Name: DNA-Extraktion und Vergleich zwischen alten und frischen nekrophilen Fliegenproben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Erfahren Sie eine kostengünstige DNA-Extraktionsmethode aus nekrophilen Fliegen mit einem modifizierten Bluttestkit. Vergleichen Sie DNA-Konzentrationen zwischen frischen und alten Proben für forensische und molekularbiologische Analysen.

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Diese Arbeit wird von der National Natural Science Foundation of China (82060341, 81560304) und von der Academician Innovation Platform Scientific Research Project der Provinz Hainan (YSPTZX202134) unterstützt.

HINWEIS: In diesem Protokoll wurden insgesamt fünf Proben von C. megacephala verwendet - drei frische Proben (Fresh 1, Fresh 2 und Fresh 3), eine Probe, die 2 Jahre lang in Alkohol gelagert wurde (Old 1) und eine Probe, die 2 Jahre lang in einer trockenen, versiegelten Lagerung gelagert wurde, die nur vor Licht geschützt war (Old 2). Die Proben müssen entsprechend den experimentellen Anforderungen gekennzeichnet werden.
1. Allgemeine Probenlagerung und -vorbereitung
<ol><li>Probenauswahl und -vorbereitung HINWEIS: Achten Sie darauf, im Abzug zu arbeiten, wenn Sie Ethylacetat auftragen, um nekrophage Fliegen zu exekutieren. Entfernen Sie die Flüssigkeit von der Oberfläche der Fliege, bevor Sie sie wiegen.<ol><li>Frische Proben: Legen Sie drei gesammelte Fliegenproben in Gasfläschchen, nachdem Sie sie mit Ethylacetat getötet haben. Wiegen und benennen Sie die Proben als Fresh 1, Fresh 2 und Fresh 3 und verwenden Sie sie sofort in Experimenten. HINWEIS: Die frischen Fliegenproben in diesem Protokoll wiesen Massen von 56,8 mg, 49,3 mg und 52,1 mg auf.</li>
		<li>Alte Probe 1: Fliegenproben, die durch Ethylacetat abgetötet und in mit Alkohol gefüllten Zentrifugenröhrchen 2 Jahre lang in luftdichtem Behälter und lichtgeschützt bei Raumtemperatur gelagert wurden, entnehmen. Wiegen Sie die Probe, nachdem Sie die Oberflächenflüssigkeit mit Filterpapier adsorbiert haben. nennen wir es Old 1. HINWEIS: Die Masse von Old 1 betrug in diesem Protokoll 42,3 mg.</li>
		<li>Alte Probe 2: Die durch Ethylacetat abgetötete Fliegenprobe herausnehmen und in einem Zentrifugenröhrchen 2 Jahre lang luftdicht verschlossen und lichtgeschützt bei Raumtemperatur lagern. Wiegen Sie und nennen Sie es Alt 2.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung vor der Extraktion<ol><li>Fügen Sie eine kleine Menge flüssigen Stickstoff hinzu, um einen Edelstahlbehälter zu kühlen. Warten Sie, bis der gesamte flüssige Stickstoff verdampft ist.</li>
		<li>Geben Sie eine Fliegenprobe in den Behälter; Gießen Sie den flüssigen Stickstoff langsam ein, um zu verhindern, dass der flüssige Stickstoff spritzt und die Insektenprobe beeinträchtigt.</li>
		<li>Frieren Sie die Proben in flüssigem Stickstoff ein. Entnehmen Sie Proben, nachdem der flüssige Stickstoff verdampft ist.</li>
		<li>Den Thorax einzeln abtrennen, in ein 2 mL Zentrifugenröhrchen geben und in möglichst kleine Scheiben schneiden. HINWEIS: Schneiden Sie die Probe in kleine Stücke, damit sie vollständig gespalten werden kann und die DNA in großen Mengen freigesetzt werden kann.</li>
		<li>Wiederholen Sie die obigen Schritte für jede Fliege, frieren Sie sie einzeln ein und nehmen Sie sie dann in ein neues Zentrifugenröhrchen, um eine DNA-Kreuzkontamination zu verhindern.</li>
	</ol></li>
</ol>2. DNA-Extraktion
HINWEIS: Alle Zentrifugationsschritte müssen bei Raumtemperatur (15-25 °C) in einer Mikrozentrifuge durchgeführt werden. Alle Schritte müssen unter strikter Einhaltung der Grundsätze der Asepsis und zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen durchgeführt werden.
<ol><li>Lyse von Gewebe<ol><li>Geben Sie 180 μl Gewebelysepuffer in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen, das eine abgeschnittene Probe enthält.</li>
		<li>20 μl Proteinase K zugeben. Durch Vortexen bei 3 000 U/min für 10 s gründlich mischen und bei 56 ΰC inkubieren, bis das Insektengewebe vollständig lysiert ist. HINWEIS: Fügen Sie mehr Proteinase K hinzu, wenn das Gewebe nicht vollständig verdaut wird. Die Lyse ist in der Regel in 1-3 Stunden abgeschlossen und kann die Lysezeit auch über Nacht verlängern.</li>
	</ol></li>
	<li>DNA-Präzipitation<ol><li>Vortex bei 3.000 U/min für 15 s. Geben Sie 200 μl Lysepuffer in die Probe und mischen Sie sie gründlich, indem Sie sie 15 s lang bei 3.000 U/min vortexen.</li>
		<li>200 μl Ethanol (96-100%) zugeben und erneut gründlich mischen, indem Sie bei 3.000 U/min 15 s lang vortexen. HINWEIS: Lysepuffer und Ethanol können in einem Schritt vorhinzugefügt werden, um Zeit zu sparen. Unter Zugabe von Lysepuffer und Ethanol kann sich ein weißer Niederschlag bilden.</li>
	</ol></li>
	<li>Pipettieren Sie die Mischung in die DNA-Adsorptionssäule, die in ein 2-ml-Sammelröhrchen gegeben wird. Bei 6.000 × g 1 min zentrifugieren. Durchfluss- und Auffangröhrchen entsorgen.</li>
	<li>Legen Sie die DNA-Adsorptionssäule aus dem vorherigen Schritt in ein neues 2-ml-Entnahmeröhrchen, fügen Sie 500 μl Proteinentfernungspuffer hinzu und zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei 6.000 × g . Durchfluss- und Auffangröhrchen entsorgen.</li>
	<li>Übertragen Sie die DNA-Adsorptionssäule in ein neues 2-ml-Entnahmeröhrchen, fügen Sie 500 μl Entsalzungspuffer hinzu und zentrifugieren Sie 3 Minuten lang bei 20.000 × g , um die Membran der DNA-Adsorptionssäule zu trocknen. Durchfluss- und Auffangröhrchen entsorgen. HINWEIS: Dieser Zentrifugationsschritt stellt sicher, dass vor der folgenden Elution jegliches Restethanol entfernt wird. Bei einer Verschleppung von Ethanol erneut bei 20.000 × g für 1 min zentrifugieren.</li>
	<li>Legen Sie die DNA-Adsorptionssäule in ein sauberes 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, pipettieren Sie direkt 100 μl DNA-Elutionspuffer auf die Säulenmembran, inkubieren Sie 1 Minute lang bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie sie dann 1 Minute lang bei 6.000 × g zur Eluierung. HINWEIS: Die Elution mit 100 μl (statt 200 μl) erhöht die endgültige DNA-Konzentration im Eluat, verringert aber auch die Gesamtausbeute der DNA. Um die DNA-Ausbeute zu maximieren, wiederholen Sie die Elution einmal, wie in Schritt 2.8 beschrieben.</li>
	<li>Lagern Sie die DNA-Proben bei 4 °C (bis zu 1 Woche) bzw. -80 °C für die Langzeitlagerung.</li>
</ol>3. Nachweis der DNA-Konzentration
<ol><li>Bestimmen Sie die Werte von OD 260 und OD 280, um die DNA-Reinheit und die Nukleinsäurekonzentration mit dem Mikroplatten-Reader zu vergleichen. Wiederholen Sie dies dreimal für jede Probe.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Konzentration der extrahierten DNA mit einem Fluorometer mit dem Begleitkit mit drei Replikaten für jede Probe.<ol><li>Nehmen Sie 190 μl Arbeitslösung in zwei 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen, nehmen Sie jeweils 10 μl von Standard #1 und Standard #2, fügen Sie sie zu den Arbeitslösungen hinzu und halten Sie sie mindestens 15 Minuten lang lichtgeschützt. HINWEIS: Standard #1 und Standard #2 sind genau für eine bestimmte DNA-Konzentration kalibriert. Standardlösungen sollten genau konfiguriert werden, um die Bildung einer genauen Standardkurve zu gewährleisten. Standard #1 ist eine 0,2 ng/μl doppelsträngige DNA (dsDNA)-Probe; Standard #2 ist 2.000 ng/μL. Die Arbeitslösung ist ein Farbstoff, der spezifisch an dsDNA bindet.</li>
		<li>Nehmen Sie 2 μl Test-DNA und mischen Sie sie mit 198 μl Arbeitslösung in einem 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen und halten Sie sie mindestens 15 Minuten lang von Licht fern. HINWEIS: Wenn die DNA-Konzentration niedrig ist, fügen Sie 5 μl Test-DNA mit 195 μl Arbeitslösung hinzu.</li>
		<li>Schalten Sie das Gerät nach 15 Minuten ein und wählen Sie dsDNA-Konzentrationsmessung | Große Reichweite. Testen Sie zuerst Standard #1 und dann Standard #2, um die Standardkurve zu erhalten. HINWEIS: Die Standardlösung muss am selben Tag nach der Konfiguration verwendet werden. Wenn Sie es zu lange belassen, führt dies zu einem großen Fehler in der Standardkurve.</li>
		<li>Legen Sie die zu testenden Proben nacheinander in die Assay-Wells, stellen Sie das DNA-Spike-Volumen auf 2 μl ein, wiederholen Sie die Messung dreimal, nehmen Sie den Durchschnittswert und zeichnen Sie auf.</li>
	</ol></li>
</ol>4. PCR und elektrophoretischer Nachweis
HINWEIS: Die mitochondriale CO-Gensequenz <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> mit einer Länge von 278 bp wurde für die PCR-Amplifikation mit dem Forward-Primer C1-J-2495: CAGCTACTTTATGAGCTTTAGG und dem Reverse-Primer C1-N-2800: CATTTCAAGCTGTGTAAGCATC8 entnommen, und dann wurde eine 2%ige Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt, um den Amplifikationseffekt und die Länge der Amplifikationsprodukte zu überprüfen.
<ol><li>Richten Sie 20 μl des PCR-Amplifikationssystems ein, indem Sie 10 μl 2x Taq-Mix, 1 μl jedes Primers, 5 μl ddH2O und 3 μl Template-DNA hinzufügen; 10 s in einer Zentrifuge gut mischen.</li>
	<li>Verwenden Sie die folgenden PCR-Zyklusparameter: Prädenaturierung 95 °C für 10 min; Denaturierung 95 °C für 30 s, Glühen 48 °C für 30 s, Ausdehnung 72 °C für 45 s für insgesamt 40 Zyklen; und Endausdehnung 72 °C für 10 min.</li>
	<li>Setzen Sie die Produkte nach der PCR einer 2%igen Agarose-Gelelektrophorese aus und legen Sie sie nach der Elektrophorese zur Photoanalyse auf ein Gel-Imaging-System.</li>
</ol>

Beurteilung der DNA-Reinheit und -Konzentration in frischen und alten nekrophilen Fliegenproben

<ol><li>Amendt, J., Richards, C. S., Campobasso, C. P., Zehner, R., Hall, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forensic+entomology%3A+applications+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Med+Pathol%22%5BJournal%5D)">Forensic entomology: applications and limitations.</a> Forensic Sci Med Pathol. 7 (4), 379-392 (2011).</li>
<li>Wydra, J., Matuszewski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+optimal+post-eclosion+interval+while+estimating+the+post-mortem+interval+based+on+an+empty+puparium%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Med+Pathol%22%5BJournal%5D)">The optimal post-eclosion interval while estimating the post-mortem interval based on an empty puparium.</a> Forensic Sci Med Pathol. 17 (2), 192-198 (2021).</li>
<li>Mazzanti, M., Alessandrini, F., Tagliabracci, A., Wells, J. D., Campobasso, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+degradation+and+genetic+analysis+of+empty+puparia%3A+genetic+identification+limits+in+forensic+entomology%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Int%22%5BJournal%5D)">DNA degradation and genetic analysis of empty puparia: genetic identification limits in forensic entomology.</a> Forensic Sci Int. 195 (1-3), 99-102 (2010).</li>
<li>Odeniran, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((molecular+identification+and+distribution+of+Trypanosome-transmitting+Dipterans+from+cattle+settlements+in+Southwest+Nigeria%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Parasitol%22%5BJournal%5D)">molecular identification and distribution of Trypanosome-transmitting Dipterans from cattle settlements in Southwest Nigeria.</a> Acta Parasitol. 66 (1), 116-128 (2021).</li>
<li>Wells, J. D., Stevens, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+DNA-based+methods+in+forensic+entomology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Application of DNA-based methods in forensic entomology.</a> Annu Rev Entomol. 53, 103-120 (2008).</li>
<li>Kotrba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+barcoding+in+forensic+entomology-establishing+a+DNA+reference+library+of+potentially+forensic+relevant+arthropod+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Forensic+Sci%22%5BJournal%5D)">DNA barcoding in forensic entomology-establishing a DNA reference library of potentially forensic relevant arthropod species.</a> J Forensic Sci. 64 (2), 593-601 (2019).</li>
<li>Weedon, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+SNP+chips+to+detect+rare+pathogenic+variants%3A+Retrospective%2C+population+based+diagnostic+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Use of SNP chips to detect rare pathogenic variants: Retrospective, population based diagnostic evaluation.</a> BMJ. 372, 214(2021).</li>
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<li>Khayrova, A., Lopatin, S., Varlamov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+chitin%2C+chitosan+and+their+melanin+complexes+from+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Obtaining chitin, chitosan and their melanin complexes from insects.</a> Int J Biol Macromol. 167, 1319-1328 (2021).</li>
<li>Guo, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+DNA+extracting+methods+from+different+parts+of+common+necrophagous+flies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Henan+Univ+Sci+Tech+%28Med+Sci%29%22%5BJournal%5D)">Comparison of three DNA extracting methods from different parts of common necrophagous flies.</a> J Henan Univ Sci Tech (Med Sci). 36 (02), 130-133 (2018).</li>
<li>Du, H., Xie, H., Ma, M., Igarashi, Y., Luo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+methods+obtain+high-quality+DNA+and+RNA+from+anaerobic+activated+sludge+at+a+wide+range+of+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Modified methods obtain high-quality DNA and RNA from anaerobic activated sludge at a wide range of temperatures.</a> J Microbiol Methods. 199, 106532(2022).</li>
<li>Sukumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+determination+of+nucleic+acids+and+proteins+using+the+micro-volume+BioSpec-nano-spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer.</a> J Vis Exp. (48), e2699(2011).</li>
<li>Masago, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+fluorimetry+%28Qubit%29+and+spectrophotometry+%28NanoDrop%29+in+the+quantification+of+DNA+and+RNA+extracted+from+frozen+and+FFPE+tissues+from+lung+cancer+patients%3A+A+real-world+use+of+genomic+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Medicina+%28Kaunas%29%22%5BJournal%5D)">Comparison between fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of DNA and RNA extracted from frozen and FFPE tissues from lung cancer patients: A real-world use of genomic tests.</a> Medicina (Kaunas). 57 (12), 1375(2021).</li>
<li>Ponti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+value+of+fluorimetry+%28Qubit%29+and+spectrophotometry+%28NanoDrop%29+in+the+quantification+of+cell-free+DNA+%28cfDNA%29+in+malignant+melanoma+and+prostate+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">The value of fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of cell-free DNA (cfDNA) in malignant melanoma and prostate cancer patients.</a> Clin Chim Acta. 479, 14-19 (2018).</li>
<li>Adams, Z. J., Hall, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+used+for+the+killing+and+preservation+of+blowfly+larvae%2C+and+their+effect+on+post-mortem+larval+length%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Int%22%5BJournal%5D)">Methods used for the killing and preservation of blowfly larvae, and their effect on post-mortem larval length.</a> Forensic Sci Int. 138 (1-3), 50-61 (2003).</li>
<li>Fliegerova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+DNA+extraction+and+sample+preservation+method+on+rumen+bacterial+population%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Effect of DNA extraction and sample preservation method on rumen bacterial population.</a> Anaerobe. 29, 80-84 (2014).</li>
<li>Rodrigues, B. L., Galati, E. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+taxonomy+of+phlebotomine+sand+flies+%28Diptera%2C+Psychodidae%29+with+emphasis+on+DNA+barcoding%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Trop%22%5BJournal%5D)">Molecular taxonomy of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae) with emphasis on DNA barcoding: A review.</a> Acta Trop. 238, 106778(2023).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die DNA-Extraktion ist das wichtigste Glied bei der molekularen Identifizierung nekrophiler Fliegen, und die Extraktionsmethode und die Qualität der extrahierten DNA wirken sich direkt auf den späteren Nachweis aus. In diesem Experiment haben wir erfolgreich DNA von nekrophilen Fliegen extrahiert, indem wir ein gängiges Blutkit verwendet haben, ohne dass ein spezielles Insekten-DNA-Extraktionskit gekauft werden musste, was die Extraktion von Insekten-DNA erleichtert.
Die Oberfläche der Fliegen ist reich an Chitin, vor allem in den Larven- und Puppenstadien, wo das epidermale Chitin 60-70% erreichen kann, was die DNA-Extraktion aus nekrophilen Fliegen erschwert9. Während des Extraktionsprozesses stellten wir fest, dass die Probe, wenn sie nass war, obwohl wir die Probe ausreichend geschert hatten, gallertartig blieb, wenn Proteinase K zum Aufschluss eingesetzt wurde. Dadurch wurde verhindert, dass die zugegebene Flüssigkeit durch die Adsorptionssäule zurückströmte. Um dieses Problem zu lösen, haben wir zunächst flüssigen Stickstoff aufgetragen, um die Proben schnell einzufrieren, damit die Fliegen spröde und leicht zu mahlen sowie leicht zu verdauen sind. Wenn kein flüssiger Stickstoff zum Mahlen zur Verfügung steht und die Effizienz der DNA-Extraktion noch verbessert werden muss, können die Fliegenproben für ca. 48 Stunden in einem belüfteten Bereich gelagert werden. Die Proben können trocknen gelassen werden, bevor sie ausreichend geschert und anschließend mit DNA extrahiert werden.
In Anbetracht der Tatsache, dass der DNA-Abbau alter Proben ein größeres Problem darstellte, wurden in diesem Experiment aufgrund des hohen Thorax-DNA-Gehalts Fliegenthoraxproben für die DNA-Extraktion ausgewählt. Die Verwendung des Thorax ist jedoch zu störend für die morphologische Integrität der Fliege, als dass die späteren Beweise vollständig erhalten bleiben und eine morphologische Identifizierung erforderlich wäre. Die Proben sind schwer zu entnehmen, wenn der Thorax verrottete. Wenn die Proben frisch sind, kann eine DNA-Extraktion des Fußes und des Flügels vorzuziehen sein. Fuß und Flügel sind symmetrisch und beidseitig verteilt, und nach der einseitigen Gewebeentnahme können vollständigere morphologische Merkmale erhalten bleiben. Die Konzentration der DNA, die aus dem Flügel und dem Fuß extrahiert wird, ist jedoch relativ gering, was für nachfolgende Studien riskant ist. Außerdem waren die Proben klein und gingen leichtverloren 10.
Bei Verwendung des DNA-Extraktionskits für die DNA-Extraktion waren die vom Mikroplatten-Reader gemessenen OD260/OD280-Werte größer als 2, mit Ausnahme der alten Probe 2. Zunächst kann festgestellt werden, dass das Protein gründlicher entfernt wurde, es kann aber zu RNA-Kontaminationen, DNA-Doppelstrangbrüchen durch wiederholtes Zentrifugieren oder DNA-Abbau in den alten Proben kommen11. Zweitens kann es auch darauf hindeuten, dass Alkohol die Konservierung der RNA verlängert.
Die DNA-Konzentration wird aus dem OD260-Wert des Mikroplatten-Readers berechnet, während das Qubit Fluorometer verwendet wird, um zunächst eine Standardkurve zu erstellen und dann den Absorptionswert zu messen, um die DNA-Konzentration zu berechnen. Beide Methoden können die Messung der DNA-Spurenkonzentration realisieren, aber jede hat ihre Vor- und Nachteile: Der Mikroplatten-Reader wendet OD260 an, um die DNA-Konzentration zu berechnen, aber seine Berechnungsmethode ist auch eine Schätzung. Wenn die Probe mit einer großen Anzahl von Nukleotiden oder Proteinen und anderen Substanzen gemischt wird, die ultraviolettes Licht absorbieren können, ist der photometrische Fehler größer, daher sollten wir versuchen, sie vorher zu entfernen.
Mikroplatten-Reader und UV-Spektralphotometer verwenden die UV-Absorption zur Detektion, die nicht zwischen DNA, RNA, abgebauten Nukleinsäuren, freien Nukleotiden und anderen Verunreinigungen unterscheiden kann, und die Absorption wird auch stark durch die Kontamination anderer Substanzen beeinflusst, was ihre Messwerte relativ unzuverlässig macht. Beim Spiken von Proben, die in der Regel in Tropfen gemessen werden, werden die Proben direkt ohne Verdünnung oder Verarbeitung dotiert, was die gleichzeitige Messung mehrerer Proben und die direkte Berechnung der DNA-Reinheit aus OD260/OD280-Messungen ermöglicht. Das Qubit-Fluorometer hingegen ist so konzipiert, dass es nur die Konzentration von doppelsträngiger DNA misst, indem es zwei Standardlösungen bekannter Konzentration anwendet, um eine Standardkurve zu erstellen, und die Eigenschaften von Fluoreszenzfarbstoffen anwendet, die spezifisch an doppelsträngige DNA binden. Jede Probe muss jedoch einzeln vorbehandelt und dann einzeln gemessen werden, was bei der Anwendung von Chargenproben umständlich ist, und die Reinheit der extrahierten DNA kann nicht gemessen werden. In der spezifischen Anwendung können die beiden nach ihren eigenen Bedürfnissen für die Qualitätsprüfung der DNA 12,13,14 ausgewählt werden.
Die DNA-Konzentration frischer Proben war höher als die von alten Proben, die in Alkohol eingelegt wurden, und größer als die von unbehandelten alten Proben, unabhängig davon, ob die DNA-Konzentration mit einem Mikroplatten-Reader oder einem Qubit-Fluorometer gemessen wurde. Für die Langzeitlagerung können die Proben in Alkohol getaucht werden, um das Wachstum von Bakterien und Pilzen zu verhindern15,16.
Die unterschiedlichen Messmethoden hatten weniger Einfluss auf die DNA-Messungen alter Proben ohne jegliche Behandlung, wahrscheinlich weil alte Proben stärker abgebaut wurden, insbesondere Proteine und RNA können alle schneller abgebaut werden als DNA. Im Gegensatz dazu enthielten frische Proben mehr Protein und RNA und hatten daher einen größeren Einfluss auf die Ergebnisse. Wenn nur doppelsträngige DNA-Konzentrationen verglichen werden, sollten wir die Ergebnisse des Qubit-Fluorometers verwenden, und die Ergebnisse unserer Experimente erzeugten auch einen signifikanten DNA-Konzentrationsgradienten in der alten und der neuen Probe.
Der DNA-Gehalt sowohl von frischen als auch von alten Proben nach der DNA-Extraktion kann für die anschließende molekularbiologische Analyse verwendet werden. Wie in diesem Experiment waren die für das mitochondriale CO-Gen <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> ausgewählten Primer nur 278 bp groß, und alle konnten erfolgreich durch DNA amplifiziert werden. Das mitochondriale CO-Gen <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> ist wiederum ein Locus, der bei Fliegen für sein DNA-Barcoding-Potenzial anerkannt ist, was die Identifizierung nekrophiler Fliegenarten durch anschließende Sequenzierungsanalyse ermöglicht17. Die Molekularbiologie von länger konservierten Proben kann erfolgreich durch die Auswahl von Primern für andere kürzere DNA-Sequenzen erreicht werden. Bemerkenswert ist, dass die elektrophoretischen Banden der alten Proben zwei Banden mit unterschiedlichen Positionen und kürzeren Sequenzen aufwiesen, wahrscheinlich aufgrund einer unspezifischen Amplifikation der Primer, die durch den Abbau der DNA in Verbindung mit der niedrigen Annealing-Temperatur verursacht wurde.
In diesem Experiment wurden jedoch weniger Proben über einen langen Zeitraum konserviert, um dem Bedarf an sich wiederholenden Experimenten gerecht zu werden, während die Ergebnisse nur repräsentative Proben erforderten. Daher haben wir keinen Wiederholbarkeitstest durchgeführt, der für die Konservierung alter und neuer Proben explorativ sein kann, aber keinen Einfluss auf die erfolgreiche Extraktion von nekrophilen Fliegenproben hat.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Verwendung eines Blut-DNA-Extraktionskits auch bei der Extraktion von nekrophiler Fliegen-DNA helfen kann. Sowohl alte als auch neue Proben können erfolgreich extrahiert werden, und die gesamte extrahierte DNA kann für die anschließende Analyse verwendet werden. Alkohol ist auch günstig für die Langzeitkonservierung von DNA-Proben von Fliegen.

<a href="https://app.jove.com/t/6604">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/66737">10.3791/66737</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/66737">DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples</a>. The Authors section was updated.

Erratum: DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples

Die Schlussfolgerung des Todeszeitpunkts war schon immer eine der zentralen und schwierigsten Fragen, die in der gerichtlichen Praxis zu lösen waren. In der Praxis der Forensik spielt die Bestimmung des postmortalen Intervalls bei einem Kriminalfall eine entscheidende Rolle bei der Ableitung des Tatzeitpunkts, der Eingrenzung des Verdächtigen und der Eingrenzung des Ermittlungsumfangs. Traditionelle Methoden zur Ableitung des Todeszeitpunkts beruhen in erster Linie auf frühen postmortalen Phänomenen, die in der Regel nur zur Ableitung des Todeszeitpunkts innerhalb von 24 Stunden herangezogen werden können. Die lange Zeit des Todes kann jedoch nicht durch postmortale Phänomene bestimmt werden. In der forensischen Gemeinschaft ist inzwischen allgemein anerkannt, dass die forensische Entomologie das Potenzial hat, eine effektive Methode zu sein, um auf eine längere Todeszeit zu schließen.
Nekrophage Insekten sind nach ihren Larven benannt, die sich von Leichen ernähren. Wenn eine Leiche vorhanden ist, sind die erwachsenen nekrophilen Fliegen die ersten, die den Leichnam erreichen und ihre Eier oder Larven ablegen. Die Larven ernähren sich von Leichengewebe und reifen zu Puppen heran, die zu erwachsenen Tieren flügge werden. Nekrophile Fliegen spielen in der Praxis der Forensik eine große Rolle, da sie regelmäßig leben und geographisch verteilt sind, z. B. bei der Ableitung des Todeszeitpunkts und der Bestimmung des Todesortes 1,2. Das Hindernis für den Einsatz nekrophiler Fliegen in der forensischen Praxis ist jedoch die Artbestimmung. Morphologische Methoden werden nach wie vor als maßgebliche Methode zur Artbestimmung von nekrophilen Fliegen verwendet. Die morphologische Artbestimmung erfordert jedoch ein hohes Maß an Integrität der Insekten. Wenn sich die Fliegen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien befanden oder aufgrund morphologischer Veränderungen, die durch Umweltentscheidungen verursacht wurden, erschwert dies alle die morphologische Untersuchung. Insbesondere die Morphologie der Puppen und Puppenpanzer, die am häufigsten am Tatort zu finden sind, ist kaum noch zu erkennen. Dies, zusammen mit dem Mangel an morphologischen Experten, erschwert die morphologische Identifizierung von Arten enorm. Daher hat sich die Anwendung molekularbiologischer Methoden zur Artbestimmung von Fliegen herausgebildet, die die Schwierigkeit der morphologischen Identifizierung reduziert und unabhängig vom Entwicklungsstadiumist 3,4,5,6,7.
Der erste Schritt bei der Artenbestimmung nekrophiler Fliegen auf der Grundlage molekularbiologischer Methoden ist die effiziente Extraktion von DNA, während spezielle Kits für die Extraktion von Insekten-DNA derzeit nicht allgemein verfügbar sind. Und die Verwendung gängiger Blutkits für die DNA-Extraktion von nekrophilen Fliegen wird forensisch immer relevanter. Nekrophile Fliegen, die an Tatorten gefunden werden, sind oft verstümmelt oder haben Verwesung und DNA-Abbau erfahren. Fliegenproben stehen nach der Entnahme nicht sofort für die DNA-Extraktion zur Verfügung, oder wenn möglich, müssen vollständige Proben aufgrund von Anforderungen an die Beweissicherung aufbewahrt werden. Basierend auf den oben genannten Anforderungen haben wir in dieser Studie das Blut-DNA-Kit auf der Grundlage des Proteinase-K-Verdschlusses angewendet und drei frische Chrysomya megacephala (Diptera, Lepidoptera) Proben ausgewählt (Abbildung 1), eine alte C. megacephala Probe, die zwei Jahre lang in Alkohol gelagert wurde, und eine C. megacephala Probe, die zwei Jahre lang lichtgeschützt gelagert wurde, wogen jede der fünf Proben, wählte das Thoraxgewebe von Insekten für die DNA-Extraktion aus. Beim Vergleich der Qualität und Reinheit der DNA, die aus der alten und der neuen Probe extrahiert wurde, wurden PCR-Amplifikation und Elektrophorese der extrahierten DNA mit nekrophilen fliegenspezifischen Primern durchgeführt, die sich in der mitochondrialen CO-Gensequenz <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> befinden.

<table><tbody><tr><td>Puffer AE</td><td>Qiagen</td> 172026832 <td>DNA-Elutionspuffer</td><td></td></tr><tr><td>Puffer AL</td><td>Qiagen</td><td>172028374</td><td>Lysepuffer</td></tr><tr><td>Puffer ATL</td><td>Qiagen</td><td>172028162</td><td>Puffer für die Gewebelyse</td></tr><tr><td>Puffer AW1</td><td>Qiagen</td><td>172028760</td><td>Puffer zur Proteinentfernung</td></tr><tr><td>Puffer AW2</td><td>Qiagen</td><td>57203108</td><td>Entsalzungspuffer</td></tr><tr><td>C1-J-2495</td><td>Taihe Biotechnology</td><td>TW21109216</td><td>Vorwort-Primer</td></tr><tr><td>C1-N-2800</td><td>Taihe Biotechnology</td><td>TW21109217</td><td>Reverse Primer</td></tr><tr><td>D2000</td><td>DNA-Leiter Real-Times(Beijing) Biotechnologie</td><td>RTM415</td><td>Messen Sie die Position der elektrophoretischen Banden</td></tr><tr><td>DNeasy Mini-Spin-Säule</td><td>Qiagen</td> 166050343 <td>DNA-Adsorptionssäule</td><td></td></tr><tr><td>Trockenbad-Inkubator</td><td>Miulab</td><td>DKT200-2D</td><td>zum Erhitzen</td></tr><tr><td>von MIX-30S Mini Mixer</td><td>Miulab</td><td>MUC881206</td><td>oszillatorische Wirkung</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>172026218</td><td>Inaktivierung von intrazellulären Nukleasen und anderen Proteinen</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2321611188</td><td></td></tr><tr><td>Speed Mikrozentrifuge</td><td>Scilogex</td><td>9013001121</td><td>Zentrifuge</td></tr><tr><td>Standard#1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2342797</td><td></td></tr><tr><td>Standard#2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2342797</td><td></td></tr><tr><td>Tanon 3500R Gel Imager</td><td>Tanon</td><td>16T5553R-455</td><td>Gel Imaging</td></tr><tr><td>Taq Mix Pro</td><td>Monad</td><td>00007808-140534</td><td>PCR Mix</td></tr><tr><td>Taq Mix Pro</td><td>Monad</td><td>00007808-140534</td><td>PCR Mix</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Zhuhai Hema</td><td>VRB020A</td><td>gewöhnliche</td></tr><tr><td>PCR-Arbeitslösung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2342797</td><td></td></tr></tbody></table>

dna-extraktion und vergleich zwischen alten und frischen nekrophilen fliegenproben

DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples

Insgesamt wurden fünf Proben von Chrysomya megacephala-Proben - drei frische Proben, eine Probe, die 2 Jahre lang in Alkohol gelagert wurde, und eine Probe, die 2 Jahre lang in trockener, versiegelter Lagerung nur lichtgeschützt gelagert wurde - ausgewählt, um zu untersuchen, ob ein Blut-DNA-Extraktionskit DNA von nekrophilen Fliegen extrahieren kann und ob Alkohol die Konservierung der DNA von nekrophilen Fliegen verlängern kann. Zunächst wurde das Blut-DNA-Extraktionskit verwendet, um DNA aus ihrem Thoraxgewebe zu extrahieren. Anschließend wurden die Reinheit und Konzentration der DNA mit einem Mikroplatten-Reader und einem Fluorometer untersucht. Schließlich wurden die PCR-Amplifikation und die Elektrophorese der extrahierten DNA mit nekrophilen fliegenspezifischen Primern durchgeführt, die sich in der mitochondrialen CO I-Gensequenz befanden. Die Ergebnisse zeigten, dass die DNA-Reinheit aller Proben größer als 2,0 war. Es wurde festgestellt, dass die DNA-Konzentration in der folgenden Größenordnung liegt: frische Proben > alkoholkonservierte alte Proben > unbehandelte, alte Proben. Alle Proben wiesen nach PCR-Amplifikation spezifische elektrophoretische Banden auf. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein Blut-DNA-Extraktionskit verwendet werden kann, um DNA aus nekrophilen Fliegen erfolgreich zu extrahieren, und die DNA-Konzentration frischer Fliegenproben ist höher als die alter Fliegenproben. Die Fliegen können lange in Alkohol gelagert werden.

Wir verwendeten ein Mikroplatten-Reader, um die Werte von OD260 und OD280 der extrahierten DNA-Lösung zu messen, und erhielten dann die OD260/OD280-Werte, um die Reinheit der DNA zu bewerten. Der OD260/OD280 aller frischen Proben und der alten Probe 1 war größer als 2. Der OD260/OD280 der alten Stichprobe 2 hatte einen Maximalwert von 2,187, obwohl der Durchschnitt bei 1,753 lag, und seine drei Messungen schwankten stark aufgrund der geringen (≤0,01) Werte sowohl des OD280 als auch des OD280 (Tabelle 1). Basierend auf dem erhaltenen Wert von OD260 haben wir die DNA-Konzentration geschätzt. Die DNA-Konzentration der drei Proben war in der Größenordnung: frische Proben &gt; alte Probe 1 &gt; alte Probe 2, gemessen mit dem Mikroplatten-Reader, aber der Unterschied zwischen den frischen Proben und den alten Proben war gering, nur ~10-20 ng/μL (Tabelle 1), während die DNA-Konzentration der drei frischen Proben, die mit dem Qubit-Fluorometer gemessen wurde, um 125-130 ng/μL höher war als die mit dem Mikroplatten-Reader gemessene. mit einer Differenz von 15 ng/μL in alter Probe 1 und nur 1,3 ng/μL in alter Probe 2. Die DNA-Konzentration der frischen Proben &gt; alten Probe 1 &gt; alten Probe 2 (Tabelle 2).
DNA, die mit der derzeit verwendeten Extraktionsmethode extrahiert wird, enthält alle DNA-Komponenten aus verschiedenen Quellen in der Probe. Das bedeutet, dass die DNA-Lösung nicht nur eine Lösung der genomischen DNA der Fliege war. Die Primer zur spezifischen Amplifikation von mitochondrialen CO-Genfragmenten <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> der Fliege wurden unter Berücksichtigung der Literatur ausgewählt und mit dem NCBI-Blast Primer verifiziert. Die Ergebnisse zeigten, dass der Forward-Primer C1-J-2495 und der Reverse-Primer C1-N-2800 des mitochondrialen CO-Gens <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> fliegenspezifische Primer mit Sequenzpolymorphismus waren und viele Fliegenarten abdeckten. Die Amplifikationsergebnisse zeigten keine menschlichen Gene. Es handelte sich um ein Paar zuverlässiger DNA-Biomarker für die Identifizierung nekrophiler Fliegen und wurden für die Überprüfung der Ergebnisse dieses Experiments ausgewählt.
Alle verschiedenen Proben zeigten offensichtliche elektrophoretische Banden mit Längen von 250 bp bis 400 bp. Die Banden waren in den frischen Proben heller als in den alten Proben, und die mit Alkohol platzierten alten Proben (Abbildung 2, Alt1) waren heller als die unbehandelten alten Proben (Abbildung 2, Alt2), aber die alten Proben hatten auch zwei Banden an unterschiedlichen Positionen. Das leere Steuerelement wies keine Banden auf (Abbildung 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66737/66737fig01.jpg"> Abbildung 1: Bilder von Chrysomya megacephala aus verschiedenen Blickwinkeln. (A) Männchen; (B) weiblich. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66737/66737fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66737/66737fig02.jpg"> Abbildung 2: Elektropherogramm von PCR-Amplifikationsprodukten. Die ersten drei Banden von links sind PCR-Amplifikationsprodukte von DNA aus frischen Fliegenproben. Die vierte elektrophoretische Bande ist das PCR-Produkt der DNA aus der alten Fliegenprobe, die in Alkohol konserviert wurde. Die fünfte Bande ist das PCR-Produkt der DNA aus der alten Fliegenprobe ohne besondere Konservierung. Das sechste Band ist ein leeres Steuerelement. Es ist sauber und beweist, dass während der PCR-Amplifikation keine Kontamination aufgetreten ist. Ganz rechts befindet sich die DNA-Leiter, auf der wir DNA-Positionen mit Längen von 250 bp und 400 bp markiert haben. Die elektrophoretischen Banden aller PCR-Produkte der Proben lagen leicht über 250 bp und unter 400 bp bei den Leiterbanden. Diese Position entspricht der Länge des 278 bp Zielgens. Mit bloßem Auge ist es offensichtlicher, dass die DNA-Banden, die frische Proben repräsentieren, heller sind als die alter Proben. Die alten Proben bestehen aus anderen DNA-Banden, die dort in weniger intensiven Nicht-Ziel-Genen unterschiedlicher Länge vorliegen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66737/66737fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Probe</td>
			<td>Frisch1</td>
			<td>Frisch2</td>
			<td>Frische3</td>
			<td>Alt1</td>
			<td>Alt2</td>
		</tr><tr><td>OD260/OD280</td>
			<td>2.354±0.036</td>
			<td>2.245±0.027 kg</td>
			<td>2.060±0.038</td>
			<td>2.143±0.012 kg</td>
			<td>1.753±0.421</td>
		</tr><tr><td>DNA (ng / μL)</td>
			<td>Tel.: 119.91±1.686</td>
			<td>Tel.: 116.084±4.965</td>
			<td>95.239±3.401</td>
			<td>86.845±6.14</td>
			<td>10.151±0.168 kg</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Messung der DNA-Reinheit und -Konzentration mit einem Mikroplatten-Reader.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Probe</td>
			<td>Frisch1</td>
			<td>Frisch2</td>
			<td>Frische3</td>
			<td>Alt1</td>
			<td>Alt2</td>
		</tr><tr><td>DNA (ng / μL)</td>
			<td>Artikel-Nr.: 243.333±1.528</td>
			<td>Tel.: 237.667±2.082</td>
			<td>226.000±2.000</td>
			<td>101.000±0.000</td>
			<td>11.433±0.058</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: Messung der DNA-Konzentration mit einem Fluorometer.

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Extraktion frischer und alter nekrophiler Fliegen-DNA unter Verwendung eines modifizierten gängigen DNA-Extraktionskits.

DNA-Extraktion und Vergleich zwischen alten und frischen nekrophilen Fliegenproben

A total of five samples of Chrysomya megacephala samples - three fresh samples, one sample stored in alcohol for 2 years, and one sample stored in dry ...

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DNA-Extraktion und Vergleich zwischen alten und frischen nekrophilen Fliegenproben

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