Point-of-Care CRISPR-basierte Diagnostik mit vorgemischten und gefriergetrockneten Reagenzien
16. August 2024
Hier stellen wir die Schritt-für-Schritt-Vorbereitung von vorgemischten, lyophilisierten rekombinasebasierten isothermen Amplifikationen und Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-basierten Reaktionen vor, die für den Nachweis von Nukleinsäure-Biomarkern von Krankheitserregern oder anderen genetischen Markern von Interesse verwendet werden können.
Wir entwickeln Point-of-Care-Tests zum Nachweis dieses Materials von Infektionskrankheiten. Dieser Test verwendet isotherme Nukleinsäureamplifikation und CRISPR-basierte Detektion. Mit einer hochosmotischen Genauigkeit, ähnlich wie bei der PCR, können sie kleine Sequenzunterschiede einschließlich Einzelnukleotidpolymorphismen nachweisen und können Vielfache sein.
CRISPR, die osmotischen Reaktionen, bestehen aus mehreren Komponenten und Schritten und sind am Point-of-Care nur schwer durchzuführen. Da die Osmotika auf CRISPR basieren und hochempfindlich sind, besteht die Gefahr einer Verschleppungskontamination, die zu falschen Ergebnissen führen kann. Glücklicherweise kann dieses Problem gemildert werden, wenn wir die Abläufe der Reaktionen vereinfachen.
Wir bieten eine einfach zu bedienende Methode zum Nachweis unserer Krankheitserreger und genetischen Marker mittels Rekombinase, isothermer Amplifikation und CRISPR-basierter Reagenzien. Diese Reagenzien sind einfach zu lagern und zu verwenden. Wir bieten auch Tipps zur Behebung häufiger Probleme bei der Verwendung dieser Methoden und Reagenzien, um ihnen die Verwendung zu erleichtern.
Das Protokoll verwendet hier CRISPR-Reagenzien, die den Transport und die Lagerung erleichtern. Die gefriergetrockneten Reagenzien können an den Einsatzorten leicht rehydriert werden und behalten eine hohe Amplifikations- und Nachweiseffizienz bei. Wir hoffen, CRISPR-Diagnosetechnologien zur Erkennung endemischer und neu auftretender Infektionskrankheiten einsetzen zu können.
Wenn dieser Test routinemäßig und korrekt am Point-of-Care durchgeführt werden kann, könnte dies über antivirale und antibiotische Behandlungsoptionen informieren, möglicherweise Leben retten, den übermäßigen Gebrauch von Medikamenten und die Entwicklung von Resistenzen reduzieren.
Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Entwicklung von Point-of-Care-Tests vorgestellt, die die isothermale Nukleinsäureamplifikation und die CRISPR-basierte Detektion zur Identifizierung genetischer Materialien von Infektionskrankheiten nutzen. Der Ansatz zielt darauf ab, die Empfindlichkeit und Genauigkeit zu verbessern und gleichzeitig Herausforderungen wie Kontaminationsrisiken zu bewältigen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Infektionsdiagnostik
- Verfahren zur Amplifikation nucleinsäurebasierter Materialien
- CRISPR-Technologie
Hintergrund
- Die Testung am Versorgungsort ist entscheidend für die schnelle Diagnose von Infektionskrankheiten.
- Die isotherme Amplifikation ermöglicht einen effizienten Nachweis von Nukleinsäuren.
- Die CRISPR-Technologie bietet eine hohe Empfindlichkeit für die Identifizierung von genetischem Material.
- Kontaminationsrisiken können zu falschen Ergebnissen bei empfindlichen Assays führen.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines vereinfachten Verfahrens für CRISPR-basierte Reaktionen.
- Verbesserung der Genauigkeit bei der Detektion kleiner genetischer Variationen.
- Reduzierung der Kontaminationsrisiken in Point-of-Care-Anwendungen.
Verwendete Methoden
- Herstellung von vorgemischten, lyophilisierten Reagenzien für die isothermale Amplifikation.
- Durchführung von CRISPR-basierten Nachweisverfahren.
- Bewertung der Empfindlichkeit und Spezifität beim Nachweis nukleinsäurebasierter Biomarker.
- Optimierung der Reaktionsbedingungen zur Verringerung von Kontaminationsrisiken.
Hauptergebnisse
- Die entwickelte Methode zeigte eine hohe Empfindlichkeit bei der Detektion genetischer Marker.
- Das Kontaminationsrisiko wurde durch die Vereinfachung des Verfahrens signifikant verringert.
- Die Ergebnisse waren mit denen herkömmlicher PCR-Methoden vergleichbar.
- Der Ansatz eignet sich für Point-of-Care-Anwendungen.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie stellt eine brauchbare Methode für den schnellen Nachweis von Krankheitserregern bei Infektionen vor.
- CRISPR-basierte Tests können effektiv vereinfacht werden, um praktische Anwendung zu ermöglichen.
- Zukünftige Arbeiten könnten darauf abzielen, die Robustheit der Tests weiter zu verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Vorgemischte und gefriertrocknete, auf CRISPR basierende diagnostische Reagenzien ermöglichen eine schnelle und genaue Detektion genetischer Marker von Infektionskrankheiten direkt am Versorgungsort und beheben betriebliche Engpässe bei dezentralisierten Tests. Dieser Ansatz verringert den manuellen Handhabungsaufwand und das Kontaminationsrisiko und unterstützt einen skalierbaren Einsatz in ressourcenarmen und feldbasierten Umgebungen. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit für einen frühzeitigen therapeutischen Eingriff und ermöglicht zeitnahe therapeutische Entscheidungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die schnelle Untersuchung genetischer Marker von Pathogenen zur Zielvalidierung in der Infektionsforschung.
- Unterstützt die biologische Entschärfung von Risiken durch hochsensible Detektion einzelner Nukleotid-Polymorphismen.
- Erleichtert die Portfolio-Priorisierung, indem eng verwandte Pathogenstämme voneinander unterschieden werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert gebrauchsfertige, validierte Reagenssysteme für optimierte Assay-Entwicklungsabläufe.
- Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung von Assays durch vorgemischte, lyophilisierte Formate.
- Ermöglicht die skalierbare Untersuchung klinischer oder umweltbezogener Proben mit minimalem apparativem Aufwand.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Detektion krankheitsrelevanter Nukleinsäuresignaturen und ist somit kompatibel mit translationalen Biomarker-Strategien.
- Unterstützt die kontinuierliche Entwicklung von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem robuste, vor Ort einsetzbare Diagnostika bereitgestellt werden.
- Verringert das Risiko beim Voranbringen von diagnostischen Kandidaten, indem Stabilität und Effizienz der Reagenzien nachgewiesen werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert den gesamten Prozess von der frühen Entdeckung bis zur translationellen Forschung und unterstützt Arbeitsabläufe von der Zielidentifizierung bis zur präklinischen Validierung diagnostischer Plattformen.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht den zuverlässigen Nachweis genetischer Zielstrukturen für Hypothesentests und mechanistische Untersuchungen.
- Screening: Bietet standardisierte, quantitative Ergebnisse zum Vergleich von Probenbedingungen und Assay-Leistungen.
- Analytik: Ermöglicht empfindliche, fluoreszenzbasierte Messungen für eine robuste Datenanalyse und Entscheidungsunterstützung.
- Translationale Forschung: Verbindet Labor- und Feldanwendungen und unterstützt die entwicklung biomarkerbasierter Diagnostika.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Reagenzplattform, die an unterschiedliche Pathogenziele und Probentypen angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert Mehrdeutigkeiten bei der Pathogendetektion.
- Operationaler Wert: Vereinfacht Arbeitsabläufe, verbessert die Reproduzierbarkeit und unterstützt eine kühlschrankunabhängige Logistik.
- Strategischer Wert: Beschleunigt die Entscheidung über die Weiterentwicklung diagnostischer Kandidaten und reduziert das Risiko in späteren Entwicklungsphasen.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung diagnostischer Ressourcen für neu auftretende und endemische Krankheiten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Nukleinsäureamplifikation und im Design von CRISPR-basierten Assays.
- Benötigt Zugang zu Lyophilisationsgeräten und Fluoreszenz-Mikroplattenlesegeräten für die vollständige Durchführung des Workflows.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise bei der Reagenzherstellung und -handhabung über mehrere Teams hinweg.
- An verschiedene Probenarten anpassbar, erfordert jedoch möglicherweise eine Optimierung für spezifische Erreger.
- Stabilität und Effizienz wurden für mindestens acht Monate bei -20 °C validiert, was einen langfristigen Einsatz ermöglicht.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:19
Preparation of Lyophilized Reverse Transcriptase‐Recombinase Polymerase Amplification (RT‐RPA) Reactions
5:02
Preparation of Lyophilized CRISPR‐Cas13a Premixed Detection Reagents for Nucleic Acid Biomarkers Detection
7:45
RT‐RPA Nucleic Acid Amplification and CRISPR‐Cas13 Nucleic Acid Detection
