</td><td>563372</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper - BV711-Konjugate Maus IgG2b, &kappa; Isotypkontrolle</td><td>BD</td><td>563125</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper - Ziege Anti-Kaninchen IgG H& L Alexa Fluor&reg; 647</td><td>Abcam</td><td>ab150079</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper - PE-konjugiertes Anti-Human-CD14</td><td>R& D Systems</td><td>FAB3832P-025</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper - PE-konjugiertes Anti-Human-Integrin alpha M/CD11b</td><td>R& D Systems</td><td>FAB16991P-025</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper - PE-Cy7-konjugiertes Anti-Human-CD34</td><td>BD</td><td>560710</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper - PE-Cy7-konjugiertes Maus-IgG1 & Kappa; Isotypkontrolle</td><td>BD</td><td>557872</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper - PE/Cyanin5-konjugiertes Anti-Human-CD11b</td><td>Biolegend</td><td>301308</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper - PE/Cyanin5-konjugiertes Maus-IgG1, &kappa; Isotyp Ctrl</td><td>Biolegend</td><td>400118</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper - PerCP-Cy5.5-konjugiertes Maus-IgG1 & kappa; Isotypkontrolle</td><td>BD</td><td>550795</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper - PerCpCy5.5-konjugiertes Anti-Human-CD43</td><td>BD</td><td>563521</td><td></td></tr><tr><td>Knochenresorptions-Assay-Kit</td><td>CosmoBioUSA</td><td>CSR-BRA-24KIT</td><td></td></tr><tr><td>Countess 3 Automatisierter Zellzähler</td><td>ThermoFisher</td><td>16812556</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Stammzell-qualifizierter Basalmembranextrakt mit reduziertem Wachstumsfaktor</td><td>R& D Sytems</td><td>3434-010-02</td><td>Basalmembranextrakt</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>R& D Systems</td><td>5748/10</td><td></td></tr><tr><td>Dispase (5 U/ml)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 mit 15 mM HEPES-Stammzelle</td><td></td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Morphogenetisches Protein 4 (hBMP4)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78211</td><td></td></tr><tr><td>Humaner IL-3</td><td>STEMCELL</td> Technologies <td>78146.1</td><td></td></tr><tr><td>Humaner Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (hM-CSF)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78150.1</td><td></td></tr><tr><td>Humaner löslicher Rezeptoraktivator des Kernfaktors-&kappa; B-Ligand (hsRANKL)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78214.1</td><td></td></tr><tr><td>Humaner Stammzellfaktor (hSCF)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78155.1</td><td></td></tr><tr><td>Humaner TruStain FcX (Fc-Rezeptor-Blockierungslösung)</td><td>Biolegend</td><td>422301</td><td></td></tr><tr><td>Humaner vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor-165 (hVEGF165)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78073</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Rhodamin-Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>MEM &alpha;, Nukleoside, kein Phenolrot</td><td>ThermoFisher</td><td>41061029</td><td></td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05855</td><td>Serumfreies Kryokonservierungsmedium</td></tr><tr><td>mTeSR Plus Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0276</td><td>Humanes iPSC-Serummedium (hiPSC-SFM)</td></tr><tr><td>Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-behandelt, U-förmiger-Boden Mikrotiterplatte</td><td>Thermo Scientific</td><td>174925</td><td>96-Well-Platte mit rundem Boden und extrem niedriger Bindung</td></tr><tr><td>P1000 Spitzen mit breiter Bohrung</td><td>ThermoFisher</td><td>2079GPK</td><td></td></tr><tr><td>ROCK-Inhibitor Y-27632</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM</td><td>StemCell</td><td>09650</td><td>Hämatopoetisches Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzym (1X), ohne Phenolrot</td><td>Thermo Fisher</td><td>12563011</td><td>Einzelzell-Dissoziationsreagenz</td></tr><tr><td>Ultraglutamin</td><td>Bioscience</td><td>Lonza BE17-605E/U1</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Serumfreies hämatopoetisches Zellmedium</td><td>Bioscience</td><td>Lonza 04-418Q</td><td>Hämatopoetisches Basalmedium</td></tr> <tr><td>& Mikro;-Slide 8 Well High</td><td>Ibidi</td><td>80806</td><td></td></tr></tbody></table>

differenzierung und charakterisierung von osteoklasten aus humanen induzierten pluripotenten stammzellen

Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dieses Protokoll beschreibt die Vermehrung und Passage von humanen iPS-Zellen und ihre Differenzierung in Osteoklasten. Zunächst werden iPS-Zellen in eine einzellige Suspension dissoziiert, um sie in der Induktion des Embryoidkörpers weiter zu verwenden. Nach der mesodermalen Induktion durchlaufen die Embryoidkörper eine hämatopoetische Differenzierung, wodurch eine schwimmende hämatopoetische Zellpopulation entsteht. Anschließend durchlaufen die geernteten hämatopoetischen Zellen einen Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktorreifungsschritt und schließlich eine Osteoklastendifferenzierung. Nach der Osteoklastendifferenzierung werden die Osteoklasten durch eine Färbung für TRAP in Verbindung mit einer methylgrünen Kernfärbung charakterisiert. Osteoklasten werden als mehrkernige, TRAP+-Polykaryonen beobachtet. Ihre Identifizierung kann durch die Cathepsin-K-Färbung weiter unterstützt werden. Knochen- und Mineralresorptionsassays ermöglichen eine funktionelle Charakterisierung und bestätigen die Identität von echten Osteoklasten. Dieses Protokoll stellt eine robuste und vielseitige Methode zur Unterscheidung menschlicher Osteoklasten von iPS-Zellen dar und ermöglicht eine einfache Anwendung in Anwendungen, die große Mengen an funktionellen menschlichen Osteoklasten erfordern. Denkbar wären Anwendungen in den Bereichen Knochenforschung, Krebsforschung, Tissue Engineering und Endoprothesenforschung.

Überwachung der Zellmorphologie während des gesamten Differenzierungsprozesses Alle unten beschriebenen Ergebnisse wurden mit der MCND-TENS2 iPSC-Linie zur OC-Differenzierung generiert. Diese iPSC-Linie wurde bereits in mehreren Studien eingesetzt 32,33. Nichtsdestotrotz wurden auch andere iPSC-Linien mit diesem Differenzierungsprotokoll erfolgreich eingesetzt.
Regelmäßige visuelle Untersuchungen zeigen unterschiedliche und ausgeprägte morphologische Merkmale von iPS-Zellen während des gesamten Differenzierungsprozesses zu OCs (Abbildung 2). iPSC-Kolonien (Abbildung 2A) wurden in eine einzellige Suspension dissoziiert, die vor der Zentrifugation als einzelne Zellen in der runden Well-Platte erscheint (Abbildung 2B). Nach der Zentrifugation (Schritt 4.9 des Protokolls) sammeln sich die Zellen in der Mitte der Well-Platte mit rundem Boden und extrem niedriger Befestigung und bilden anschließend Kugeln (Embryoidkörper, EBs, Abbildung 2C). EBs nehmen während des mesodermalen Differenzierungsprozesses um das Zwei- bis Dreifache zu (Abbildung 2D) und werden am Ende der 4-tägigen Differenzierungsperiode für das Auge gut sichtbar (Abbildung 2E). Es ist zu sehen, wie EBs nach dem Transfer einer 6-Well-Platte zur hämatopoetischen Differenzierung in die Wells (Schritt 5.3 im Protokoll, Abbildung 2F) mit dem Wellplattenboden haften und verschmelzen. Nach 7-8 Tagen werden große Mengen schwimmender hämatopoetischer Zellen im Kulturmedium sichtbar (Abbildung 2G). Nach der Entnahme und Neuplattierung der hämatopoetischen Zellen folgt eine M-CSF-Reifungsphase, in der die OC-Differenzierung eingeleitet wird (Schritt 6.4 im Protokoll). Innerhalb von 5-6 Tagen werden zunächst mehrkernige Zellen mit einem großen transparenten Zellkörper sichtbar (Abbildung 2H). Zu diesem Zeitpunkt ist noch eine große Anzahl von mononukleären Zellen sichtbar. Nach 2-3 weiteren Tagen der OC-Differenzierung verschmelzen die OCs weiter mit benachbarten Zellen und bilden große Polykarionen mit noch mehr Zellkernen (Abbildung 2I).
Beurteilung der EB-abgeleiteten hämatopoetischen Population Die hämatopoetische Differenzierung kann über einen variablen Zeitraum durchgeführt werden. In der Literatur wurden Zeiträume von 7 Tagen bis zu 9 Wochen beschrieben. In diesem Protokoll wird die hämatopoetische Differenzierung über einen Zeitraum von 10 Tagen durchgeführt. Wir fanden heraus, dass 10 Tage hämatopoetischer Differenzierung eine geringe Anzahl von CD34+ im Frühstadium (0,53 %, Abbildung 3A) und eine größere Anzahl von CD43+ im mittleren Stadium (48,5 %, Abbildung 3B) ergaben. Noch kritischer ist, dass nach einer Behandlungszeit von 10 Tagen ausreichende Mengen an CD45+ (96,2 %, Abbildung 3C), CD14+ (33 %, Abbildung 3D) und CD11b+ (35,9 %, Abbildung 3E) HPCs erzeugt wurden, um sie erfolgreich weiter in OCs zu differenzieren. Der Zytokinbehandlungszeitraum für die hämatopoetische Differenzierung (Schritt 5.4 im Protokoll) muss jedoch möglicherweise auf der Grundlage der iPSC-Linie angepasst und optimiert werden, um ausreichende Mengen an CD45+-, CD14+- und CD11b+ -Zellen zu erzeugen.
Im Durchschnitt wurden 6 Millionen hämatopoetische Zellen nach 10 Tagen Differenzierung aus jeder Vertiefung mit 8 EBs geerntet.
Beurteilung der OC-Morphologie und -Aktivität Im Anschluss an die OC-Differenzierung können OCs morphologisch und funktionell beurteilt werden. OC-Vorläufer werden nach dem M-CSF-Reifungsschritt auf Kammerobjektträger oder Deckglas-Objektträger zurückgesät, um die Bildqualität bei der Färbung für TRAP oder Cathepsin K zu verbessern. Die enzymatische TRAP-Färbung nach OC-Differenzierung zeigt große, mehrkernige, TRAP-positive OCs (Abbildung 4A). Zusätzlich sind leicht TRAP-positive mononukleäre Zellen zu sehen, die zwischen multinukleären OCs eingestreut sind. Negativkontrollen ohne Zusatz von RANKL zeigen kein fusioniertes multinukleares OC an. Nichtsdestotrotz kann eine kleine Anzahl leicht TRAP-positiver mononukleärer Zellen dargestellt werden (Abbildung 4B).
Bilder der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) zeigen OCs, die für Cathepsin K (türkis) und F-Aktin (rot) in Verbindung mit der DAPI-Kernfärbung (blau) gefärbt sind (Abbildung 4C, 4D). Große multinukleäre OCs sind sichtbar, wenn sie gemäß dem Protokoll mit RANKL behandelt werden, das eine ausgedehnte F-Aktin-Zytoskelettstruktur und eine positive Färbung für Cathepsin K darstellt (Abbildung 4C). Negativkontrollen ohne Zusatz von RANKL zeigen dagegen keine fusionierten mehrkernigen Zellen.
OCs können durch die Messung der resorptiven Aktivität weiter funktionell beurteilt werden. Knochen- oder Mineralresorptionsassays können verwendet werden, um die resorptive Aktivität zu bestimmen. Hier wurden OC-Vorläufer auf Kalziumphosphat-beschichtete Wells gesät und terminalisiert differenziert. Große Bereiche, in denen die mineralische Beschichtung resorbiert wurde, sind bläulich-grau sichtbar (Abbildung 4E). Resorptionsgruben unterschiedlicher Größe können identifiziert werden. Nicht resorbiert, ist die verbleibende Kalziumphosphatschicht braun sichtbar. Das Vorhandensein von Resorptionsgruben bestätigt die Identität der differenzierten mehrkernigen Zellen als OCs. Darüber hinaus können Resorptionsgruben weiter quantifiziert werden, um die Resorptionsaktivität zu bewerten und zu vergleichen. Die Gesamtfläche des resorbierten Minerals über die gesamte Bohrlochoberfläche kann als prozentuales Maß quantifiziert werden. Zusätzlich kann die Größe und Anzahl der Resorptionsgruben weiter quantifiziert werden. Unbehandelte Negativkontrollen wiesen keine Resorptionsgruben auf (Abbildung 4F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66527/66527fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des Osteoklasten-Differenzierungsprozesses aus humanen iPS-Systemen. Illustration gezeichnet von Hannah Blümke mit Affinity Designer 2.1.1. Die Darstellung verwendet zuvor verwendete Zeichnungen33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66527/66527fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66527/66527fig02.jpg"> Abbildung 2: Mikroskopische Aufnahmen während des gesamten Differenzierungsprozesses von humanen iPS-Zellen zu Osteoklasten. (A) Undifferenzierte iPSC-Kolonien während der gesamten Vermehrung. (B) iPS-Zellen in Vertiefungen mit rundem Boden nach Dissoziation in eine Einzelzellsuspension vor der Zentrifugation. (C) Zentral gesammelte Einzelzell-iPS-Zellen nach Zentrifugation. (D) EBs nehmen während der 4-tägigen mesodermalen Differenzierungsperiode an Größe zu. (E) Sichtbare Embryoidkörper nach mesodermaler Differenzierung. (F) Nach dem Transfer der Embryoidkörper auf mit Basalmembranextrakt beschichtete 6-Well-Platten kann man sehen, wie die Embryoidkörper am Well-Boden haften und mit ihm verschmelzen. (G) Nach 5-7 Tagen hämatopoetischer Differenzierung kann eine große Anzahl von schwimmenden hämatopoetischen Zellen im Medium beobachtet werden. (H) Nach der M-CSF-Reifung erscheinen nach 5-7 Tagen Differenzierung mit RANKL die ersten Osteoklasten mit 3-4 Zellkernen. (I) Am Ende der Osteoklastendifferenzierung können große mehrkernige Zellen beobachtet werden. Maßstabsleisten: A, D, F, G = 200 μm, B, C, H, I = 50 μm, E = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66527/66527fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66527/66527fig03.jpg"> Abbildung 3: Oberflächenmarkeranalyse von hämatopoetischen Zellen des Embryoidkörpers mittels Durchflusszytometrie. Die Markerexpression ermöglicht die Analyse hämatopoetischer Zellen und die Identifizierung von Subpopulationen nach Gating für Singuletts und lebende Zellen. (A) Ontogenetisch frühe CD34+ hämatopoetische Vorläuferzellpopulation ist in Verbindung mit diesem Protokoll sehr klein bis gar nicht vorhanden. (B) CD43+ -Zellen machen etwa 50% der gesamten Bevölkerung aus. (C) CD45+ hämatopoetische Vorläuferzellen im Spätstadium machen mit 96,2% den größten Teil der hämatopoetischen Population aus. (D, E) Direktere CD14+ - und CD11b+ -OC-Vorläufer machen 33 % bzw. 36 % aus. In rot: ungefärbte Negativkontrolle, in blau: Isotyp-Kontrollen, in gelb: Zellen, die mit dem jeweiligen Marker-Antikörper gefärbt sind. Für die Diagramme werden zuvor veröffentlichte Datenverwendet 33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66527/66527fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66527/66527fig04.jpg"> Abbildung 4: Morphologische und funktionelle Beurteilung von iPSC-differenzierten humanen Osteoklasten. (A) Die TRAP-Färbung nach Osteoklastendifferenzierung zeigt große, mehrkernige, TRAP-positive Osteoklasten. Leicht TRAP-positive mononukleäre Zellen sind zwischen multinukleären Osteoklasten eingestreut. (B) Negativkontrollen ohne Zusatz von RANKL, das für TRAP gefärbt wurde, zeigen keine fusionierten multinukleären Osteoklasten. Nichtsdestotrotz kann eine kleine Anzahl leicht TRAP-positiver, mononukleärer Zellen dargestellt werden. (C) Konfokale Laser-Scanning-mikroskopische Aufnahmen von Osteoklasten-differenzierten hämatopoetischen Zellen auf einem Deckglas-Objektträger, der für F-Aktin (rot) und Cathepsin K (türkis) gefärbt ist, in Verbindung mit DAPI-Kernfärbung (blau) zeigen große mehrkernige Cathepsin K-positive Osteoklasten. (D) Negativkontrollen ohne Zusatz von RANKL zeigen ähnliche wie (B) mononukleäre Zellen bei geringerer Zelldichte. (E) Die funktionelle Beurteilung kann durch die Beurteilung der Resorptionsaktivität von Osteoklasten erfolgen. Dazu wird die Osteoklastendifferenzierung mit einem Knochen- oder Mineralresorptionsassay durchgeführt. Gekachelte Well-Bilder, die mit einem inversen Weitfeldmikroskop im Phasenkontrastmodus aufgenommen wurden, zeigen große Resorptionsbereiche der Kalziumphosphat-Mineralschicht. Die resorptive Aktivität kann weiter quantifiziert werden, indem die Resorptionsfläche über die Gesamtfläche gemessen wird. (F) Negativkontrollen ohne Zusatz von RANKL zeigen keine Resorptionsbereiche. Maßstabsleisten: A, B = 100 μm, C, D = 50 μm, E, F = 1 mm. Die Bilder wurden aus zuvor veröffentlichten Daten bearbeitet33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66527/66527fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Dieses Protokoll stellt die Differenzierung humaner Osteoklasten aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) dar und beschreibt Methoden zur Charakterisierung von Osteoklasten und Osteoklastenvorläufern.

Differenzierung und Charakterisierung von Osteoklasten aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a ...

Einleitung.Osteoklasten sind ein mehrkerniger Zelltyp, der häufig von Forschern in Bereichen wie der Erforschung von Knochenkrankheiten, Krebsforschung, Gewebezüchtung und Endoprothesenforschung verwendet wird. Dennoch kann die Osteoklastendifferenzierung eine Herausforderung darstellen, da eine Fusion von Vorläufern notwendig ist. Darüber hinaus erfordert die Differenzierung menschlicher Osteoklasten von IPSCs den Einsatz einer Vielzahl biologischer Faktoren zum richtigen Zeitpunkt.Wenn es um menschliche Primärzellen geht. CD34+periphere mononukleäre Blutzellen sind derzeit der am weitesten verbreitete Zelltyp für die Differenzierung in Osteoklasten. Dieser Ansatz ist jedoch durch die Heterogenität innerhalb der CD34+-Population und deren begrenzte Erweiterbarkeit begrenzt.Humane IPSCs stellen eine alternative Quelle für Osteoklasten dar. Da sie unbegrenzt vermehrt werden können, ermöglichen sie eine Erweiterbarkeit und Hochskalierung der Osteoklastenproduktion. Dies ermöglicht die Differenzierung einer großen Anzahl von Osteoklasten, was die Osteoklastenforschung erleichtert.Hier demonstrieren unser Postdoc Alexander Blumke und die Doktorandin Jessica Simon die Differenzierung von Osteoklasten von humanen IPSCs, die IPSCs passieren. Beginnen Sie mit der Passage von IPSCs, indem Sie differenzierte Regionen oder Regionen mit vielen toten IPSC-Aggregaten unter dem Stereomikroskop mit einer P-10- oder P-20-Pipettenspitze oder einem Zellschaber entfernen. Differenzierte Bereiche erscheinen dichter und weißer.Waschen Sie die abgelösten Zellen mit altem Medium und waschen Sie dann alle verbleibenden abgelösten Zellen zweimal mit PBS weg. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter von fünf Einheiten pro Milliliter Dispase pro Vertiefung in die Vertiefung hinzu. Die Ränder der Kolonien, die sich von der Schale abheben, können nach drei bis fünf Minuten unter dem Stereomikroskop beobachtet werden.Entfernen Sie vorsichtig die Dispase und fügen Sie einen Milliliter DMEM/F-12 mit 15-Millimolar-HEPES hinzu. Verwenden Sie ein Stammzellen-Passage-Werkzeug oder einen Einweg-Zellheber, um die Aggregate klein zu schneiden. Füllen Sie die Medien mit Aggregaten in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette oder einem P-1000 mit breiter Spitze.Spülen Sie die Vertiefung mit DMEM/F-12 und füllen Sie das Medium in das 15-Milliliter-Röhrchen. Die in Scheiben geschnittenen IPSC-Zuschlagstoffe werden drei Minuten lang bei 200 g zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pasteur-Glaspipette und fügen Sie zwei Milliliter humanes IPSC-serumfreies Medium hinzu, um die IPSCs mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette oder P-1000 mit breiter Spitze zu lösen und zu resuspendieren.Saugen Sie den übrig gebliebenen Basalmembranextrakt von den vorbeschichteten Well-Platten ab und geben Sie einen Milliliter humanes IPSC-serumfreies Medium in jede Vertiefung der Sechs-Well-Platte. Übertragen Sie IPSCs in neue Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte, so dass das Endvolumen zwei Milliliter humanes IPSC-serumfreies Medium pro Well beträgt, wobei ein P-1000 mit breiter Bohrung verwendet wird. Je nach IPSC-Linie müssen die Split-Verhältnisse optimiert werden.Hier wurde ein Split-Verhältnis von 1:6 verwendet. Schwenken Sie die Well-Platte, um die Zellen gleichmäßig über die Platte zu verteilen, nachdem die Aggregate übertragen wurden. Induktion des Embryoidkörpers.Saugen Sie das alte Medium aus den IPSC-Kulturen ab und spülen Sie die Vertiefungen mit DPBS. Geben Sie einen halben Milliliter auf Raumtemperatur vorgewärmtes Wasser in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte und schwenken Sie das Kulturgefäß, um die gesamte Well-Oberfläche zu beschichten. Inkubieren Sie das Kulturgefäß bei 37 Grad Celsius für fünf bis acht Minuten.Das Gefäß wird aus dem Inkubator genommen, die Lösung abgesaugt und das Medium der Stufe 1 in Vertiefungen gegeben, die aus 50 Nanogramm pro Milliliter humanem knochenmorphogenem Protein 4, 50 Nanogramm pro Milliliter humanem vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor 165, 20 Nanogramm pro Milliliter humanem Stammzellfaktor und 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren Y-27632 bestehen. Lösen Sie die Zellen vorsichtig ab, indem Sie die Vertiefung mit einem Medium der ersten Stufe spülen. Ziehen Sie die Zellen in ein konisches Röhrchen.Geben Sie ein neues Medium der Stufe 1 in die Vertiefungen und lösen Sie alle verbleibenden Zellen mit einem Zellschaber. Nachdem Sie alle Zellen in das Röhrchen umgefüllt haben, zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 200 g, um die Zellen zu pelletieren. Die Zellen werden in insgesamt zwei Millilitern voräquilibriertem Medium der ersten Stufe abgesaugt und resuspendiert.Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzählgerät Seed 12, 500 Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden und ultraniedrigem Aufsatz in 100 Mikrolitern Medium der ersten Stufe. Unter dem Mikroskop erscheinen die Zellen diffus in der gesamten Lösung. Zentrifugieren Sie die 96-Well-Platten drei Minuten lang bei 100 g Nach dem Zentrifugieren sollten die Zellen beginnen, Sphäroiden zu ähneln, wenn sie unter dem Mikroskop betrachtet werden.Legen Sie die Platte in einen 37 Grad warmen Inkubator. Wechseln Sie die Hälfte des Mediums am ersten Tag und am zweiten Tag mit den Medien der ersten Stufe. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um altes Medium in eine Petrischale zu entsorgen.Nachdem Sie die Medien von der 96-Well-Platte entsorgt haben, suchen Sie nach EBs, die möglicherweise versehentlich entfernt wurden. Übertragen Sie die versehentlich entfernten EBs mit einer P-1000-Pipette zur hämatopoetischen Differenzierung in die Petrischale zurück. Vorfüllen von Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte mit drei Millilitern Medium der Stufe zwei, zu dem zwei Millimolar Ultraglutamin, 55 Mikromolar Beta-Mercaptoethanol, 25 Nanogramm pro Milliliter, humanes Interleukin-3 und 100 Nanogramm pro Milliliter humaner Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor hinzugefügt werden.Übertragen Sie mit einem P-1000 und einer Wide-Bore-Spitze acht EBs in jede Vertiefung der Sechs-Well-Platte. Nach dem Transfer wird unter dem Stereomikroskop mit dem Auge überprüft, ob sich in jeder Vertiefung acht EBs befinden. Nach fünf bis sieben Tagen sollte eine schwimmende Zellpopulation aus hämatopoetischen Zellen sichtbar werden.Die hämatopoetische Differenzierungsperiode kann variiert werden, beginnend mit sieben Tagen. Die Differenzierung über 10 Tage ergab eine hämatopoetische Population, die sich aus großen CD45+CD14+ und CD11b+ Subpopulationen zusammensetzte. Nach fünftägiger Behandlung mit Medium der zweiten Stufe führen Sie einen Mediumwechsel durch, indem Sie das alte Medium vorsichtig entfernen und in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen abgeben.Geben Sie sofort einen Milliliter des neuen Mediums der Stufe zwei in die Vertiefungen. Um eventuell bereits vorhandene schwimmende hämatopoetische Zellen zu retten, schleudern Sie das Röhrchen mit dem alten Medium bei 300 G fünf Minuten lang ab. Geben Sie ein neues Medium der zweiten Stufe in das Röhrchen und resuspendieren Sie es, um Zellen zu lösen, die möglicherweise mit dem alten Medium übertragen wurden.Geben Sie zwei Milliliter des neuen Mediums der Stufe zwei mit gespeicherten Zellen in jede Vertiefung, die zuvor mit einem Milliliter des Mediums der Stufe zwei gefüllt war. Am 10. Tag der hämatopoetischen Differenzierung werden schwimmende hämatopoetische Zellen geerntet, indem sie in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen gesammelt werden, und können entweder mit 10 % DMSO, 50 % FBS und 40 % Medium wieder eingefroren oder sofort zur weiteren Differenzierung der Zellen in Osteoklasten verwendet werden. M-CSF-Reifung und Osteoklastendifferenzierung.Samenzellen bei 200.000 Zellen pro Quadratzentimeter und drei Tage lang mit Alpha-MEM behandelt, ergänzt mit 10% FBS und 50 Nanogramm pro Milliliter M-CSF. Um funktionelle Assays oder Bildgebung durchzuführen, trennen Sie die MCSF-gereiften Zellen ab, indem Sie sie mit einem P-1000 mit breiter Spitze waschen. Abgelöste Zellen mit altem Medium in ein Röhrchen überführen und fünf Minuten lang bei 300 g herunterschleudern.Resuspendieren und lösen Sie das Zellpellet mit frischem Alpha-MEM auf, das mit 10 % FBS, 50 Nanogramm pro Milliliter M-CSF und 80 Nanogramm pro Milliliter RANK-Ligand ergänzt ist. Die Zellen werden bei 200.000 Zellen pro Quadratzentimeter neu ausgesät und sieben bis neun Tage lang differenziert. Mehrkernige Osteoklasten treten typischerweise am fünften bis siebten Tag auf.Repräsentative Ergebnisse. Die Zusammensetzung der erzeugten hämatopoetischen Zellpopulation kann mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. Hier zeigen hämatopoetische Zellen eine große Population von CD45+Vorläuferzellen.Zellpopulationen, die die Monozytenmarker CD14 und CD11b exprimieren, machen im Vergleich zu Isotypkontrollen in der Regel ein Drittel der Gesamtpopulation aus. Termindifferenzierte IPSC-abgeleitete Osteoklasten können unter dem Mikroskop als TRAP-positive mehrkernige Zellen betrachtet werden. Die konfokale Mikroskopie zeigt die Färbung der Zellen für Cathepsin K. Funktionelle Assays wie Knochen- oder Mineralabsorptionsassays ermöglichen eine weitere Quantifizierung der Osteoklastenaktivität.Hier sind Resorptionsgruben sichtbar, nachdem reifer Osteoklasten vor der Bildgebung mit 10%igem Bleichmittel entfernt wurden, während M-CSF-gereifte Osteoklastenvorläufer, die ohne Zugabe von RANK-Liganden behandelt wurden, keine Resorptionsgruben aufweisen. Schlussfolgerung. Dieses Protokoll ermöglicht die robuste und zuverlässige Differenzierung menschlicher Osteoklasten und könnte eine Standardlösung für Knochenerkrankungen oder Erkrankungen mit übermäßiger Verkalkung darstellen. Wir verwenden Osteoklasten, um sie in unsere RANK-Zellen umzuwandeln, die eine intrazelluläre Signaldomäne verwenden, die in Verbindung mit einem chemischen Dimerisierungsinduktor für eine kontrollierte und Osteoprotegerin-unabhängige Osteoklastenaktivierung aktiviert werden kann.

differentiation-characterization-osteoclasts-from-human-induced

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Osteoklasten sind die Haupt knochenresorbierenden Zellen im Körper. Eine Fähigkeit, die Osteoklasten in großer Zahl zu isolieren hat erhebliche Fortschritte im Verständnis der Osteoklasten Biologie geführt. In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung, Kultivierung und Quantifizierung der Osteoklastenaktivität in vitro.

Osteoklasten Ableitung aus Knochenmark der Maus

Notch-Signalisierung ist eine Form der zellulären Kommunikation, die auf direktem Kontakt zwischen Zellen beruht. Um den Notch-Signalweg in vitro korrekt zu induzieren, müssen Notch-Liganden den Zellen in einem immobilisierten Zustand präsentiert werden. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur in vitro Stimulation des Notch-Signalwegs in Maus-Osteoklasten-Vorläufern.

Die Stimulation der Notch-Signalweg in Maus-Osteoklasten Precursors

Wir präsentieren ein Protokoll zur Erzeugung einer chondrogenen Linie aus menschlichem peripherem Blut (PB) über induzierte pluripotenten Stammzellen (iPSCs) unter Verwendung einer integrationsfreien Methode, die Embryoidkörperbildung (EB), Fibroblastische Zellenexpansion und chondrogene Induktion umfasst.

Unterscheidung von Chondrozyten aus periphere Blut-abgeleiteten menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

In diesem Artikel präsentieren wir Methoden zum isolieren und Stromazellen Knochenmarkzellen und Blutstammzellen von Röhrenknochen Maus unterscheiden. Zwei verschiedene Protokolle sind nachgiebig unterschiedliche Zellpopulationen geeignet für Erweiterung und Differenzierung in Adipozyten, Osteoblasten und Osteoklasten vorgestellt.

Isolation, Kultur und Differenzierung von Stromazellen Knochenmarkzellen und Osteoklasten-Vorläufer von Mäusen

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) von Li-Fraumeni Syndrom (LFS) Patienten abgeleiteten Fibroblasten, Differenzierung der iPSCs über mesenchymalen Stammzellen (MSCs), Osteoblasten und Modellierung in vivo Tumorgenese mit LFS Patienten abgeleitet Osteoblasten.

Modellierung von Osteosarkom mit Li-Fraumeni-Syndrom, die Patienten abgeleitet induzierten pluripotenten Stammzellen

Osteoklasten sind gewebespezifische Makrophage-Polykaryonen, die aus der monozytenmakrophären Linie hämatopoietischer Stammzellen abgeleitet werden. In diesem Protokoll wird beschrieben, wie Knochenmarkzellen isoliert werden können, so dass große Mengen an Osteoklasten gewonnen werden, während gleichzeitig das Unfallrisiko in traditionellen Methoden reduziert wird.

Isolierung, Reinigung und Differenzierung von Osteoclast-Laufläufern aus der Rattenmarkierung

Osteoklasten sind wichtige knochenresorbierende Zellen im Körper. Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige Methode zur in vitro Differenzierung von Osteoklasten aus humanen Monozyten im peripheren Blut. Diese Methode kann als wichtiges Werkzeug verwendet werden, um die Osteoklastenbiologie in der Homöostase und bei Krankheiten besser zu verstehen.

Abgrenzung funktioneller Osteoklasten von CD14+ Monozyten aus humanem peripherem Blut

Dieses Protokoll beschreibt und vergleicht zwei repräsentative Methoden zur Differenzierung von hiPSCs in mesenchymale Stromazellen (MSCs). Die Monolayer-Methode zeichnet sich durch geringere Kosten, einfachere Bedienung und leichtere osteogene Differenzierung aus. Die Methode der Embryoidkörper (EBs) zeichnet sich durch einen geringeren Zeitaufwand aus.

Vergleich zweier repräsentativer Methoden zur Differenzierung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen in mesenchymale Stromazellen

Hier beschreiben wir ein robustes Protokoll für die Ableitung menschlicher Kardiomyozyten, das die modulierte kardiale Differenzierung kleiner Moleküle und die durch Glukoseentzug vermittelte Kardiomyozytenreinigung kombiniert und die Produktion von gereinigten Kardiomyozyten für die Zwecke der Modellierung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und des Wirkstoffscreenings ermöglicht.

Ableitung von Highly Purified Kardiomyozyten aus Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit Small Molecule modulierte Differenzierung und anschließende Glucose Starvation

Dendritischen Dornen von Pyramidenneuronen sind die Websites der meisten Synapsen im Gehirn von Säugetieren Kortex. Diese Methode beschreibt ein 3D-quantitative Analyse der Wirbelsäule Morphologien in der menschlichen kortikalen Pyramiden glutamatergen Neuronen aus induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet.

Dreidimensionale Quantifizierung der dendritischen Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Lernen Sie die Differenzierung von Osteoklasten aus humanen iPSCs für Knochenforschung und Gewebetechnik. Dieses Protokoll ermöglicht zuverlässige Zellkulturmöglichkeiten für die Biologie.

Differenzierung und Charakterisierung von Osteoklasten aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

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