Isolierung und Kryokonservierung von hochlebensfähigen mononukleären Zellen des peripheren Blutes des Menschen aus Vollblut: Ein Leitfaden für Einsteiger

In diesem Protokoll möchten wir eine leicht verständliche Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Entnahme und Lagerung von peripherem Blut und mononukleären Zellen (PBMCs) mit hoher Lebensfähigkeit aus Vollblut bereitstellen. Zu den PBMCs gehören Lymphozyten, dendritische Zellen und Monozyten. Bulk-PBMCs können zur Isolierung einzelner Zelltypen verarbeitet werden und werden häufig in einer Vielzahl von Experimenten und Assays verwendet, einschließlich RNA-Sequenzierung und Durchflusszytometrie.

Neben PBMCs zeigen wir auch, wie man EDTA-Plasma und ganzes Buffy Coat sammelt. Bevor Sie mit diesem Protokoll beginnen, bereiten Sie bitte die in Tabelle 2 aufgeführten Materialien und Reagenzien vor. Beachten Sie, dass dieses Protokoll für die Entnahme von PBMCs aus sechs Dichtegradientenzentrifugationsröhrchen ausgelegt ist, von denen jedes etwa 12 Millionen Zellen ergibt.

Skalieren Sie entsprechend. Mit der Standard-Phlebotomietechnik Vollblut in sechs Dichtegradientenzentrifugationsröhrchen und einem EDTA-Röhrchen sammeln, bis es gefüllt ist. Zentrifugieren Sie alle Röhrchen bei 1800 g für 20 Minuten bei Raumtemperatur.

Bei Bedarf können die gesammelten Röhrchen bis zu vier Stunden gelagert und dann gleichzeitig verarbeitet werden. Im ergänzenden Video 1 finden Sie eine Demonstration der Bedienung einer Zentrifuge. Nach der Zentrifugation des Röhrchens, das das Dichtegradientenmedium enthält, befinden sich Plasma und PBMCs über dem Dichtegradientenmedium.

Erythrozyten und Granulozyten setzen sich am Boden ab. Eine Visualisierung finden Sie in Abbildung 1A. Öffnen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig das Dichtegradientenzentrifugationsröhrchen.

Verwenden Sie eine Transferpipette, um die durchscheinende gelbe Schicht, die das Plasma enthält, zu entfernen und zu entsorgen. Stören Sie nicht die trübe Zellschicht direkt über dem Dichtegradientenmedium. Irren Sie sich auf die Seite, überschüssiges Plasma zu belassen, anstatt PBMCs zu verwerfen.

Wiederholen Sie den Vorgang für alle Tuben. Pipettieren Sie mit einer neuen Transferpipette das verbleibende Volumen, das die Zellen und das Restplasma in jedem Röhrchen enthält, vorsichtig mehrere Male über dem Dichtegradientenmedium auf und ab. Pipettieren Sie nach der Resuspension den resuspendierten Inhalt des Röhrchens in ein beschriftetes konisches 50-ml-Röhrchen.

Wiederholen Sie den Vorgang für alle Tuben. Füllen Sie das 50-ml-Röhrchen bis zur 50-ml-Linie mit Lösung 1 durch Gießen. Zentrifugieren Sie das 50-ml-Röhrchen bei 300 g 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Das in Abschnitt 2 beschriebene Protokoll zur Plasma- und Buffy-Entnahme kann während dieser Zeit abgeschlossen werden. Nach der Zentrifugation enthält das Pellet PBMCs und der Überstand enthält Blutplättchen und Restplasma. Entsorgen Sie so viel Überstand wie möglich.

Tippen Sie nach Bedarf, um Tropfenreste zu entfernen. Gießen Sie ein 15-ml-Röhrchen mit Lösung 2 in das konische 50-ml-Röhrchen, das das PBMC-Pellet enthält. Drehen Sie das Rohr vorsichtig um, um das Pellet wieder aufzuwirbeln.

Aspirieren Sie 15 ml Lösung 3 mit einer Transferpipette. Geben Sie tropfenweise in das 50-ml-Röhrchen. Lösung 3 enthält DMSO, das bei Raumtemperatur für Zellen giftig ist.

Fügen Sie Lösung 3 erst hinzu, wenn sie sofort verarbeitet werden kann. Drehen Sie das Röhrchen zum Mischen dreimal vorsichtig um. Füllen Sie jedes vormarkierte und vorgekühlte Kryo-Fläschchen mit 1 ml PBMCs mit einer Multi-Dispense-Pipette.

Im ergänzenden Video 2 finden Sie eine Demonstration der Bedienung einer Multidispense-Pipette. Stellen Sie die Kryo-Fläschchen in einen vorgekühlten Gefrierbehälter. Stellen Sie den Behälter dann in einen Gefrierschrank mit minus 80 Grad Celsius.

Bewahren Sie die Kryo-Fläschchen mindestens 12 Stunden lang im Gefrierbehälter auf. Dann bei minus 80 Grad Celsius in eine beschriftete Aufbewahrungsbox umfüllen. Alternativ können Sie die gefrorenen Kryo-Fläschchen zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff umfüllen.

Nach der Zentrifugation besteht die oberste Schicht aus Plasma, die untere aus Erythrozyten und die Grenzfläche sind die Buffy-Coats. Eine Visualisierung finden Sie in Abbildung 1B. Mit einer neuen Transferpipette wird so viel Plasma wie möglich angesaugt, ohne die Buffy-Coat-Schicht zu stören.

Geben Sie dann 0,5 ml-Aliquots in vormarkierte Kryo-Fläschchen ab. Aspirieren Sie die Buffy-Coat-Schicht und übertragen Sie sie in das entsprechend beschriftete Kryo-Fläschchen. Beachten Sie, dass einige Plasma- und Erythrozyten die Buffy-Coat-Sammlung kontaminieren können.

Lagern Sie die Kryo-Fläschchen nach der Entnahme in einem Gefrierschrank mit minus 80 Grad Celsius. Alternativ können Sie es für die Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff lagern. Bevor Sie mit dem PBMC-Auftauprotokoll beginnen, bereiten Sie bitte die in Tabelle 3 aufgeführten Materialien und Reagenzien vor.

Dieses Protokoll ist für das Auftauen eines 1,5-ml-Röhrchens mit ca. 2 Millionen Zellen ausgelegt. Skalieren Sie entsprechend. Beachten Sie, dass die absolute Anzahl der Zellen zwischen verschiedenen Patienten und verschiedenen Behandlungsbedingungen erheblich variieren kann.

Gefrorene PBMCs mit Trockeneis aus der Lagerung überführen und in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator etwa 4 Minuten lang auftauen. Falls gewünscht, kann ein Aliquot für Zellzählungs- und Viabilitätsmessungen entnommen werden, wie in Abschnitt 4 des schriftlichen Protokolls beschrieben. Geben Sie nach dem Auftauen 1 ml Lösung 4 in jedes Kryo-Fläschchen.

Gießen Sie dann den Inhalt in ein vorbeschriftetes 50-ml-Röhrchen mit 10 ml Lösung 4 für jedes aufgetaute PBMC-Röhrchen. Tippen Sie, um Tropfenreste zu entfernen. Legen Sie das Zellsieb auf das leere 50-ml-Röhrchen und gießen Sie dann die Zellsuspension durch das Zellsieb.

Bei Bedarf leicht klopfen, um die Oberflächenspannung zu brechen. Jedes Röhrchen mit den passierten Zellen bei 400 g wird 7 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Gießen Sie nach dem Zentrifugieren den DMSO-haltigen Überstand aus.

Tippen Sie nach Bedarf, um Tropfenreste zu entfernen. Resuspendieren Sie das Zellpellet in dem gewünschten Medium, das für nachgelagerte experimentelle Anforderungen geeignet ist, wie z. B. Zellkulturmedien oder Antikörpercocktails für die Durchflusszytometrie. Fahren Sie mit dem Experiment fort.

Nach der PBMC-Entnahme und Kryokonservierung wurde die Lebensfähigkeit von aufgetauten PBMCs, Monozyten und Lymphozyten aus 56 einzigartigen Proben mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung der in Tabelle 4 aufgeführten Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers in den Abbildungen 2A bis F.A bewertet. Die mittlere und Standardabweichung der Lebensfähigkeit von PBMCs, Monozyten und Lymphozyten von 94 plus oder minus 4 %98 plus oder minus 1,1 % bzw. 93 plus oder minus 5,6 % erreicht wurde, wie in Abbildung 2G dargestellt. Viabilitätsmessungen durch Trypanblau-Ausschluss ergaben eine mittlere Viabilität von 88 plus oder minus 7,5 % und eine Zellzahl von 2,3 mal 10 für die 6 plus oder minus 1,9 mal 10 für die 6. Die durchflusszytometrische Analyse zeigte auch, dass lebende Monozyten 17 plus oder minus 5,9 % und Lymphozyten 53 plus oder minus 13 % der gesamten PBMCs ausmachten.

Anschließend wurden Monozyten aus aufgetauten PBMCs aus 59 einzigartigen Proben mittels Durchflusszytometrie sortiert und zur Bibliotheksvorbereitung und RNA-Sequenzierung eingereicht, wie an anderer Stelle beschrieben. Eine mittlere und Standardabweichung der Gesamtsequenzanzahl von 18 plus oder minus 16,3 Millionen wurde mit einer Leseausrichtung von 93 plus oder minus 6,3 % und einem GC-Gehalt von 49,6 plus oder minus 1,4 erreicht, wie in den Abbildungen 3A und B gezeigt. Ein Mittelwert und eine Standardabweichung von eindeutig kartierten Lesevorgängen von 88 plus oder minus 3,6 % wurden mit einer Teilmenge von 56 eindeutigen Stichproben gefunden. Diese Parameter zeigen, dass hochgradig funktionsfähige PBMCs, die für Downstream-Anwendungen, einschließlich hochwertiger RNA-Sequenzierung, geeignet sind, von Bedienern mit jeder Laborausbildung unter Verwendung dieses Protokolls erhalten werden können.

Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es wichtig, schnell zu arbeiten, um den Zelltod zu vermeiden, insbesondere nach Zugabe von Lösung 3, die für Zellen bei Raumtemperatur giftig ist. Darüber hinaus müssen die Zellen auch schonend behandelt werden, um Schäden zu minimieren. Dieses Protokoll bietet eine effiziente, einfach zu befolgende Methode für die Isolierung von PBMCs, EDTA-Plasma und Buffy Coat.

Diese Immunzellen können für eine breite Palette von Experimenten und Assays verwendet werden, die sich auf die Rolle des Immunsystems in verschiedenen biologischen Kontexten konzentrieren.