Vorbereitung eines Mäusemodells für schwere akute Pankreatitis durch eine Kombination aus Caerulein und Lipopolysaccharid intraperitoneale Injektion

Die Behandlung einer schweren akuten Pankreatitis ist aufgrund der hohen Mortalitätsraten in Tiermodellen, insbesondere bei Mäusen mit C57BL/6J-selektiertem Hintergrund, schwierig. Wir untersuchen SAP als pathologisch, um therapeutische Ziele zu identifizieren und neue Behandlungen zu entwickeln, wobei wir die Polymice-Methode in der einen SAP-Forschung bereitstellen.

Diese Forschung deckte eine hohe Expression von HMGB1-Genen auf, die die Pankreatitis verletzten, was auf eine Assoziation mit dem Entzündungsstein der schweren akuten Pankreatitis hindeutet. Unser Protokoll beinhaltet Caerulein, um die Kontraktion der Gallenblase zu induzieren und das Fasten bei Mäusen zu stören, was zu einer Schädigung des Bauchspeicheldrüsengewebes führt, indem es die Sekretion von Verdauungsflüssigkeit blockiert. In Kombination mit der LPS-Injektion induzierten wir bei Mäusen eine schwere Pankreatitis mit Organversagen. Dieser Ansatz ist nicht-invasiv und einfach zu implementieren, mit kurzen Zyklen und hoher Wiederholgenauigkeit.

[Demonstrant] Messen und notieren Sie zunächst das Gewicht der Versuchsmaus. Für die intraperitoneale Injektion von Caerulein fassen und halten Sie die Maus mit dem Bauch nach oben und dem Kopf tiefer als der Schwanz. Halten Sie die Spritze in der rechten Hand und führen Sie die Nadel in die Unterhaut auf der linken Seite der weißen Bauchlinie ein. Bewegen Sie die Nadel etwa drei bis fünf Millimeter nach vorne und führen Sie sie in einem 45-Grad-Winkel in die Bauchhöhle ein. Halten Sie die Nadel stationär und injizieren Sie das Caerulein langsam. Ziehen Sie die Nadel heraus, massieren Sie die Injektionsstelle sanft und drücken Sie sie mit einem sterilen Wattestäbchen, um das Medikament vollständig in die Bauchhöhle zu diffundieren. Platzieren Sie die Maus 12 Stunden nach der Injektion in der Mitte des Gitters in der Experimentierkiste, die vom Experimentator abgewandt ist. Schalten Sie die Video-Tracking-Software ein und richten Sie die Überwachung für vier gleichzeitige Sichtfelder ein. Markieren Sie die Länge und Breite des experimentellen Objekts, das sich innerhalb des Feldes bewegen kann, im Echtzeitüberwachungsbildschirm. Zeichnen Sie die Mausaktivität 15 Minuten lang auf. Makroskopische Veränderungen, die im Modell der Pankreasverletzungsmäuse während der fünf Zyklen gemessen wurden, zeigten, dass Mäuse in der Pankreasverletzungsgruppe 5 innerhalb von drei Minuten eine geringe Bewegungsdistanz beibehielten, während das Immobilitätsverhältnis innerhalb von drei Minuten mit jedem nachfolgenden Zyklus zunahm. Pankreasverletzungsgruppe 5 zeigte im Vergleich zu den anderen Versuchsgruppen die geringste Gesamtbewegungsdistanz, und der Unterschied war statistisch signifikant. Mit Ausnahme der Kontrollgruppe und der Pankreasverletzungsgruppe 1 zeigten alle Gruppen ein negatives D-Wert-Gewichtswachstum, wobei die Pankreasverletzungsgruppe 5 die größte Veränderung aufwies. Die Überlebensratenanalyse ergab eine Mortalitätsrate von 80 % in der Pankreasverletzungsgruppe 5 am fünften Tag, im Gegensatz zu den anderen Gruppen, die keinen signifikanten Unterschied zur Kontrolle zeigten. Nach 36 Stunden intraperitonealer Injektion von Caerulein wird die Maus eingeschläfert und in Rückenlage auf einer Schaumstoffplatte fixiert. Machen Sie einen medianen Schnitt im Bauchraum und drehen Sie den Dünndarmschlauch nach rechts, um die Bauchspeicheldrüse freizulegen. Trennen Sie den Zwölffingerdarm und den Pylorusgang. Lokalisieren Sie den Dünndarm unter der Bauchspeicheldrüse und befreien Sie dann das Bauchspeicheldrüsengewebe entlang des Darmgangs vollständig. Mit einer zahnlosen Pinzette die Milz einklemmen und sanft nach oben ziehen. Präparieren Sie das hintere Pankreasbandgewebe scharf bis zum Kopf der Bauchspeicheldrüse. Trennen Sie dann den Gallengang und die Blutgefäße. Entfernen Sie das Bauchspeicheldrüsengewebe aus der Bauchhöhle und tupfen Sie die Oberflächenfeuchtigkeit mit saugfähigem Papier trocken. Messen und notieren Sie das Gewicht des Bauchspeicheldrüsengewebes. Nach der Vorbereitung der Paraffinschnitte das Pankreasgewebe zweimal für jeweils fünf Minuten in Xylol entwachsen. Behandeln Sie jeden Abschnitt mit 100 Mikrolitern Proteinase K und inkubieren Sie ihn 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie die erforderliche Menge an 3% Wasserstoffperoxid in das Gewebe und inkubieren Sie es 20 Minuten lang, um es vollständig zu infiltrieren. Decken Sie die gesamte Fläche der Probe mit 50 Mikrolitern Äquilibrierungspuffer ab und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang. Geben Sie dann 56 Mikroliter TDT-Inkubationspuffer zu jeder Gewebeprobe und inkubieren Sie eine Stunde lang. Waschen Sie die Gewebeschnitte viermal jeweils fünf Minuten lang mit PBS, bevor Sie sie 30 Minuten lang in 100 Mikrolitern Streptavidin-HRP-Reaktionslösung inkubieren. Für die DAB-Färbung geben Sie 50 Mikroliter DAB in jeden Gewebeschnitt. Tauchen Sie die Schnitte drei bis fünf Minuten lang in Hämatoxylin-Färbelösung, bevor Sie sie mit reinem Wasser abspülen. Dehydrieren Sie die Proben mit vier Runden frischem wasserfreiem Ethanol für jeweils fünf Minuten. Führen Sie eine histologische Untersuchung unter einem Weißlichtmikroskop durch. TUNEL-Färbungen auf dem Pankreasgewebe von Mäusen zeigten eine Zunahme der zellulären Nekrose in der Pankreasverletzungsgruppe 5, mit signifikant höheren Graustufenwerten und positiven Nekroseraten im Vergleich zu anderen Gruppen. Das Protein-Immunblotting untersuchte die Caspase-3-Expression, einen Marker für zelluläre Nekrose, und zeigte einen signifikanten Anstieg des Gewebes der Pankreasverletzungsgruppe 5. Die Durchflusszytometrie von Pankreas-Azinuszellsuspensionen, die mit einem Nexin 5 fitten CPI markiert wurden, zeigte eine deutlich höhere Zelltodrate in der Pankreasverletzungsgruppe 5 im Vergleich zu anderen, mit statistischer Signifikanz.