Name: Point-of-Care CRISPR-basierte Diagnostik mit vorgemischten und gefriergetrockneten Reagenzien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T12:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Erfahren Sie eine CRISPR-basierte Point-of-Care-Diagnostikmethode mit gefriergetrockneten Reagenzien zur schnellen Erkennung von Krankheitserregern. Diese Technik minimiert Kontaminationsrisiken und ermöglicht präzise Ergebnisse vor Ort.

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<meta charset="utf8"></head><body>Optimiertes CRISPR-basiertes molekulares Diagnoseprotokoll für den Point-of-Care-Einsatz

<ol><li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+detection+with+CRISPR-Cas13a%2FC2c2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2.</a> Science. 356 (6336), 438-442 (2017).</li>
<li>Kaminski, M. M., Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S., Zhang, F., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based diagnostics.</a> Nat Biomed Eng. 5 (7), 643-656 (2021).</li>
<li>Makarova, K. S., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annotation+and+classification+of+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Annotation and classification of CRISPR-Cas systems.</a> Methods Mol Biol. (1311), 47-75 (2015).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li>
<li>Arizti-Sanz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+Cas13-based+assays+for+the+fast+identification+of+SARS-CoV-2+and+its+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Simplified Cas13-based assays for the fast identification of SARS-CoV-2 and its variants.</a> Nat Biomed Eng. 6 (8), 932-943 (2022).</li>
<li>Broughton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12-based+detection+of+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2.</a> Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).</li>
<li>Patchsung, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplexed+Cas13-based+assay+with+point-of-care+attributes+for+simultaneous+COVID-19+diagnosis+and+variant+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+J%22%5BJournal%5D)">A multiplexed Cas13-based assay with point-of-care attributes for simultaneous COVID-19 diagnosis and variant surveillance.</a> CRISPR J. 6 (2), 99-115 (2023).</li>
<li>Patchsung, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+validation+of+a+Cas13-based+assay+for+the+detection+of+SARS-CoV-2+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Clinical validation of a Cas13-based assay for the detection of SARS-CoV-2 RNA.</a> Nat Biomed Eng. 4 (12), 1140-1149 (2020).</li>
<li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+and+portable+nucleic+acid+detection+platform+with+Cas13%2C+Cas12a%2C+and+Csm6%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6.</a> Science. 360 (6387), 439-444 (2018).</li>
<li>Lee, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+CRISPR-based+diagnostic+for+field-applicable+detection+of+Plasmodium+species+in+symptomatic+and+asymptomatic+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive CRISPR-based diagnostic for field-applicable detection of Plasmodium species in symptomatic and asymptomatic malaria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (41), 25722-25731 (2020).</li>
<li>Myhrvold, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-deployable+viral+diagnostics+using+CRISPR-Cas13%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13.</a> Science. 360 (6387), 444-448 (2018).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+detection+with+CRISPR%2FCas+system+from+applications+to+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Analyt+Chem%22%5BJournal%5D)">Versatile detection with CRISPR/Cas system from applications to challenges.</a> Trends Analyt Chem. 135, 116150(2021).</li>
<li>Yao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas13a-based+detection+for+bovine+viral+diarrhea+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas13a-based detection for bovine viral diarrhea virus.</a> Front Vet Sci. 8, 603919(2021).</li>
<li>Kellner, M. J., Koob, J. G., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHERLOCK%3A+nucleic+acid+detection+with+CRISPR+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases.</a> Nat Protoc. 14 (10), 2986-3012 (2019).</li>
<li>Selvam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RT-LAMP+CRISPR-Cas12%2F13-based+SARS-CoV-2+detection+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">RT-LAMP CRISPR-Cas12/13-based SARS-CoV-2 detection methods.</a> Diagnostics (Basel). 11 (9), 1646(2021).</li>
<li>Carter, C., Akrami, K., Hall, D., Smith, D., Aronoff-Spencer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilized+visually+readable+loop-mediated+isothermal+reverse+transcriptase+nucleic+acid+amplification+test+for+detection+Ebola+Zaire+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Lyophilized visually readable loop-mediated isothermal reverse transcriptase nucleic acid amplification test for detection Ebola Zaire RNA.</a> J Virol Methods. 244, 32-38 (2017).</li>
<li>Bhardwaj, P., Kant, R., Behera, S. P., Dwivedi, G. R., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+diagnostic+with+CRISPR%2FCas%3A+Beyond+nucleic+acid+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Next-generation diagnostic with CRISPR/Cas: Beyond nucleic acid detection.</a> Int J Mol Sci. 23 (11), 6052(2022).</li>
<li>Twistamp. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Twistamp%C2%AE+assay+design+manual%22">Twistamp® assay design manual</a>. , (2023).</li>
<li>Qian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+isothermal+amplification+assay+for+viral+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">An enhanced isothermal amplification assay for viral detection.</a> Nat Commun. 11 (1), 5920(2020).</li>
<li>Ghouneimy, A., Mahas, A., Marsic, T., Aman, R., Mahfouz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+diagnostics%3A+Challenges+and+toward+point-of-care+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACSSynth+Biol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based diagnostics: Challenges and toward point-of-care applications.</a> ACSSynth Biol. 12 (1), 1-16 (2023).</li>
<li>Jones, K. L., Drane, D., Gowans, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+storage+of+DNA-free+RNA+for+use+in+vaccine+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Long-term storage of DNA-free RNA for use in vaccine studies.</a> Biotechniques. 43 (5), 675-681 (2007).</li>
<li>Fang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+strand-displacement+DNA+amplification+by+a+contactless+electrochemical+microsystem+using+interdigitated+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of strand-displacement DNA amplification by a contactless electrochemical microsystem using interdigitated electrodes.</a> Lab Chip. 12 (17), 3190-3196 (2012).</li>
<li>Mok, E., Wee, E., Wang, Y., Trau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+evaluation+of+molecular+enhancers+of+the+isothermal+exponential+amplification+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Comprehensive evaluation of molecular enhancers of the isothermal exponential amplification reaction.</a> Sci Rep. 6 (1), 37837(2016).</li>
<li>Wan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+test+kit+for+visual+loop-mediated+isothermal+amplification+of+Salmonella+in+spiked+ready-to-eat+fruits+and+vegetables%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a test kit for visual loop-mediated isothermal amplification of Salmonella in spiked ready-to-eat fruits and vegetables.</a> J Microbiol Methods. 169, 105830(2020).</li>
<li>Curti, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+lyophilized+CRISPR-Cas12+assay+for+a+ensitive%2C+specific%2C+and+rapid+detection+of+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a lyophilized CRISPR-Cas12 assay for a ensitive, specific, and rapid detection of SARS-CoV-2.</a> Viruses. 13 (3), 420(2021).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+SARS-CoV-2+with+SHERLOCK+one-pot+testing%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK one-pot testing.</a> N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).</li>
</ol>

CRISPR-basierte Diagnostika zum Nachweis von Nukleinsäure-Biomarkern wurden erstmals im Jahr 2017 berichtet 1,2,3,4 und haben sich seitdem in mehreren Ländern in mehreren Ländern als Diagnostika der nächsten Generation mit von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen Tests bewährt, insbesondere für den Nachweis von RNA des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) 5,6,7,8 . Über die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) hinaus haben sich die Technologien als wirksam für den Nachweis verschiedener Viren und Bakterien 9,10,11,12,13, genetischer Krankheitsmutationen und Deletionen erwiesen und können zum Nachweis von Protein- und niedermolekularen Biomarkern entwickelt werden 2,12. CRISPR-basierte Diagnostika kombinieren häufig isotherme Amplifikationsmethoden wie die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) oder die schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP)14,15 mit der CRISPR-basierten Detektion unter Verwendung von RNA-gesteuerten CRISPR-assoziierten (Cas) Enzymen mit "kollateraler" Endonuklease-Aktivität nach Zielerkennung3. Die doppelte Verwendung von isothermer Amplifikation und CRISPR-basierter Detektion verleiht den Technologien mehrere wünschenswerte Eigenschaften, insbesondere eine hohe diagnostische Genauigkeit, die sich der der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) als Goldstandard annähert, und die Fähigkeit, kleine Sequenzunterschiede, einschließlich Einzelnukleotid-Polymorphismen, zu multiplexen und zu detektieren 1,9.
Die genauesten Versionen der CRISPR-basierten Diagnostik enthalten jedoch mehrere Komponenten und Schritte und können mit Laien oder am Point-of-Care (POC) kompliziert durchzuführen sein. Um dieser Herausforderung zu begegnen, den Einsatz hochpräziser CRISPR-basierter Diagnostik auf POC-Umgebungen auszuweiten, haben wir Protokolle zur Herstellung von vorgemischten, lyophilisierten, rekombinasebasierten isothermen Amplifikations- und CRISPR-basierten Nachweisreaktionen entwickelt, die einfach zu verwenden und zu lagern sind7. Diese Protokolle sollten bestehende ausgezeichnete Protokolle zur CRISPR-basierten Diagnostik14 ergänzen, die zusätzliche Informationen über die Herstellung biochemischer Komponenten, die für die CRISPR-basierte Diagnostik benötigt werden7, Designrichtlinien1 und Formulierungen unter Verwendung alternativer isothermer Amplifikationstechniken 2,14,15,16 und Cas-Enzyme12 enthalten. Letztendlich hoffen wir, dass die CRISPR-basierte Diagnostik dazu beitragen kann, einen schnellen, kostengünstigen und sensitiven Nukleiniknachweis in Umgebungen zu realisieren, in denen tragbare und instrumentenfreie Analysen erforderlich sind 1,9,17.
Wir verwenden in unseren Protokollen hauptsächlich die Kombination aus RPA- und Cas13-basierter Detektion. RPA funktioniert bei Umgebungstemperaturen (37-42 °C) und hat daher einen geringen Energie- und Gerätebedarf. Andere isotherme Amplifikationsreaktionen erfordern höhere Temperaturen (LAMP, 60-65 °C; Strang-Verschiebungs-Amplifikation (SDA), 60 °C; exponentielle Amplifikationsreaktion (EXPAR), 55 °C; und helikaseabhängige Amplifikation (HDA), 65 °C)2. Das Design von RPA-Primern ist im Gegensatz zu LAMP-Primern ebenfalls nicht komplex und kann auf Multiplex-Amplifikation erweitert werden 7,9,14. Auch wenn das Multiplexen über zwei Ziele mit RPA in der Praxis schwierig ist, gibt es klare Richtlinien für die Gestaltung von Multiplex-RPA-Primern, um Interferenzen zu minimieren18.
Während Verschleppungskontaminationen im zweistufigen Arbeitsablauf ein großes Problem bleiben, sind die generierten Amplikons von RPA klein und verursachen im Vergleich zu großen konkatemerischen Amplikons aus LAMP14 weniger wahrscheinlich eine Verschleppungskontamination. RPA-Primer können nach den Standardrichtlinien14 ausgelegt werden: Sie sind in der Regel 25-35 Nukleotide lang und haben Schmelztemperaturen von 54 bis 67 °C. Die Amplikongröße sollte kleiner als 200 Basenpaare sein. Das reverse Transkriptase-Enzym (RT) kann zu RPA hinzugefügt werden, um die Amplifikation aus RNA zu ermöglichen, und bei der reversen Transkriptions-RPA (RT-RPA) wird ein weiteres Enzym, Ribonuklease H (RNase H), typischerweise in kleinen Mengen hinzugefügt, um die Auflösung des resultierenden RNA-DNA-Hybrids zu unterstützen und die Amplifikationsreaktion zu fördern 5,19. Um die T7-Transkription für den Cas13-basierten Nachweis zu ermöglichen, kann der T7-RNA-Polymerase-Promotor am 5'-Ende des vorderen RPA-Primers platziert werden.
Nachdem Amplikons aus RPA erzeugt wurden, können sie mit crRNA-programmierten Cas-Enzymen nachgewiesen werden. Unter den verschiedenen Cas-Enzymen, die für die Amplikondetektion verwendet werden können, bevorzugen wir RNA-targetende Cas13-Varianten aufgrund ihrer hohen Spaltungsaktivität1 und gut charakterisierten Polynukleotid-Spaltpräferenzen 7,9, von denen letztere für die Multiplexdetektion verwendet werden können. Die crRNA-Sequenz für Cas13 ist so konzipiert, dass sie komplementär (reverse komplementär) zur Zielstelle in der produzierten RNA mit Spacer- und Direct Repeat (DR)-Sequenzen ist. Die crRNA-Sequenz und die RPA-Primer sollten sich nicht überlappen, um einen unerwünschten Cas-basierten Nachweis von Off-Target-Amplifikationsprodukten zu vermeiden, der die Hintergrund- und Falsch-Positiv-Ergebnisse erhöht14.
Der Cas-basierte Nachweis beruht auf verschiedenen Nachweismodalitäten, um die Spaltung von Reporter-Nukleinsäuremolekülen (RNA-Reporter für Cas13-basierte Reaktionen) zu überwachen1,2,14. Zu den verschiedenen Detektionsmodalitäten gehören Kolorimetrie, elektrochemische Auslesungen, Fluoreszenz, Sequenzieranzeigen und Lateral-Flow-Strips2. Wir konzentrieren uns auf die Fluoreszenzauslesung bei einer Vielzahl von Fluorophoren und Reportern wie Cyanin 5 (Cy5), Rhodamin X (ROX) und Carboxyfluorescein (FAM), die mit einer einzigen blauen LED-Lichtquelle effektiv angeregt werden können, und deren Fluoreszenz mit einem Mikroplatten-Reader oder einem Echtzeit-Thermocycler analysiert wird 7,14. Darüber hinaus ist die Fluoreszenzauslesung einfach einzurichten und ermöglicht eine kontinuierliche Überwachung, die eine Quantifizierung in Echtzeit ermöglicht. Die Multiplex-RPA-Präamplifikation und die Multiplex-Cas13-basierte Detektion unter Verwendung von Cas-Enzymen können mit mehrfarbigen Fluoreszenzauslesungen für den gleichzeitigen Nachweis mehrerer genetischer Ziele kombiniert werden 2,7.
In unseren Protokollen amplifizieren wir zunächst RNA isotherm mit RT-RPA, indem wir die RNA-Probe zur lyophilisierten Form des RT-RPA-Reagenzes hinzufügen (Abbildung 1). Während der RT-RPA wird der T7-Promotor an das erzeugte doppelsträngige DNA-Amplikon angehängt. Danach werden die RPA-Produkte auf den lyophilisierten Cas13-basierten Nachweis übertragen, der auch die T7-RNA-Polymerase enthält. Diese Nachweisreaktion wandelt DNA-Amplikons in RNA um (über die T7-RNA-Polymerase), die mit crRNA-programmiertem Cas13 leicht nachgewiesen werden kann. Target-aktiviertes Cas13 spaltet Reportermoleküle, um ein nachweisbares Fluoreszenzsignal zu erzeugen 2,7,14. Während sich die Protokolle hier auf den Nachweis durch Leptotrichia wadei (LwaCas13a) beziehen, können sie auf den gleichzeitigen, multiplexierten Nachweis von bis zu vier Zielen unter Verwendung orthogonaler Cas13- und Cas12-Enzyme erweitert werden 7,9. RPA- und Cas-basierte Nachweisreaktionen können ebenfalls in einem einzigen Röhrchen kombiniert werden, wenn auch mit einem Verlust an Empfindlichkeit14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig01v2.jpg"> Abbildung 1: Arbeitsablauf bei der CRISPR-basierten Detektion. Der Workflow veranschaulicht den Nachweis von zwei Zielgenen. Zunächst werden interessante Regionen innerhalb des DNA-Ziels mit RPA isotherm amplifiziert; Die Reaktion kann mit reverser Transkription (RT-RPA) beim Nachweis von RNA-Zielen durchgeführt werden. Danach wandelt die T7-Transkription dsDNA-Amplikons in RNAs um, die wiederum von Cas13-crRNA-Komplexen erkannt werden, die in der Lage sind, kollaterale RNase-Aktivität bei der Zielbindung auszulösen. Die Spaltung von abgeschreckten Fluoreszenzreportern erzeugt Fluoreszenzsignale, die mit einem Mikroplatten-Reader überwacht, durch einen LED-Transilluminator visualisiert oder mit einem Echtzeit-Thermocycler verwendet werden können. Abkürzungen: CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; RT = reverse Transkription; RPA = Rekombinase-Polymerase-Amplifikation; Cas = CRISPR-assoziiertes Protein; LED = Leuchtdiode. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig01largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die Hauptmerkmale der hier vorgestellten Protokolle sind die Vormischformulierungen für die Lyophilisation. Das Vormischen vereinfacht die Anwendung der Reaktion und verbessert die Reproduzierbarkeit, aber viele Komponenten der RPA- und Cas-basierten Detektion, insbesondere die reverse Transkription und einige labile Cofaktoren wie ATP, sind in Lösung nicht stabil. Daher formulieren wir die vorgemischten Lösungen so, dass sie für die Langzeitlagerung und den einfachen Transport und Einsatz gefriergetrocknet werden können 1,9,20. Vorgemischte, gefriergetrocknete Reagenzien tragen ebenfalls zur Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit bei, da ein höheres Probenvolumen (und damit ein höherer DNA/RNA-Input) hinzugefügt werden kann, um die Reaktion zu rekonstituieren10. In unseren Formulierungen verwenden wir hauptsächlich Trehalose21 als Kryoprotektivum in lyophilisierten RPA- und Cas-basierten Nachweisreaktionen7. Neben der Konservierung der Reagenzien fördert Trehalose auch die Reaktionen durch Erhöhung der Enzymstabilisierung 16,22,23,24 und Senkung der Schmelztemperaturen von dsDNA23. Die Erforschung anderer Stabilisatoren 5,7,21,25,26 über Trehalose hinaus kann zu noch optimaleren Formulierungen für verschiedene Anwendungsszenarien führen.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betain-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300-1VL</td><td></td></tr><tr><td>DEPC-behandeltes Wasser</td><td>Invitrogen</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Merck</td><td>3870-25GM</td><td></td></tr><tr><td>EpiScript reverse Transkriptase</td><td>Lucigen</td><td>ERT12925K</td><td></td></tr><tr><td>Gly-Gly-Gly& nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIA-50239-1G</td><td></td></tr><tr><td>LwaCas13a</td><td>Eigenproduktion</td><td></td><td>Name des Stammes:Leptotrichia wadei, Abkürzung: Lwa, Proteinname: LwaCas13a</td></tr><tr><td>Magnesiumchloridlösung, 1M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>NxGenT7 RNA-Polymerase</td><td>Lucigen</td><td>30223-2</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ethylenglykol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81300-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumacetatlösung, 5M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95843-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Riobnukleotid-Lösungsmischung</td><td>NEB</td><td>N0466L</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>NEB</td><td>M0297L</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td></td><td>TCI TCI-S0111-500G</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose-Dihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIA-90210-50G</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-Hydrochlorid-Lösung, 1M, pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2194-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TwistAmp Basic Kit</td><td>TwistDx</td><td>TABAS03KIT</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BluPAD Dual LED Blau/Weiß Lichtdurchleuchter</td><td>Bio-Helix</td><td>BP001CU</td><td></td></tr><tr><td>Trockenbad Dual Block</td><td>ELITE</td><td>4-2-EL-02-220</td><td>Modell: EL-02</td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Mikroplatte Lesegerät</td><td>Tecan</td><td>30050303</td><td>Modell: Infinite 200 Pro</td></tr><tr><td>Gefriertrockner</td><td>LABCONCO</td><td>794001030</td><td>FreeZone Triad Tisch-Gefriertrockner</td></tr><tr><td>Mikroplatte 384-well</td><td>Greiner</td><td>GDE0784076</td><td>F-Bottom, kleines Volumen, Hibase, Med. Binding, Schwarz</td></tr><tr><td>Echtzeit-Thermocycler (CFX Connect Real-Time PCR System)</td><td>Bio-Rad</td><td>185-5201</td><td>Modell: CFX Connect Optics Module</td></tr><tr><td>Oligonukleotid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>s-Gen Forward RPA Primer</td><td>IDT</td><td></td><td>GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA</td></tr><tr><td>s-Gene reverse RPA Primer</td><td>IDT</td><td></td><td>TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG</td></tr><tr><td>n-Gen Forward RPA Primer</td><td>IDT</td><td></td><td>GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG</td></tr><tr><td>n-Gen reverse RPA Primer</td><td>IDT</td><td></td><td>CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC</td></tr><tr><td>LwaCas13a-crRNA für das s-Gen</td><td>Synthego</td><td></td><td>GAUUUAGACUACCAAAAAC GAAGGGGACUAAAACGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG</td></tr><tr><td>LwaCas13a-crRNA für das n-Gen</td><td>Synthego</td><td></td><td>GAUUUAGACUACCAAAAACG AAGGGGACUAAAACAAAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC</td></tr><tr><td>FAM-polyU-IABkFQ Reporter</td><td>IDT</td><td></td><td>56-FAM/rUrUrUrU/3IABkFQ</td></tr><tr><td>O-hannah_cytb_F RPA Primer</td><td>IDT</td><td></td><td>GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG</td></tr><tr><td>O-hannah_cytb_R RPA Primer</td><td>IDT</td><td></td><td>AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA</td></tr><tr><td>synT7crRNA13a_ O_hannah&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC</td></tr></tbody></table>

point-of-care crispr-basierte diagnostik mit vorgemischten und gefriergetrockneten reagenzien

Point-of-care CRISPR-based Diagnostics with Premixed and Freeze-dried Reagents

Wir beleuchten die Kinetik der FAM-Fluoreszenzsignalerzeugung aus dem kombinierten Nachweis von s - und n-Genen von SARS-CoV-2 und wie die Informationen verwendet wurden, um optimale Bedingungen für lyophilisierte, vorgemischte Reaktionsformulierungen zu bestimmen. In allen Fällen schlossen wir Proben mit Ct-Werten ein, die deutlich innerhalb der ermittelten Nachweisgrenze (LoD) (Ct ~31-33) lagen, sowie Proben mit Ct an der LoD (Ct ~35-37)7, um eine bessere Differenzierung von Protokollen zu ermöglichen.
Für lyophilisiertes, vorgemischtes RT-RPA fanden wir, dass der Einschluss von KOAc in die vorgemischte Reaktion die Reaktionssensitivität negativ beeinflusste (Abbildung 2A). Wir haben daher KOAc aus der vorgemischten Reaktion weggelassen und es mit dem Reaktionsinitiator Mg(OAc)2 hinzugefügt, nachdem die RNA-Probe hinzugefügt worden war. Wir verwendeten auch ähnliche Assays, um die optimale Konzentration eines Kryoprotektivums Trehalose (Abbildung 2B) und die Auswirkungen von Triglycin7 in der lyophilisierten RT-RPA-Reaktion (Abbildung 2C) zu bestimmen. Daher wurden optimale lyophilisierte, vorgemischte RT-RPA-Reaktionen mit 6 % Trehalose, ohne KOAc (wurde jedoch später nach der RNA-Probe hinzugefügt) hergestellt und mit Triglycin ergänzt, wie in Protokollabschnitt 1 beschrieben.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig02.jpg"> Abbildung 2: Optimierung lyophilisierter, vorgemischter RT-RPA-Reaktionen. Die RT-RPA-Reaktion wurde unter Verwendung von Primern hergestellt, die auf das n-Gen von SAR-CoV-2 abzielen. Mg(OAc)2 wurde von allen vorgemischten Reaktionen ausgeschlossen. Die Wirkungen von (A) KOAc, (B) Trehalose und (C) Triglycin, die den vorgemischten Reaktionen zugesetzt wurden, wurden untersucht. Die Reaktionsüberwachung mittels generierter FAM-Fluoreszenz erfolgte mit einem Echtzeit-Thermocycler oder einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader. Es werden einzelne Daten aus dreifachen Messungen angezeigt. Abkürzungen: RT = reverse Transkription; RPA = Rekombinase-Polymerase-Amplifikation; CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; Cas = CRISPR-assoziiertes Protein; SAR-CoV-2 = Schweres akutes respiratorisches Syndrom Coronavirus 2; Ct = Zyklusschwelle; FAM = Carboxyfluorescein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Bei lyophilisierten, vorgemischten Cas13a-basierten Reaktionen überprüften wir, wie wichtig es ist, das richtige Kryoprotektivum zu haben: Entweder 6 % Trehalose oder 2 % Saccharose19 wirkten gut, während eine niedrigere Saccharose bei 1 % oder 5 % w/v PEG20000 die Reaktionseffizienz nach der Lyophilisierung nicht beibehielt (Abbildung 3). MgCl2 wurde bei allen Reaktionen weggelassen und im Rehydratisierungsschritt hinzugefügt. Die optimale lyophilisierte Cas13-basierte Nachweisreaktion wurde mit 6 % Trehalose hergestellt, wie in Protokollabschnitt 2 gezeigt.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig03.jpg"> Abbildung 3: Optimierung lyophilisierter, vorgemischter Cas13-basierter Nachweisreaktionen. Die Nachweisreaktion wurde bei 37 °C mit dem RPA-Produkt aus dem SARS-CoV-2 n-Gen durchgeführt. Die Tests wurden vor und nach der Lyophilisierung durchgeführt. MgCl2 wurde von allen vorgemischten Reaktionen ausgeschlossen. Die Fähigkeiten von (A) Trehalose, (B) PEG20000 und (C) Saccharose bei der Aufrechterhaltung der Reaktionseffizienz nach der Lyophilisierung wurden untersucht. Die Reaktionsüberwachung über die erzeugte FAM-Fluoreszenz wurde mit einem Echtzeit-Thermocycler durchgeführt. Es werden einzelne Daten aus dreifachen Messungen für die Bedingungen "nach der Lyophilisierung" und ein Replikat aus den Bedingungen "vor der Lyophilisierung" gezeigt. Abbildung 3A,B stammt aus Patchsung et al.7. Abkürzungen: RPA = Rekombinase-Polymerase-Amplifikation; SAR-CoV-2 = schweres akutes respiratorisches Syndrom Coronavirus 2; FAM = Carboxyfluorescein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die lyophilisierten, vorgemischten Reagenzien für RT-RPA- und Cas13-basierte Reaktionen sind bei -20 °C für mindestens 8 Monate stabil [Abbildung 4].
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig06.jpg"> Abbildung 4: Stabilitätstests von lyophilisierten, vorgemischten RPA- und CRISPR-Cas13a-Reagenzien bei -20 °C. Stabilitätstest nach (A) 30 Tagen, (B) 45 Tagen, (C) 3 Monaten, (D) 5 Monaten, (E) 8 Monaten. Es werden einzelne Daten aus dreifachen Messungen angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die LoD von lyophilisierten RT-RPA- und Cas13-basierten Reaktionen zum Nachweis von s - und n-Genen von SARS-CoV-2 ist in Abbildung 5 dargestellt. Die Kinetik der Signalerzeugung kann durch den Nachweis dualer Gene im Vergleich zum Nachweis nur eines Gens verbessert werden.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig04.jpg"> Abbildung 5: Analytische Sensitivität des Einzelgen- vs. des Dual-Gen-Nachweises. (A) Der LoD von lyophilisiertem Singleplex-RT-RPA und Cas-basierter Nachweis, der auf das s-Gen von SAR-CoV-2 abzielt. (B) Die LoD von lyophilisiertem Singleplex-RT-RPA und Cas-basierter Nachweis, der auf das n-Gen von SAR-CoV-2 abzielt. (C) Die LoD von lyophilisiertem Multiplex, RT-RPA und dualer Cas-basierter Nachweis , der auf die s- und n-Gene abzielt. Die LoD wurde mit seriell verdünnten SARS-CoV-2-RNAs bestimmt, derenC-t-Werte mit einem RT-qPCR-Assay bestimmt wurden, der auf das n-Gen abzielte. Es werden Einzeldaten von 3-6 Wiederholungsmessungen angezeigt. Abkürzungen: LoD = Nachweisgrenze; RT = reverse Transkription; RPA = Rekombinase-Polymerase-Amplifikation; CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; Cas = CRISPR-assoziiertes Protein; SAR-CoV-2 = Schweres akutes respiratorisches Syndrom Coronavirus 2; Ct = Zyklusschwelle; qPCR = quantitative Polymerase-Kettenreaktion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Neben dem Virusnachweis präsentieren wir einen Prototyp eines POC-Genotypisierungswerkzeugs auf Basis der CRISPR-Diagnostik, um die Identifizierung von Giftschlangenarten zu unterstützen, die in Thailand endemisch sind (Abbildung 6). Eine schnellere und genaue Identifizierung von Schlangenarten durch DNA-Proben, die aus Bisswunden entnommen wurden, kann die sofortige Verabreichung von Gegengiften unterstützen und so die Überlebenschancen des Patienten verbessern. Wir untersuchten Regionen innerhalb des mitochondrialen Cytochrom b (cytb)-Gens von acht Schlangenarten, darunter Ophiophagus hannah (Königskobra) (Abbildung 6A) (Abbildung 6A) und zeigten, dass der Nachweis von synthetischen DNA-Surrogaten des O. hannah cytb-Gens die attomolare Sensitivität erreichen kann (Abbildung 6B,C).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig05.jpg"> Abbildung 6: Ein Prototyp für den CRISPR-basierten Nachweis zur Identifizierung von Schlangenarten anhand von Schlangenbissvergiftungen. (A) RPA-Primer und LwaCas13a crRNA-Design für den Nachweis des cytb-Gens von Ophiophagus hannah. Der T7-Promotor (T7-Überhang) wurde am 5'-Ende des vorderen RPA-Primers platziert. (B) Kinetik der FAM-Signalerzeugung über 60 min und (C) Endpunkt-FAM-Fluoreszenz aus LwaCas13a-vermittelter Detektion von synthetischen dsDNA-Inputs, die den cytb-Gensegmenten von O. hannah entsprechen. Es wurden unterschiedliche Eingangskonzentrationen (0, 10-9, 10-12, 10-15 und 10-18 M) verwendet. Die Daten sind mittlere ± s.d. aus dreifachen Messungen. Abkürzungen: RPA = Rekombinase-Polymerase-Amplifikation; CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; Cas = CRISPR-assoziiertes Protein; FAM = Carboxyfluorescein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="5">Lyophilisierung von CRISPR-Cas13a vorgemischten Nachweisreagenzien</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Schritt</td>
			<td>Rampen-Rate</td>
			<td>Regal-Temperatur</td>
			<td rowspan="2">Zeit (hh:mm)</td>
			<td>Vakuum</td>
		</tr><tr><td>(°C/min)</td>
			<td>(°C)</td>
			<td>(mbar)</td>
		</tr><tr><td>Einfrieren 1</td>
			<td>3</td>
			<td>-30</td>
			<td>aus</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Trocken 1</td>
			<td>3</td>
			<td>-30</td>
			<td>aus</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Trocken 2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>01:00</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Trocken 3</td>
			<td>3</td>
			<td>20</td>
			<td>∞</td>
			<td>0</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Lyophilisator-Einstellungen von vorgemischten RT-RPA- und CRISPR-Cas13a-Nachweisreagenzien. Abkürzungen: RT = reverse Transkription; RPA = Rekombinase-Polymerase-Amplifikation; CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; Cas = CRISPR-assoziiertes Protein.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Parameter</td>
			<td>Einstellung</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Temperatur</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Kinetischer Zyklus</td>
			<td>Dauer</td>
			<td>02:00 Uhr (mm:ss)</td>
		</tr><tr><td>Intervall-Zeit</td>
			<td>02:30 Uhr (mm:ss)</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Schütteln</td>
			<td>Dauer</td>
			<td>1 Sek.</td>
		</tr><tr><td>Modus</td>
			<td>Linear</td>
		</tr><tr><td>Amplitude</td>
			<td>1 mm</td>
		</tr><tr><td>Fluoreszenzintensität</td>
			<td>Wellenlänge der Anregung</td>
			<td>488 nm</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Emissionswellenlänge</td>
			<td>520 nm</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Modus</td>
			<td>Nach oben</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Z-Stellung</td>
			<td>24470</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Gewinnen</td>
			<td>71</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Integrationszeit</td>
			<td>20 μs</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Anzahl der Blitze</td>
			<td>25</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader-Programm für den Nukleinsäurenachweis.

Point-of-Care CRISPR-basierte Diagnostik mit vorgemischten und gefriergetrockneten Reagenzien

Molecular diagnostics by Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-based detection have high diagnostic accuracy and attributes ...

point-care-crispr-based-diagnostics-with-premixed-freeze-dried

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

ampliPHOX kolorimetrischen Nachweis Technologie wird als eine kostengünstige Alternative zu Fluoreszenzdetektion für Mikroarrays vorgestellt. Basierend auf Photopolymerisation, produziert ampliPHOX festen Polymer-Spots, die mit bloßem Auge in nur wenigen Minuten. Die Ergebnisse werden dann abgebildet und automatisch interpretiert mit einer einfachen, aber leistungsstarken Softwarepaket.

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Vor-Ort-DNA-Nachweis von Trypanosomatiden-Parasiten und Nosema ceranae durch alkalische Lyse gekoppelt mit RPA/CRISPR/Cas12a-System

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Point-of-Care CRISPR-basierte Diagnostik mit vorgemischten und gefriergetrockneten Reagenzien

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