Name: Bewertung des Zusammenbruchs der Blut-Hirn-Schranke in einem Mausmodell für ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T13:05:00.000+00:00
Duration: 5 min 19 s
Description: Erfahren Sie die Bewertung der Blut-Hirn-Schranke nach leichtem Schädel-Hirn-Trauma durch Stoßwellen im Mausmodell. Diese Methode nutzt duale Farbstoffinjektion zur Visualisierung und ermöglicht therapeutische Interventionen.

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<meta charset="utf8"></head><body>Fluoreszenzfarbstoffbasierte Visualisierung des Zusammenbruchs der Blut-Hirn-Schranke bei Mäusen

<ol><li>Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier%3A+From+physiology+to+disease+and+back%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier: From physiology to disease and back.</a> Physiol Rev. 99 (1), 21-78 (2019).</li>
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<li>Selever, J., Kong, J. Q., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+approach+to+high-resolution+fluorescence+imaging+in+semi-thick+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices.</a> J Vis Exp. 53, e2807(2011).</li>
<li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+sensitive+antigen+retrieval+method+for+free-floating+and+slide-mounted+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections.</a> J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).</li>
<li>Nagaraja, T. N., Keenan, K. A., Fenstermacher, J. D., Knight, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+leakage+patterns+of+fluorescent+plasma+flow+markers+after+transient+focal+cerebral+ischemia+suggest+large+openings+in+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Acute leakage patterns of fluorescent plasma flow markers after transient focal cerebral ischemia suggest large openings in blood-brain barrier.</a> Microcirculation. 15 (1), 1-14 (2010).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+blood-brain-barrier+leakage+using+a+combination+of+Evans+blue+and+high+molecular+weight+fitc-dextran%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying blood-brain-barrier leakage using a combination of Evans blue and high molecular weight fitc-dextran.</a> J Neurosci Methods. 325, 108349(2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>10% Formalin Neutral Pufferlösung</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals</td><td>062-01661</td><td></td></tr><tr><td>Anti GFAP, Kaninchen</td><td>DAKO-Agilent</td><td>IR524</td><td></td></tr><tr><td>Anti Iba1, Kaninchen</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Huhn Anti-Maus IgG (H+L) Kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21200</td><td></td></tr><tr><td>Kryo-Halterung</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>33351</td><td>Einfriermedium für Gewebe</td></tr><tr><td>Domitor</td><td>Orion Corporation</td><td></td><td>Medetomidin</td></tr><tr><td>Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10040</td><td></td></tr><tr><td>Evans Blue</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24-Well-Zellkulturplatte aus Polystyrol mit klarem flachem Boden und Deckel, einzeln verpackt, steril, 50/Karton</td><td>CORNING</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-Isothiocyanat; Dextran durchschnittlich mol wt 40.000</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td>FD40S</td><td>FITC-Dextran</td></tr><tr><td>Glasbodenschale 27mm (Nr.1 Glas)</td><td>AGC TECHNO GLASS</td><td>3910-035</td><td>35 mm Glasbodenschale</td></tr><tr><td>IX83 Inverses Mikroskop</td><td>OLYMPUS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAS Hydrophile Adhäsionsmikroskop Objektträger</td><td>Matsunami Glas</td><td>MAS-04</td><td></td></tr><tr><td>Matsunami&nbsp; Deckglas (Nr.1)&nbsp; 18 x 18mm</td><td>Matsunami Glas</td><td>C018181</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam Injektion 10mg [SANDOZ]</td><td>Sandoz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd EMPROVE ESSENTIAL DAC</td><td>Merck Millipore</td><td>1.04005.1000</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltische Pumpe</td><td>ATTO</td><td>SJ-1211 II-H</td><td></td></tr><tr><td>NAGETIER BRAIN MATRIX Erwachsene Maus, 30 g, Koronaler</td><td>ASI INSTRUMENTS</td><td>RBM-2000C</td><td>Gehirnschneider</td></tr><tr><td>Vetorphale</td><td>Meiji Tiergesundheit</td><td>VETLI5</td><td>Butorphanol</td></tr></tbody></table>

bewertung des zusammenbruchs der blut-hirn-schranke in einem mausmodell für ein leichtes schädel-hirn-trauma

Evaluation of Blood-Brain Barrier Breakdown in a Mouse Model of Mild Traumatic Brain Injury

Abbildung 1A zeigt den zeitlichen Verlauf der Farbstoffinjektion in Bezug auf das Einsetzen von BSW mit einem Spitzenüberdruck von 25 kPa. Im "Post"-Protokoll wurde die Evans-Blue-Lösung intravaskulär 2 h vor der FITC-Dextran-Perfusion verabreicht, die 6 h, 1 Tag, 3 Tage und 7 Tage nach der BSW-Exposition durchgeführt wurde. Im "Pre"-Protokoll wurde die Evans-Blue-Lösung unmittelbar vor der BSW-Exposition injiziert. Im "Post"-Protokoll wird erwartet, dass die Konzentration von Evans-Blau ihr Maximum etwa 2 Stunden vor der Perfusionsfixierung erreicht, während sie im "Pre"-Protokoll voraussichtlich zum Zeitpunkt der BSW-Exposition ihr Maximum erreicht (Abbildung 1B). Die Konzentration von FITC-Dextran in den Hirn-Blutgefäßen wurde während der Perfusion für 2 min konstant gehalten.
Die blaue Markierung von Evans zeigte, dass der BHS-Abbau innerhalb von 6 Stunden begann und bis 7 Tage nach der BSW-Exposition andauerte (Abbildung 2A). Bemerkenswert ist, dass der BHS-Abbau nicht unmittelbar nach der BSW-Exposition auftrat, da es im "Pre"-Protokoll nach 3 Stunden keine Evans-Blau-Farbstoff-Extravasation gab (Abbildung 2B). Überraschenderweise zeigte die Langzeitmarkierung mit Evans-Blau seinen kumulativen Charakter im "Pre"-Protokoll (Abbildung 2B)7.
Die Verwendung von zwei unterschiedlichen Farbstoffen, die jeweils in Abständen von 2 h oder mehr eingeführt wurden, ermöglichte die Untersuchung zeitlicher Veränderungen der BHS-Integrität durch Vergleich ihrer Verteilung. Abbildung 3 zeigt Fluoreszenzbilder der Schnitte, die einen signifikanten Unterschied in der Verteilung von Evans-Blau und FITC-Dextran zeigten.
Es wurden zahlreiche Fluoreszenz-Hotspots unterschiedlicher Größe beobachtet. Obwohl einige Hotspots hell genug waren, um zu den oberen 0,1 % der Pixel zu gehören, waren viele nur geringfügig heller als das umgebende Gewebe. Die Diskrepanz zwischen den Farbstoffen deutet darauf hin, dass innerhalb dieses Intervalls Veränderungen stattfanden. Hotspots, die nur Evans-Blau-Fluoreszenz zeigten, deuteten auf einen anhaltenden BHS-Abbau zum Zeitpunkt der Evans-Blau-Injektion hin, der später durch die FITC-Dextran-Injektion repariert wurde. Im Gegensatz dazu deuteten Hotspots, die nur FITC-Dextran-Fluoreszenz zeigten, darauf hin, dass zwischen den beiden Farbstoffinjektionen eine BHS-Störung auftrat. Schließlich deuteten Hotspots, die eine Fluoreszenz beider Farbstoffe zeigten, auf einen kontinuierlichen BHS-Abbau während der gesamten Injektionsperiode hin.
Abbildung 4A zeigt die Anzahl der Hotspots, die positiv für Evans-Blau (einschließlich Evans-Blau nur und Evans-Blau/FITC-Dextran-Double-Positive-Hotspots), FITC-Dextran (einschließlich sowohl FITC-Dextran-only-Hotspots als auch Evans-Blau/FITC-Dextran-Double-Positive-Hotspots) oder beide Farbstoffe (nur Evans-Blau/FITC-Dextran-Double-Positive-Hotspots) sind. Im "Pre"-Protokoll nach 3 h wurden zahlreiche FITC-only-Dextran-Hotspots beobachtet. Nach 6 Stunden und 1 Tag im "Post"-Protokoll wurden sowohl Evans-Blue-only- als auch FITC-only-Dextran-Hotspots erkannt. Nach 3 Tagen und 7 Tagen im "Post"-Protokoll waren die Hotspots jedoch überwiegend positiv für beide Farbstoffe. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der BHS-Abbau nach 3 Stunden auftrat, um 1 Tag umgebaut wurde und bis 7 Tage nach der BSW-Exposition anhielt (Abbildung 4B). Wichtig ist, dass das Ausmaß des BHS-Abbaus, wie bereits erwähnt, tendenziell um 7 Tage abnahm.
Nach Abschluss der Farbstoffextravasationsexperimente wurde eine immunhistochemische Färbung der Schichten durchgeführt7. Die immunhistochemischen Bildscans wurden konsistent mit denen der Farbstoffextravasationen verglichen, was bestätigte, dass der Verschleppungseffekt der fluoreszierenden Substanzen praktisch vernachlässigbar war7. Wie in Abbildung 5 gezeigt, waren Cluster von reaktiven Astrozyten eng mit den Stellen des BHS-Abbaus verbunden. Weitere Beobachtungen zeigten, dass aktivierte und amöboide Mikroglia neben reaktiven Astrozyten 3 Tage nach der BSW-Exposition vorhanden waren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66653/66653fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Versuchsaufbau. (A) Zeitlicher Verlauf des Experiments. Die Evans-Blue-Lösung wurde intravenös nach (Post-Protokoll) oder unmittelbar vor (Prä-Protokoll) BSW-Exposition injiziert, während FITC-Dextran 2 Minuten vor der Fixierung transkardial perfundiert wurde. (B) Erwartete Konzentrationen von Evans-Blue und FITC-Dextran in den Blutgefäßen im "Post"- bzw. "Pre"-Protokoll. BSW, explosionsinduzierte Stoßwellen; FITC, Fluorescein-Isothiocyanat. Diese Abbildung ist eine Adaption von Nishii et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66653/66653fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66653/66653fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Vergleich der Fluoreszenzintensität in Hirnschnitten. Die Fluoreszenzintensität der hellsten 0,1 % der Pixel im Gehirn wurde über alle 12 Schichten hinweg gemessen und zwischen den Bedingungen "Post" (A) und "Pre" (B) verglichen. Die Variabilität und Signifikanz der Unterschiede wird angegeben. xxx bezeichnet p &lt; 0,001; xxxx bezeichnet p &lt; 0,0001 (p-Werte aus dem F-Test). *p &lt; 0,05; p &lt; 0,0001 (Varianzanalyse mit dem Dunnett-Mehrfachvergleichs-Post-hoc-Test). Diese Abbildung ist eine Adaption von Nishii et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66653/66653fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66653/66653fig03.jpg"> 
Abbildung 3: BHS-Aufschlüsselung, die zu verschiedenen Zeitpunkten unter Verwendung der doppelten Markierung mit Evans-Blau und FITC-Dextran beobachtet wurde. Dargestellt werden Evans-Blau (Magenta), FITC-Dextran (Grün) und zusammengeführte Bilder. Die Protokolle der Farbstoffinjektion sind auf der linken Seite dargestellt. Einige Hotspots zeigten eine vorherrschende Fluoreszenz von Evans-Blau (Pfeil) oder FITC-Dextran (Pfeilspitzen). Sternchen kennzeichnen den Plexus choroideus und die zugehörigen Gefäße. BHS, Blut-Hirn-Schranke; FITC, Fluorescein-Isothiocyanat; CVO, zirkumventrikuläre Organe des dritten Ventrikels. Maßstab: 1 mm. Diese Abbildung ist eine Adaption von Nishii et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66653/66653fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66653/66653fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Quantifizierung der Fluoreszenz-Hotspots. (A) Anzahl der Hotspots, die positiv für Evans-Blau (Magenta), FITC-Dextran (grün) und beide Farbstoffe (grau) sind. Sie wurden aus den Bildern gesammelt, die nach 3 Stunden im "Pre"-Protokoll aufgenommen wurden, sowie aus den Bildern, die nach 6 Stunden, 1 Tag, 3 Tagen und 7 Tagen im "Post"-Protokoll aufgenommen wurden. Von 3 h bis 1 Tag zeigte ein signifikanter Teil der Fluoreszenz-Hotspots eine Fehlanpassung zwischen den Farbstoffen, während eine solche Fehlanpassung zwischen 3 Tagen und 7 Tagen kaum beobachtet wurde. (B) Schema, das den zeitlichen Verlauf der BHS-Aufschlüsselung zusammenfasst. Die vertikale Achse stellt konzeptionell die Intensität des Farbstoffaustritts aufgrund des BHS-Abbaus dar. Das Zickzackmuster von 3 h bis 1 Tag zeigt an, dass der Ort und die Intensität des Farbstoffaustritts in diesem Zeitraum instabil sind. FITC, Fluorescein-Isothiocyanat; BHS, Blut-Hirn-Schranke; BSW, explosionsinduzierte Stoßwellen. Diese Abbildung ist eine Adaption von Nishii et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66653/66653fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66653/66653fig05.jpg"> 
Abbildung 5: Expression von GFAP und Iba1 als Marker für Astrozyten bzw. Mikroglia. Jede Spalte der Abbildung enthält Fluoreszenzbilder der Farbstoffextravasation mit Evans-Blau oder FITC-Dextran, zusammen mit immunhistochemischen GFAP- oder Iba1-Bildern. Der Farbbalken zeigt die normalisierten Fluoreszenzintensitäten von Evans-Blau und FITC-Dextran unter Verwendung der Fluoreszenzintensitäten innerhalb von GRN an. Die Protokolle der Farbstoffinjektion sind auf der linken Seite dargestellt. Die Scheibe von 1 Tag im "Pre"-Protokoll zeigt die Fluoreszenz sowohl von Evans-Blau als auch von FITC-Dextran, während die Scheibe von 3 Tagen im "Pre"-Protokoll nur die Fluoreszenz von Evans-Blau zeigt (Pfeile). Die durch die Pfeile gekennzeichneten Regionen in den Bildern der Farbstoffextravasation stimmen mit den immunhistochemischen Bildern überein. Pfeilspitzen zeigen Cluster von reaktiven Astrozyten. Der polyklonale GFAP-Antikörper markierte Astrozyten in und um die weiße Substanz sowie im Nervengewebe in der Nähe der Pia mater. Infolgedessen sind Astrozyten innerhalb und in der Nähe des dcw in dieser Abbildung markiert. Die vergrößerten Bilder, die dem Rahmen oder Pfeil in der Spalte Iba1 entsprechen, werden in den Einschüben dargestellt. Maßstabsbalken: 1 mm bzw. 200 μm für die Farbstoffextravasation bzw. immunhistochemische Bilder. GFAP, saures Protein der Gliafaser; Iba1, ionisiertes Calcium-bindendes Adaptermolekül 1; FITC, Fluorescein-Isothiocyanat; BSW, explosionsinduzierte Stoßwellen; DCW, tiefe zerebrale weiße Substanz. Diese Abbildung ist eine Adaption von Nishii et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66653/66653fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Bewertung des Zusammenbruchs der Blut-Hirn-Schranke in einem Mausmodell für ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is ...

evaluation-blood-brain-barrier-breakdown-mouse-model-mild-traumatic

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Beurteilung der Integrität der Blut-Hirn-Schranke in einem Rattenmodell mit laserinduzierter Hirnverletzung 

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Vereinfachte Modelle für traumatische Hirnverletzungen (TBI) haben die Entwicklung von Therapieansätzen erleichtert. Dieses Protokoll beschreibt die Erstellung einer Stichwunden-Mausrinde mit Hilfe von Nadeln, die die Analyse von Blutungen und Entzündungen ermöglicht. Das Modell der Stich-SHT-Maus bietet den Vorteil, dass es ohne spezielle Ausrüstung durchgeführt werden kann.

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Bewertung des Zusammenbruchs der Blut-Hirn-Schranke in einem Mausmodell für ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma

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