Name: Isolierung und Kryokonservierung von hochlebensfähigen mononukleären Zellen des peripheren Blutes des Menschen aus Vollblut: Ein Leitfaden für Einsteiger (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Kryokonservierung hochlebensfähiger mononukleärer Zellen aus menschlichem Vollblut. Dieses Protokoll ermöglicht zuverlässige PBMC-Gewinnung für immunologische und zellbiologische Studien.

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<ol><li>Mathew, J., Sankar, P., Varacallo, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMathew%2C+J+%22Physiology%2C+Blood+Plasma%22">Physiology, Blood Plasma</a>. , StatPearls Pubs. Treasure Island, Florida. (2018).</li>
<li>Van Oost, B., Van Hien-Hagg, I. H., Timmermans, A. P., Sixma, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+thrombin+on+the+density+distribution+of+blood+platelets%3A+Detection+of+activated+platelets+in+the+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The effect of thrombin on the density distribution of blood platelets: Detection of activated platelets in the circulation.</a> Blood. 62 (2), 433-438 (1983).</li>
<li>Hassani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+low-density+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">On the origin of low-density neutrophils.</a> Journal of Leukocyte Biology. 107 (5), 809-818 (2020).</li>
<li>Norouzi, N., Bhakta, H. C., Grover, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+cells+by+their+density%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Sorting cells by their density.</a> PLOS ONE. 12 (7), e0180520(2017).</li>
<li>Manzone, T. A., Dam, H. Q., Soltis, D., Sagar, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+volume+analysis%3A+A+new+technique+and+new+clinical+interest+reinvigorate+a+classic+study%5BTitle%5D)+AND+%22JNMT%22%5BJournal%5D)">Blood volume analysis: A new technique and new clinical interest reinvigorate a classic study.</a> JNMT. 35 (2), 55-63 (2007).</li>
<li>Kleiveland, C. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKleiveland%2C+CR+%22The+impact+of+food+bioactives+on+health%3A+In+vitro+and+ex+vivo+models%22">The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo models</a>. , Springer. Cham. 161-167 (2015).</li>
<li>Rosado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+biomarker+detection%3A+Alternative+approaches+for+blood-based+biomarker+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Advances in biomarker detection: Alternative approaches for blood-based biomarker detection.</a> Adv Clin Chem. 92, 141-199 (2019).</li>
<li>Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRiedhammer%2C+C+%22Multiple+sclerosis%3A+Methods+and+Protocols%22">Multiple sclerosis: Methods and Protocols</a>. 1304, Humana Press. New York, NY. 53-61 (2016).</li>
<li>Panda, S. K., Ravindran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Culture+of+Human+PBMCs%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro Culture of Human PBMCs.</a> Bio Protoc. 3 (3), e322(2013).</li>
<li>He, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+blood+vs+PBMC%3A+Compartmental+differences+in+gene+expression+profiling+exemplified+in+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy+Asthma+Clinic+Immol%22%5BJournal%5D)">Whole blood vs PBMC: Compartmental differences in gene expression profiling exemplified in asthma.</a> Allergy Asthma Clinic Immol. 15, 67(2019).</li>
<li>Pelák, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+enrichment+using+CD81-targeted+immunoaffinity+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte enrichment using CD81-targeted immunoaffinity matrix.</a> Cytometry Part A. 91 (1), 62-72 (2017).</li>
<li>Higdon, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+in-depth+immunophenotyping+of+delay+to+peripheral+blood+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Impact on in-depth immunophenotyping of delay to peripheral blood processing.</a> Clin Exp Immunol. 217 (2), 119-132 (2024).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+aptamer-CRISPR+nanodevice+enables+precise+profiling+of+interferon-gamma+release+in+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable aptamer-CRISPR nanodevice enables precise profiling of interferon-gamma release in humanized mice.</a> ACS Nano. 18 (4), 3826-3838 (2024).</li>
<li>Ren, Z., Li, C., Wang, J., Sui, J., Ma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+revealed+dysregulated+RNA-binding+protein+expression+patterns+and+functions+in+human+ankylosing+spondylitis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Med%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome revealed dysregulated RNA-binding protein expression patterns and functions in human ankylosing spondylitis.</a> Front Med. 11, 1369341(2024).</li>
<li>Honardoost, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+immune+cell+dysregulation+and+molecular+subtypes+revealed+by+single-cell-RNA-seq+of+subjects+with+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Systematic immune cell dysregulation and molecular subtypes revealed by single-cell-RNA-seq of subjects with type 1 diabetes.</a> Genome Med. 16, 45(2024).</li>
<li>Amini, A., Esmaeili, F., Golpich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+role+of+lncRNAs+in+amelioration+of+Parkinson%27s+disease+symptoms+by+transplantation+of+dopaminergic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">Possible role of lncRNAs in amelioration of Parkinson's disease symptoms by transplantation of dopaminergic cells.</a> NPJ Parkinsons Dis. 10, 56(2024).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sars-Cov-2+spike+induces+intestinal+barrier+dysfunction+through+the+interaction+between+CEACAM5+and+Galectin-9%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sars-Cov-2 spike induces intestinal barrier dysfunction through the interaction between CEACAM5 and Galectin-9.</a> Front Immunol. 15, e1303356(2024).</li>
<li>Zhang, X., Wu, G., Ma, X., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+alterations+and+PI3k-PKB+pathway+suppression+in+patients+with+allergic+rhinitis+undergoing+sublingual+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Ther%22%5BJournal%5D)">Immune cell alterations and PI3k-PKB pathway suppression in patients with allergic rhinitis undergoing sublingual immunotherapy.</a> Adv Ther. 41 (2), 777-791 (2024).</li>
<li>Rucci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+mitochondrial+DNA+copy+number+in+circulating+cell-free+DNA+and+extracellular+vesicles+across+cardiovascular+health+status%3A+A+prospective+case-control+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Exploring mitochondrial DNA copy number in circulating cell-free DNA and extracellular vesicles across cardiovascular health status: A prospective case-control pilot study.</a> FASEB J. 38 (10), e23672(2024).</li>
<li>Ghamrawi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Buffy+coat+DNA+Methylation+Profile+is+Representative+of+Methylation+Patterns+in+White+Blood+Cell+Types+in+Normal+Pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Buffy coat DNA Methylation Profile is Representative of Methylation Patterns in White Blood Cell Types in Normal Pregnancy.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, e782843(2022).</li>
<li>Johansson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+biomarker+profiles+in+autosomal+dominant+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Plasma biomarker profiles in autosomal dominant Alzheimer's disease.</a> Brain. 146 (3), 1132-1140 (2023).</li>
<li>Bonaterra-Pastra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+plasma+lipoprotein+composition+and+function+in+cerebral+amyloid+angiopathy+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Comparison of plasma lipoprotein composition and function in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease.</a> Biomedicines. 9 (1), 72(2021).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+cell+number+by+hemocytometry+counting%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Estimation of cell number by hemocytometry counting.</a> Cold Spring Harb Protoc. (11), prot097980(2019).</li>
<li>Cobo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosodium+urate+crystals+regulate+a+unique+JNK-dependent+macrophage+metabolic+and+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Monosodium urate crystals regulate a unique JNK-dependent macrophage metabolic and inflammatory response.</a> Cell Rep. 38 (10), e110489(2022).</li>
<li>Andrews, S. Fastqc: A quality control tool for high throughput sequence data. , 
 <a target="_blank" href=" http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/"> http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2015).</li>
<li>Corkum, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+subsets+and+their+gene+expression+profiles+from+human+PBMC+isolated+by+Vacutainer+Cell+Preparation+Tube+%28CPT%E2%84%A2%29+and+standard+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune cell subsets and their gene expression profiles from human PBMC isolated by Vacutainer Cell Preparation Tube (CPT™) and standard density gradient.</a> BMC Immunology. 16, 48(2015).</li>
<li>Golke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delays+during+PBMC+isolation+have+a+moderate+effect+on+yield+but+severely+compromise+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield but severely compromise cell viability.</a> Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).</li>
<li>Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Curr Protoc Immunol. 85 (1), 7.1.1-7.1.8 (2009).</li>
<li>Faass, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+heptose+metabolites+and+the+cag+pathogenicity+island+to+the+activation+of+monocytes%2Fmacrophages+by+Helicobacter+Pylori%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Contribution of heptose metabolites and the cag pathogenicity island to the activation of monocytes/macrophages by Helicobacter Pylori.</a> Front Immunol. 12, e632154(2021).</li>
<li>Preobrazhensky, S. N., Bahler, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomagnetic+bead+separation+of+mononuclear+cells+from+contaminating+granulocytes+in+cryopreserved+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Immunomagnetic bead separation of mononuclear cells from contaminating granulocytes in cryopreserved blood samples.</a> Cryobiology. 59 (3), 366-368 (2009).</li>
<li>Schenz, J., Obermaier, M., Uhle, S., Weigand, M. A., Uhle, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+granulocyte+contamination+from+peripheral+blood+mononuclear+cells+of+patients+with+sepsis+and+how+to+remove+it+-+A+technical+report%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Low-density granulocyte contamination from peripheral blood mononuclear cells of patients with sepsis and how to remove it - A technical report.</a> Front Immunol. 12, e684119(2021).</li>
<li>Tessema, B., Riemer, J., Sack, U., König, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+stress+assay+in+peripheral+blood+mononuclear+cells%3A+factors+influencing+its+results%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Cellular stress assay in peripheral blood mononuclear cells: factors influencing its results.</a> Int J Mol Sci. 23 (21), 13118(2022).</li>
<li>abc. Chen, X., Thibeault, S. 2013 35th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), , IEEE. 6228-6231 (2013).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+storage+temperature+on+PBMC+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">The effects of storage temperature on PBMC gene expression.</a> BMC Immunol. 17, 6(2016).</li>
<li>Ticha, O., Moos, L., Bekeredjian-Ding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+long-term+cryopreservation+of+PBMC+on+recovery+of+B+cell+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Effects of long-term cryopreservation of PBMC on recovery of B cell subpopulations.</a> J Immunol Methods. 495, e113081(2021).</li>
<li>Chao, S. -H., Price, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavopiridol+inactivates+P-TEFb+and+blocks+most+RNA+polymerase+II+transcription+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Flavopiridol inactivates P-TEFb and blocks most RNA polymerase II transcription in vivo.</a> J of Biol Chem. 276 (34), 31793-31799 (2001).</li>
<li>Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ethylenediamine+tetraacetic+acid+%28EDTA%29+as+in+vitro+anticoagulant+for+diagnostic+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes.</a> Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).</li>
<li>Mohri, M., Rezapoor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+heparin%2C+citrate%2C+and+EDTA+on+plasma+biochemistry+of+sheep%3A+Comparison+with+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of heparin, citrate, and EDTA on plasma biochemistry of sheep: Comparison with serum.</a> Res Vet Sci. 86 (1), 111-114 (2009).</li>
<li>Edwards, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin-mediated+PCR+interference+in+SARS-CoV-2+assays+and+subsequent+reversal+with+heparinase+I%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Heparin-mediated PCR interference in SARS-CoV-2 assays and subsequent reversal with heparinase I.</a> J Virol Methods. 327, 114944(2024).</li>
<li>Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+heparin+on+polymerase+chain+reaction+for+blood+white+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Lab+Anal%22%5BJournal%5D)">Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells.</a> J Clin Lab Anal. 13 (3), 133-140 (1999).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+long-term+cryopreservation+of+pluripotent+stem+cells+at+-80+%C2%A0%C2%B0C%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient long-term cryopreservation of pluripotent stem cells at -80  °C.</a> Sci Rep. 6 (1), 34476(2016).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1000 &Mikro; L Spitzen</td><td>Gilson</td><td>F174501</td><td>Ungefähr 3 Spitzen pro Patient/Behandlungsbedingung für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr><tr><td>benötigt 15 ml Röhrchen</td><td>Biopioneeer</td><td>CNT-15</td><td>Zur Aufbewahrung von Lösungen 2/3 2 pro Patient/Behandlungsbedingung für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr><tr><td>benötigt 2 mL Kryoröhrchen</td><td>Globe Scientific</td><td>3012</td><td>Ungefähr 40 Kryoröhrchen pro Patient/Behandlungszustand für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr><tr><td>20 & micro; L Spitzen</td><td>Gilson</td><td>F174201</td><td>Zur Verwendung bei der Zellzählung; das benötigte Volumen hängt von der verwendeten Methode der Zellzählung ab. 1 Spitze wird pro 1 ml nicht gepoolter gefrorener PBMCs benötigt, die aufgetaut werden</td></tr><tr><td>sollen 50 ml konisches Röhrchen</td><td>CEM Corporation</td><td>50-187-7683</td><td>2 werden pro Patient / Behandlungsbedingung für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection benötigt 3 werden pro 1 ml nicht gepoolte gefrorene PBMCs benötigt, die aufgetaut werden</td></tr><tr><td>sollen CD14-Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>325621</td><td></td></tr><tr><td>CD16 Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>360723</td><td></td></tr><tr><td>CD19 Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>363007</td><td></td></tr><tr><td>CD3 Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>300405</td><td></td></tr><tr><td>CD56 Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>318303</td><td></td></tr><tr><td>CD66b Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>305103</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb</td><td>Biopioneeer</td><td>DGN258367</td><td>1 benötigter pro 1 ml nicht gepoolter gefrorener PBMCs, die aufgetaut werden</td></tr><tr><td>sollen CPT Mononukleäres Zellvorbereitungsröhrchen</td><td>BD Biosciences</td><td>362753</td><td>6 benötigte Röhrchen pro Patient/Behandlungsbedingung für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr><tr><td>Cryo Freezer Box</td><td>Southern Labware</td><td>SB2CC-81</td><td>Fasst 81 Röhrchen 1 pro Patient/Behandlungsbedingung für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr><tr><td>Cryotube Rack Fisherbrand</td><td></td><td>05-669-45</td><td>Fasst bis zu 50 Kryoröhrchen</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td>Benötigt ca. 2,5 ml pro Patient/Behandlungsbedingung für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr><tr><td>DNase/RNasefreies destilliertes Wasser</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td> Ca<td>. 2 mL pro Patient/Behandlungsbedingung für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Benötigt ca. 9 mL pro 1 ml gefrorener PBMCs, die aufgetaut</td></tr> <tr><td>werden sollenEDTA-Röhrchen</td><td>BD Biosciences</td><td>366643</td><td>1 Röhrchen pro Patient/Behandlungsbedingung für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr><tr><td>benötigt Flavopiridol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3055-5MG</td><td></td></tr><tr><td>HLA-DR Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>307609</td><td></td></tr><tr><td>Humanserum Albumin</td><td>GeminiBio</td><td>800-120</td><td>Ungefähr 25 ml pro Patient oder Behandlungsbedingung für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection erforderlich</td></tr><tr><td>Human Trustain FcX</td><td>Biolegend</td><td>422301</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292912-1KG-K</td><td>Zur Verwendung in Mr. Frosty</td></tr><tr><td>Etikettendrucker</td><td>Phomemo</td><td>M110-WH</td><td></td></tr><tr><td>Lebendtot Fleck</td><td>Biolegend</td><td>423105</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td>Fasst bis zu 18 Röhrchen. 2 Mr. Frostys pro Patient/Behandlungsbedingung für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr><tr><td>Multidispense Pipette</td><td>Brandtech</td><td>705110</td><td></td></tr><tr><td>Multidispense Pipettenspitzen</td><td>Brandtech</td><td>705744</td><td>Ungefähr 3 Spitzen pro Patient/Behandlungsbedingung für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr><tr><td>P1000 Pipette</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td></td></tr><tr><td>P20 Pipette</td><td>Gilson</td><td>F144056M</td><td>Zur Verwendung bei der Zellzählung; das benötigte Volumen hängt von der verwendeten Methode der Zellzählung ab.</td></tr><tr><td>Druckeretiketten</td><td>Phomemo</td><td>PM-M110-3020</td><td>Benötigt werden ca. 45 Etiketten pro Patient/Behandlungsbedingung für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Benötigt ca. 5 Etiketten pro 1 ml nicht gepoolter gefrorener PBMCs, die aufgetaut werden</td></tr><tr><td>müssen RNasefreies EDTA (0,5 m)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td>Ungefähr 40 & Mikro; L benötigt pro 1 ml gefrorener PBMCs, die aufgetaut werden</td></tr><tr><td>sollen RNase-freies PBS (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td>Ungefähr 1 mL pro 1 ml gefrorener PBMCs, die aufgetaut werden sollen</td></tr><tr><td>RNasin</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td>Ungefähr 80 mL pro Patient oder Behandlungsbedingung für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr><tr><td>Transferpipetten</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-7M</td><td>Ungefähr 5 pro Patient/Behandlungsbedingung für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr><tr><td>Tube Holder</td><td>Endicott-Seymour</td><td>14-781-15</td><td>Hält bis zu 80 CPT/EDTA-Röhrchen</td></tr></tbody></table>

isolierung und kryokonservierung von hochlebensfähigen mononukleären zellen des peripheren blutes des menschen aus vollblut: ein leitfaden für einsteiger

Isolation and Cryopreservation of Highly Viable Human Peripheral Blood Mononuclear Cells From Whole Blood: A Guide for Beginners

Nach der PBMC-Entnahme und Kryokonservierung wurde die Lebensfähigkeit von aufgetauten PBMCs, Monozyten und Lymphozyten aus 56 einzigartigen Proben mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung von Reagenzien, die in Tabelle 4 aufgeführt sind, gemäß den Anweisungen des Herstellers (Abbildung 2A-F) bewertet. Es wurde eine mittlere ± SD-Viabilität von PBMCs, Monozyten und Lymphozyten von 94 ± 4,0 %, 98 ± 1,1 % bzw. 93 ± 5,6 % erreicht (Abbildung 2G). Die Viabilitätsmessung durch Trypanblau-Ausschluss ergab eine mittlere Viabilität von 88 ± 7,5 % und eine Zellzahl von 2,3 x 106 ± 1,9 x 106. Die durchflusszytometrische Analyse zeigte auch, dass lebende Monozyten 17 ± 5,9 % und Lymphozyten 53 ± 13,0 % der gesamten PBMCs ausmachten.
Anschließend wurden Monozyten aus aufgetauten PBMCs aus 59 einzigartigen Proben mittels Durchflusszytometrie sortiert und zur Bibliotheksvorbereitung und RNA-Sequenzierung eingereicht, wie an anderer Stellebeschrieben 24. Eine mittlere ± SD-Gesamtsequenzanzahl von 18,0 ± 16,3 Millionen wurde mit einem Lese-Alignment von 93 ± 6,3 % und einem GC-Gehalt von 49,6 ± 1,4 % erreicht (Abbildung 3A-B). Ein mittlerer Prozentsatz ± SD-Reads von 88 ± 3,6 % wurde mit einer Teilmenge von 56 einzigartigen Stichproben gefunden. Diese Parameter zeigen, dass hochgradig lebensfähige PBMCs, die für Downstream-Anwendungen, einschließlich hochwertiger RNA-Sequenzierung, geeignet sind, von Bedienern mit jedem Grad der Laborausbildung unter Verwendung dieses Protokolls erhalten werden können.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Bestandteil</td>
			<td>Dichte</td>
			<td>Zitat</td>
		</tr><tr><td>Plasma</td>
			<td>1,022 g/mL bis 1,026 g/mL</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Blutplättchen</td>
			<td>&lt;1,061 g/ml bis &gt;1,070 g/ml</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>PBMCs</td>
			<td>&lt;1,077 g/ml</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>Neutrophile mit niedriger Dichte*</td>
			<td>&lt;1,077 g/ml</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>Granulozyten (Neutrophile*, Basophile und Eosinophile)</td>
			<td>&gt;1,077 g/ml</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>Erythrozyten</td>
			<td>1,11 g/ml</td>
			<td>4</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Bestandteile des Vollbluts, aufgelistet in der Reihenfolge abnehmender Dichte. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagant/Werkstoff</td>
			<td>Menge (pro 6 CPT-Röhrchen und 1 EDTA-Röhrchen)</td>
			<td colspan="5">Trinkgeld</td>
			<td colspan="3">Warnhinweise</td>
		</tr><tr><td>CPT-Röhren</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="5">Etikettieren Sie entsprechend der Patienten- oder Proben-ID.</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>EDTA-Röhre</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="5">Etikettieren Sie entsprechend der Patienten- oder Proben-ID.</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Konisches 50-ml-Röhrchen</td>
			<td>2</td>
			<td colspan="5">Zusätzlich zur Patienten- oder Proben-ID 1 Röhrchen für PBMCs und 1 Röhrchen für Abfall beschriften.</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Kryo-Fläschchen</td>
			<td>39</td>
			<td colspan="5">Etikettieren Sie 30 für PBMCs, 8 für EDTA-Plasma und 1 für Buffy Coat. Es dürfen nicht alle Kryoröhrchen verwendet werden.</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Herr Frosty</td>
			<td>2</td>
			<td colspan="5">Bis zur Hälfte mit Isopropanol auffüllen und über Nacht bei -20°C vorkühlen.</td>
			<td colspan="3">Isopropanol ist ein brennbarer Reizstoff. Von Funken/Flammen fernhalten. Vermeiden Sie das Einatmen und handhaben Sie mit Handschuhen und Vorsicht.</td>
		</tr><tr><td>Flavopiridol</td>
			<td>100 μl 1000X Vorrat</td>
			<td colspan="5">Zur Herstellung von 1000X Flavopiridol-Stamm suspendieren Sie 5 mg Flavopiridol in 1,14 ml DMSO für eine Konzentration von 10 mM. Aliquotieren Sie 200 μl in einzelne Behälter und frieren Sie sie ein. Zur Verwendung einzelne Aliquote auftauen und 1:10 in DNase/RNase-freiem destilliertem Wasser verdünnen und dann als 1000X-Lösung verwenden.</td>
			<td colspan="3">Flavopiridol ist ein Reizstoff. Mit Handschuhen anfassen und pflegen.</td>
		</tr><tr><td>Lösung 1</td>
			<td>50 mL</td>
			<td colspan="5">RPMI Mittel. Um 50 mL Stammlösung herzustellen, verwenden Sie 50 mL RPMI Medium.</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Lösung 2</td>
			<td>ca. 15 mL</td>
			<td colspan="5">RPMI Medium + 12,5 % Humanserumalbumin + 1 μM Flavopiridol. Um 50 ml Stammlösung herzustellen, verwenden Sie 25 ml RPMI-Medium + 25 ml Humanserumalbumin + 50 μl 1000X Flavopiridol.</td>
			<td colspan="3">Flavopiridol ist ein Reizstoff. Mit Handschuhen anfassen und pflegen.</td>
		</tr><tr><td>Lösung 3</td>
			<td>ca. 15 mL</td>
			<td colspan="5">RPMI Medium + 11,25 % Humanserumalbumin + 1 μM Flavopiridol + 10 % DMSO. Um 50 mL Stammlösung herzustellen, verwenden Sie 22,5 mL RPMI-Medium + 22,5 mL HSA + 5 mL DMSO + 50 μl 1000X Flavopiridol.</td>
			<td colspan="3">Flavopiridol ist ein Reizstoff und DMSO ist giftig und wird leicht über die Haut aufgenommen. Mit Handschuhen anfassen und pflegen.</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: Checkliste der Reagenzien und Materialien, die für die Entnahme und Kryokonservierung von PBMCs vorbereitet und gekennzeichnet werden müssen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagant/Werkstoff</td>
			<td>Menge (pro 1 ml aliquoter gefrorener PBMCs)</td>
			<td colspan="2">Trinkgeld</td>
			<td>Warnhinweise</td>
		</tr><tr><td>Lösung 4</td>
			<td>10 mL</td>
			<td colspan="2">PBS + 2 mM EDTA Um 50 mL Stammlösung herzustellen, verwenden Sie 5 mL 10X PBS + 200 μL 0,5M EDTA + 44,8 mL DNase/RNase-freies destilliertes Wasser</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Konisches 50-ml-Röhrchen</td>
			<td>3</td>
			<td colspan="2">Zusätzlich zur Patienten- oder Proben-ID 1 Röhrchen für vorgespannte PBMCs, 1 für nachgespannte PBMCs und 1 für Abfall beschriften. Füllen Sie das Röhrchen, das mit vorgefärbten PBMCs gekennzeichnet ist, mit 9 mL Lösung 4 pro mL gefrorener PBMCs</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>1,5 mL Röhrchen</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="2">Für die Zellzählung; Etikett mit Patienten- oder Proben-ID</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>0,4% Trypanblau-Lösung</td>
			<td>ca. 20 μl</td>
			<td colspan="2">Für die Zellzählung; kann am Vortag vorzeitig in das 1,5 mL Röhrchen gegeben werden.</td>
			<td>Trypanblau ist ein Karzinogen. Mit Handschuhen anfassen und pflegen.</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 3: Checkliste der Reagenzien und Materialien, die für das Auftauen und Zählen von PBMCs vorbereitet und gekennzeichnet werden müssen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagenz/Material</td>
			<td>Menge (pro Million Zellen)</td>
		</tr><tr><td>Lebend-toter Fleck</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>Menschliches Vertrauen FcX</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>CD3 Antikörper</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>CD19 Antikörper</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>CD56 Antikörper</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>CD66b Antikörper</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>HLA-DR Antikörper</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>CD14 Antikörper</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>CD16 Antikörper</td>
			<td>2,5 μL</td>
		</tr><tr><td>RNAsin</td>
			<td>100 Einheiten</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 4: Tabelle der Reagenzien für die Isolierung von Monozyten aus PBMCs mittels Durchflusszytometrie.
<img alt="Trennung von Blutbestandteilen im Dichtegradientenzentrifugationsdiagramm; Plasma, PBMCs, Buffy-Coat-Schichten." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66794/66794fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Abbildung 1: Vollblutbestandteile, wie sie durch Zentrifugation in Dichtegradientenzentrifugation oder EDTA-Röhrchen getrennt wurden. (A) Die Zentrifugation von Vollblut in Dichtegradienten-Zentrifugationsröhrchen führt zur Trennung von Plasma, Blutplättchen und PBMCs oberhalb des Dichtegradientenmediums mit mehrkernigen und Erythrozyten unterhalb des Dichtegradientenmediums. (B) Die Zentrifugation von Vollblut in EDTA-Röhrchen führt zur Trennung von Plasma in der obersten Schicht, Erythrozyten in der unteren Schicht und dem Buffy Coat in der Grenzfläche. Erstellt mit Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66794/66794fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Streudiagramme der Durchflusszytometrie; PBMCs, Monozyten, Lymphozyten; Viabilitätsanalyse, Diagramm des Zelltyps." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66794/66794fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Abbildung 2: Die Lebensfähigkeit von aufgetauten kryokonservierten PBMCs wurde durch Lebend-/Totflussfärbung und Durchflusszytometrie bewertet. (A) Ablagerungen, die mit einem Sternchen * gekennzeichnet sind, werden durch Vorwärts- und Seitenstreuung von PBMCs ausgeschlossen. (B) Repräsentative Lebend/Tot-Analyse ganzer PBMCs (C) Pan-Monozyten werden für die folgenden FITC-markierten Oberflächenantigene als HLA-DR-positiv und -negativ gegated: CD3, CD19, CD56 und CD66b. (D) Repräsentative Lebend/Tot-Analyse von Monozyten. (E) Lymphozyten, die von den folgenden FITC-markierten Oberflächenantigenen kontrolliert werden: CD3, CD19, CD56 und CD 66b. (F) Repräsentative Lebend/Tot-Analyse von Lymphozyten. (G) Prozentuale Lebensfähigkeit jedes Zelltyps, quantifiziert aus 56 Proben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66794/66794fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="FastQC-Datenanalyse-Diagramme; Millionen Sequenzen vs. alignable GC-Inhaltsverteilung." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66794/66794fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Abbildung 3: RNA-Sequenzierungsqualität von Monozyten, die aus kryokonservierten PBMCs sortiert wurden. 56 einzigartige Proben wurden sequenziert und ein mittlerer ± SD 18,0 ± insgesamt 16,3 Millionen Sequenzen generiert. (A) Die Ausrichtung war hoch, wobei 92,5 % ± 6,3 % der Sequenzen mit dem Referenzgenom übereinstimmten. (B) Der GC-Gehalt dieser Sequenzen betrug 49,6 ± 1,4 %. Erstellt mit FastQC25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66794/66794fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzendes Video 1: Demonstration der Verwendung der Zentrifuge <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66794/66794_R1.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzendes Video 2: Demonstration der Bedienung einer Multidispenser-Pipette. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66794/66794_R2.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Isolierung und Kryokonservierung von hochlebensfähigen mononukleären Zellen des peripheren Blutes des Menschen aus Vollblut: Ein Leitfaden für Einsteiger

Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are commonly used in biomedical research on the immune system and its response to disease and pathogens. This ...

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In diesem Video demonstrieren wir die Isolierung von Monozyten aus menschlichem Vollblut durch immunomagnetische negative Trennung. Die isolierten Monozyten können für weitere nachgelagerte Analysen verwendet werden.

Isolierung von Monozyten aus Vollblut durch immunomagnetische Negativselektion

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Isolierung und Kryokonservierung von hochlebensfähigen mononukleären Zellen des peripheren Blutes des Menschen aus Vollblut: Ein Leitfaden für Einsteiger (Video) | JoVE Journal

Isolierung und Kryokonservierung von hochlebensfähigen mononukleären Zellen des peripheren Blutes des Menschen aus Vollblut: Ein Leitfaden für Einsteiger

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