Bewertung des Zusammenbruchs der Blut-Hirn-Schranke in einem Mausmodell für ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma

Wir versuchen, die komplizierten Mechanismen zu verstehen, die leichten traumatischen Hirnverletzungen zugrunde liegen, die durch die Exposition gegenüber explosionsinduzierten Stoßwellen verursacht werden. Wir untersuchen auch Methoden, um diese Symptome zu lindern. Es handelt sich um eine umfassende Beschreibung der Anfangsphase des Zusammenbruchs der Blut-Hirn-Schranke aufgrund von durch Explosionen induzierten Stoßwellen geringer Intensität.

Konkret beginnt der Abbau abrupt etwa drei Stunden nach der Exposition, und die betroffenen Läsionen werden etwa einen Tag nach dem Beginn des Auftretens umgebaut. Diese Methode ermöglicht es uns, den Abbau der BHS genauer zu untersuchen und bietet eine zusätzliche Metrik zur Bewertung der Wirksamkeit verschiedener Behandlungen, die im Falle einer Explosion angewendet werden können. Bereiten Sie zunächst ein Schockrohr vor, um das Tier den durch die Explosion induzierten Schockwellen auszusetzen.

Positionieren Sie die betäubte Maus fünf Zentimeter vom Austrittsende des Stoßdämpfers entfernt und stellen Sie sicher, dass ihre Körperachse parallel zur Achse des Stoßrohrs, aber nicht mit ihr ausgerichtet ist. Dann wird eine einzelne Stoßstoßwelle mit einem Spitzenüberdruck von 25 Kilopascal auf den Kopf des Tieres abgegeben. Bereiten Sie für die Evans-Blue-Injektion eine Evans-Blue-Lösung mit 4 Vol.-% in Kochsalzlösung vor.

Wirbeln Sie die Lösung vor und lagern Sie sie bis zur Verwendung im Dunkeln. Injizieren Sie die Evans-Blue-Lösung in einer Dosierung von 2,5 Mikrolitern pro Gramm in die Schwanzvene. Nachdem Sie die anästhesierte Maus mit dem FITC-Dextran-Farbstoff und Paraformaldehyd durchblutet haben, verwenden Sie eine chirurgische Schere und eine Pinzette, um das Gehirn vorsichtig zu entfernen.

Postfixieren Sie das Gehirn über Nacht in das gleiche Fixiermittel bei vier Grad Celsius. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Fixiermittel durch PBS. Zu Beginn erhalten Sie das fixierte Gehirn von einer mit einer Stoßwelle behandelten Maus, die mit Evans-Blau und FITC-Dextran-Farbstoffen injiziert wurde.

Bereiten Sie eine 24-Well-Platte mit 500 Mikrolitern 20 %igem Glycerin in Phosphatpuffer vor, der in jeder Vertiefung auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt ist. Schneiden Sie das Gehirn mit einem Hirnschneider koronal in 12 Scheiben, die jeweils einen Millimeter dick sind. Übertragen Sie jede Scheibe in die entsprechende Vertiefung der 24-Well-Platte und lagern Sie die Platte mindestens zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius.

Ersetzen Sie dann die Lösung durch 50%ige Glycerinphosphatpuffer und lagern Sie sie erneut bei vier Grad Celsius für mindestens zwei Stunden. Ersetzen Sie zum Schluss die Lösung durch 100%iges Glycerin. Für eine unmittelbare mikroskopische Betrachtung lassen Sie die Scheiben mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur stehen.

Geben Sie 500 Mikroliter Glycerin auf den Boden einer 35-Millimeter-Glasbodenschale. Übertragen Sie die Gehirnscheibe in die Glycerinlösung und decken Sie die Oberfläche mit einem Deckglas ab. Entfernen Sie überschüssiges Glycerin vom Rand des Deckglases.

Messen Sie die Fluoreszenzintensität der Scheibe unter einem Fluoreszenzmikroskop. Nach der mikroskopischen Messung legen Sie die Scheibe wieder in die Vertiefung der Platte. Geben Sie 500 Mikroliter Phosphatpuffer in jede Vertiefung und lagern Sie die 24-Well-Platte über Nacht bei vier Grad Celsius.

Ersetzen Sie die Lösung durch 30%igen Glycerinphosphatpuffer und inkubieren Sie die Platte mindestens zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius, bevor Sie eine Immunhistochemie durchführen. Die blaue Markierung von Evans zeigte, dass der Abbau der Blut-Hirn-Schranke oder BHS innerhalb von sechs Stunden nach der Exposition gegenüber der Schockwelle begann und bis zu sieben Tage anhielt. Die Fluoreszenz-Hotspots variierten in Größe und Intensität, wobei die reinen Evans-Blau-Hotspots auf einen BHS-Abbau während der Evans-Blau-Injektion und eine Reparatur nach der FITC-Dextran-Injektion hindeuteten. Cluster von reaktiven Astrozyten waren eng mit immunhistochemisch bestätigten BHS-Abbaustellen assoziiert.

Aktivierte Mikroglia und amöboide Mikroglia wurden drei Tage nach der Exposition gegenüber der Schockwelle neben reaktiven Astrozyten beobachtet.