Isolierung von Zellkernen aus humanem intermuskulärem Fettgewebe und nachgeschaltete Einzelkern-RNA-Sequenzierung
May 3rd, 2024
Die Biologie des intermuskulären Fettgewebes (IMAT) ist aufgrund der begrenzten Zugänglichkeit von menschlichem Gewebe weitgehend unerforscht. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die Zellkernisolierung und die Bibliotheksvorbereitung von gefrorenen humanen IMAT für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung, um die zelluläre Zusammensetzung dieses einzigartigen Fettdepots zu identifizieren.
Unsere Forschungsgruppe versucht, die Zellzusammensetzung und die zellspezifischen Transkriptionsprofile von intermuskulärem Fettgewebe (IMAT) beim Menschen zu verstehen. IMAT ist eigentlich ein ektopisches Fettdepot, das sich zwischen und um die Muskelfasern herum befindet. Computertomographie und MRT waren in der Lage, das IMAT-Volumen zu quantifizieren und haben kürzlich gezeigt, dass es sowohl mit dem Alter als auch mit dem BMI zunimmt und auch mit degenerativen Muskelerkrankungen in Verbindung gebracht wird.
In-vitro-Sekretomstudien haben kürzlich gezeigt, dass IMAT-sekretierte Proteine die Fähigkeit haben, die Insulinsensitivität, Entzündungsprofile und auch die kontraktile Proteinexpression in der menschlichen Skelettmuskulatur zu beeinflussen. Die begrenzte Menge an IMAT-Gewebe, das bei Biopsien gesammelt wird, und die lipidbeladene Natur der Adipozyten machen dieses Gewebe unverträglich mit der Gewebeverdauung und der Einzelzell-RNA-Seq. Daher wollten wir ein Protokoll entwickeln, das die Zellkernisolierung an kleinen Gewebemengen durchführt, die dann in nachgeschalteter Einzelkern-RNA-Seq verwendet werden können.
Dieses Protokoll wird es den Forschern ermöglichen, die Zusammensetzung und zellspezifischen Transkriptionsveränderungen zu bestimmen, die bei IMAT in verschiedenen metabolischen Krankheitszuständen und als Reaktion auf Eingriffe auftreten. Wir hoffen, dass diese Informationen für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur Linderung von Stoffwechselerkrankungen von entscheidender Bedeutung sein werden, indem sie entweder direkt auf IMAT oder auf seine sezernierten Faktoren abzielen. Auf diesem Gebiet fehlen Daten über die Biologie von IMAT, seine zellulären Ursprünge und die Kommunikation mit anderen Zellen, die sowohl innerhalb als auch außerhalb von IMAT leben, sowie über seine molekularen Reaktionen auf Lifestyle-Interventionen wie Ernährung und Bewegung oder Pharmakotherapie.
All dies sind zentrale Forschungsfragen für unsere Gruppe.
Überblick
Diese Studie untersucht die zelluläre Zusammensetzung und spezifischen Transkriptionsprofile von intermuskulärem Fettgewebe (IMAT) beim Menschen, ein weniger erforschter Bereich aufgrund der begrenzten Zugänglichkeit des Gewebes. Ein detailliertes Protokoll zur Kernisolation und Bibliotheksvorbereitung für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung wird vorgestellt, um die Identifizierung zellulärer Komponenten innerhalb dieses einzigartigen Fettdepots zu erleichtern.
Wichtige Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Intermuskuläre Fettgewebe (IMAT) Biologie
- Zelluläre Zusammensetzung und Funktion
- Auswirkungen auf Stoffwechselkrankheiten
Hintergrund
- IMAT ist ein ektopisches Fettdepot, das sich zwischen Muskelfasern befindet.
- Sein Volumen nimmt mit dem Alter und BMI zu und korreliert mit Muskeldegenerationskrankheiten.
- Die Sekretion von Proteinen aus IMAT beeinflusst die Insulinempfindlichkeit und Entzündung in Skelettmuskeln.
Verwendete Methoden
- Kernisolation aus kleinen Proben menschlichen IMAT-Gewebes
- Einzelkern-RNA-Sequenzierung
- Protokollentwicklung für den Umgang mit lipidbeladenem Fettgewebe
Hauptergebnisse
- Ein Protokoll entwickelt, das es Forschern ermöglicht, die zellspezifische Transkriptomik von IMAT zu analysieren.
- Erleichterung der Identifizierung zellulärer Veränderungen in metabolischen Krankheitszuständen und Interventionen.
- Verbessertes Verständnis der Rolle von IMAT in der metabolischen Gesundheit.
Schlussfolgerungen
- Die Studie liefert wertvolle Einblicke in die Biologie von IMAT.
- Die Ergebnisse könnten neue therapeutische Strategien zur Behandlung von IMAT bei Stoffwechselkrankheiten leiten.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Single-nuclei RNA sequencing of human intermuscular adipose tissue (IMAT) addresses a critical gap in understanding depot-specific cellular composition and transcriptional states relevant to metabolic and muscle degenerative diseases. This protocol enables high-resolution profiling from limited biopsy material, supporting predictive confidence in early discovery and target validation for metabolic disease portfolios. The approach enhances mechanistic de-risking at the intersection of adipose and muscle biology, informing translational research and therapeutic strategy development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of IMAT-specific cellular heterogeneity and transcriptional programs.
- Supports functional target validation by revealing cell-type-specific gene expression signatures.
- Facilitates mechanistic de-risking for metabolic and muscle disease targets.
- Provides foundational data for prioritizing depot-specific intervention strategies.
Screening & Assay Development
- Prepares validated nuclei suspensions suitable for high-throughput single-nuclei RNA-seq workflows.
- Standardizes sample processing from lipid-rich, limited human tissue biopsies.
- Enables reproducible detection of rare and low-abundance cell populations.
- Supports quantitative transcriptomic readouts for downstream compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns IMAT cellular profiles with disease-relevant metabolic and muscle phenotypes.
- Enables continuity from human tissue discovery to preclinical model validation.
- Supports identification of translational biomarkers linked to IMAT biology.
- Informs risk-adjusted advancement of depot-targeted therapeutic programs.
Pipeline & Workflow Integration
This nuclei isolation and sequencing protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for metabolic and muscle disease research, enabling robust target validation and translational continuity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on IMAT cellular composition and secretome influence on muscle tissue.
- Screening: Delivers standardized, reproducible nuclei preparations for scalable transcriptomic assays.
- Analytics: Provides quantitative single-nuclei RNA-seq data for comparative analysis across disease states and interventions.
- Translational Research: Bridges human tissue findings to preclinical model development and biomarker discovery.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable protocol for profiling other challenging adipose depots or limited biopsy samples.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in IMAT-related target selection and mechanistic understanding.
- Operational Value: Standardizes nuclei isolation from lipid-rich, limited human tissues for reproducible downstream analysis.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for depot-targeted therapeutic programs and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of metabolic and muscle disease assets based on human tissue data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, nuclei isolation, and single-nuclei RNA-seq library preparation.
- Demands access to specialized instrumentation for nuclei counting and droplet-based sequencing.
- Necessitates cross-team standardization for sample processing and data analysis workflows.
- May require adaptation for other adipose depots or tissue types with distinct lipid content.
- Limited by the amount and quality of human biopsy material available for analysis.
