Name: In vitro Modellierung der Fettablagerung bei metabolischer Dysfunktion-assoziierter steatotischer Lebererkrankung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Erfahren Sie die In-vitro-Modellierung von Fettablagerungen bei metabolischer Dysfunktion-assoziierter steatotischer Lebererkrankung mit HepG2-Zellen und Ölsäure. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Lipidakkumulationsmechanismen.

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Die aktuelle Studie wurde im Rahmen der "Studie über die Schlüsselfragen der heilenden Wirkung von Koumiss auf regionale Krankheiten der mongolischen Medizin" im Jahr 2018 des Wissenschafts- und Technologieprogramms des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie des Autonomen Gebiets Innere Mongolei gefördert.

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien, Instrumenten und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. Zellkultur
<ol><li>Kultur-HepG2-Zellen in Kulturflaschen, die Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) enthalten (enthält 10 % fötales Rinderserum [FBS], 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin). Die Kulturkolben werden in einem 5 %CO 2 - Inkubator bei 37 °C gehalten.</li>
</ol>2. Wirkung von Ölsäure auf die Lebensfähigkeit der Zellen, gemessen mit dem Zellzählkit-8
<ol><li>Ein bestimmtes Volumen OA wird in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, um eine Konzentration von 200 mM zu erreichen. Lagern Sie die Lösung für die zukünftige Verwendung bei -20 °C.</li>
	<li>HepG2-Zellen in einer 96-Well-Platte mit einer Zelldichte von 6 × 103 Zellen pro Well säen. Geben Sie 100 μl DMEM in jede Vertiefung. Inkubieren und kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem 5% CO2 -Inkubator für 24 h. Teilen Sie die HepG2-Zellen in zwei Gruppen auf:<ol><li>Kontrollgruppe: Zellkulturmedium hinzufügen.</li>
		<li>OA-Gruppe: Fügen Sie dem Zellkulturmedium OA hinzu, um Endkonzentrationen von 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM und 1 mM zu erreichen.</li>
	</ol></li>
	<li>Nach 24 Stunden anfänglicher Inkubation wird der Überstand aus jeder Vertiefung verworfen und OA entsprechend der angegebenen Gruppierung hinzugefügt, wobei 100 μl pro Vertiefung hinzugefügt werden. Für die Kontrollgruppe geben Sie 100 μl Zellkulturmedium in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen für weitere 24 Stunden. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass jede Gruppe über sechs Replikationsvertiefungen verfügt. Um eine Verdunstung zu verhindern, geben Sie 100 μl phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in den äußeren Ring der Vertiefungen in der 96-Well-Platte.</li>
	<li>Nach 24 Stunden Inkubation 10 μl Zellzählkit-8 (CCK-8) in jede Vertiefung geben, vorsichtig mischen und 2 Stunden im Dunkeln inkubieren. Nehmen Sie die 96-Well-Platte aus dem Inkubator, legen Sie sie in den Mikroplatten-Reader und messen Sie den Absorptionswert bei 450 nm (A450). Die GI50-Werte wurden entsprechend der OD gezählt.</li>
</ol>3. Öl-Rot-O-Färbung zur Beobachtung der intrazellulären Lipidtröpfchenbildung
<ol><li>HepG2-Zellen in 6-Well-Zellkulturplatten mit einer Dichte von 5 × 105 Zellen pro Well säen und die Platten in einem Inkubator mit konstanter Temperatur für 24 Stunden kultivieren. In Abbildung 1 finden Sie eine visuelle Darstellung der beschriebenen Schritte.</li>
	<li>Geben Sie nach 24 Stunden Zellkultur 2 ml OA-haltiges Zellkulturmedium in jede Vertiefung und erreichen Sie Endkonzentrationen von 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM und 1 mM. Nach weiteren 24 Stunden nehmen Sie das Zellkulturmedium aus jeder Vertiefung und waschen Sie es zweimal mit PBS. Geben Sie 1 ml ORO-Fixiermittel in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang.</li>
	<li>Bereiten Sie die ORO-Färbelösung vor, indem Sie Färbelösung A mit Färbelösung B im Verhältnis 3:2 mischen. Lassen Sie die Mischung 10 min bei Raumtemperatur stehen, dann filtrieren Sie sie einmal durch einen 0,45 μm Filter. Bewahren Sie die gefilterte Lösung bis zur Verwendung in einem lichtgeschützten Zentrifugenröhrchen auf.</li>
	<li>Entsorgen Sie das Fixiermittel und waschen Sie es zweimal mit destilliertem Wasser. Geben Sie 1 ml 60% Isopropanol in jede Vertiefung und inkubieren Sie 30 s lang. Verwerfen Sie 60 % der Isopropanollösung und geben Sie 1 ml frisch zubereitete ORO-Färbelösung in jede Vertiefung, bevor Sie sie 20 Minuten lang inkubieren. Entsorgen Sie die ORO-Färbelösung, geben Sie 1 ml 60%iges Isopropanol in jede Vertiefung und inkubieren Sie 30 s lang. 5x mit Wasser waschen, um überschüssige Farbe zu entfernen.</li>
	<li>Bedecken Sie die Zellen mit destilliertem Wasser und beobachten Sie sie unter einem Mikroskop. Sobald die Bilder aufgenommen sind, entsorgen Sie die Flüssigkeit in der Platte und lassen Sie sie trocknen. Geben Sie dann 2 ml Isopropanol in jede Vertiefung und schütteln Sie die Platte auf einem Orbitalschüttler 10 Minuten lang. Übertragen Sie die Flüssigkeit auf eine neue 96-Well-Platte mit 16 Wells in jeder Gruppe und fügen Sie 100 μl pro Well hinzu. Berechnen Sie den Lipidgehalt, indem Sie die optische Dichte (OD) jeder Vertiefung mit einem Mikroplatten-Reader bei 510 nm (A510) messen.</li>
</ol>4. Auswirkungen unterschiedlicher Konzentrationen von Ölsäure auf das Gesamttriglycerid im HepG2-Zellüberstand
<ol><li>Äquilibrieren Sie das Kit 20 Minuten lang bei Raumtemperatur und bereiten Sie die erforderlichen Platten für das Experiment vor.</li>
	<li>Den Zellüberstand auffangen und bei 1.570 × g 10 min zentrifugieren. Legen Sie Standard-Wells fest und testen Sie Proben-Wells. 50 μl Standardkonzentration ([S0 → S5], gefolgt von: 0, 0,5, 1, 2, 4, 8 mmol/l) in die Standardvertiefungen geben. Zusätzlich zu den Blind- und Standard-Wells geben Sie 10 μl verschiedener Proben in die Probenvertiefungen und fügen Sie anschließend 40 μl Probenverdünnungsmittel in jede Vertiefung hinzu. Geben Sie 100 μl Nachweis-Antikörper-Meerrettich-Peroxidase in jede Vertiefung, verschließen Sie sie mit einer Plattenmembran und inkubieren Sie sie 1 h lang bei 37 °C in einem Ofen mit konstanter Temperatur.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand, tupfen Sie ihn auf staubfreiem Papier trocken und waschen Sie jede Mulde mit 1x Waschlösung. 1 Min. bei Raumtemperatur ziehen lassen. Wiederholen Sie den Waschvorgang 5x.</li>
	<li>Geben Sie 50 μl Substrat A und 50 μl Substrat B in jede Vertiefung. Vorsichtig mischen und 15 min bei 37 °C inkubieren. Geben Sie 50 μl Terminationslösung in jede Vertiefung und messen Sie den OD-Wert jeder Vertiefung bei 450 nm (A450) innerhalb von 15 Minuten.</li>
	<li>Plotten Sie die Konzentration des Standards entlang der x-Achse und den entsprechenden Absorptionswert (OD) entlang der y-Achse, um eine lineare Regression durchzuführen, und leiten Sie die Kurvengleichung ab, um den Konzentrationswert jeder Probe zu berechnen.</li>
</ol>5. Statistische Analyse
<ol><li>Ermitteln Sie signifikante Unterschiede in quantitativen Daten.</li>
	<li>Berechnen Sie den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) und stellen Sie die Daten grafisch dar. Betrachten Sie P < 0,05 als statistisch signifikant.</li>
</ol>

Ölsäure-induzierte HepG2-Zellen für die Analyse metabolischer Erkrankungen 

<ol><li>Alisi, A., Feldstein, A. E., Villani, A., Raponi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pediatric+nonalcoholic+fatty+liver+disease%3A+a+multidisciplinary+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Pediatric nonalcoholic fatty liver disease: a multidisciplinary approach.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (3), 152-161 (2012).</li>
<li>Anania, C., Perla, F. M., Olivero, F., Pacifico, L., Chiesa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediterranean+diet+and+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Mediterranean diet and nonalcoholic fatty liver disease.</a> World J Gastroenterol. 24 (19), 2083-2094 (2018).</li>
<li>Bessone, F., Razori, M. V., Roma, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathways+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease+development+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression.</a> Cell Mol Life Sci. 76 (1), 99-128 (2019).</li>
<li>Katsiki, N., Mikhailidis, D. P., Mantzoros, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-alcoholic+fatty+liver+disease+and+dyslipidemia%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Non-alcoholic fatty liver disease and dyslipidemia: An update.</a> Metabolism. 65 (8), 1109-1123 (2016).</li>
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<li>Chalasani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+and+management+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease%3A+Practice+guidance+from+the+American+Association+for+the+Study+of+Liver+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American Association for the Study of Liver Diseases.</a> Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).</li>
<li>Díaz, L. A., Arab, J. P., Louvet, A., Bataller, R., Arrese, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intersection+between+alcohol-related+liver+disease+and+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">The intersection between alcohol-related liver disease and nonalcoholic fatty liver disease.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 20 (12), 764-783 (2023).</li>
<li>Cotter, T. G., Rinella, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonalcoholic+fatty+liver+disease+2020%3A+The+state+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Nonalcoholic fatty liver disease 2020: The state of the disease.</a> Gastroenterology. 158 (7), 1851-1864 (2020).</li>
<li>Lonardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+mechanisms+for+and+treatment+of+NAFLD+or+NASH+occurring+after+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Metabolic mechanisms for and treatment of NAFLD or NASH occurring after liver transplantation.</a> Nat Rev Endocrinol. 18 (10), 638-650 (2022).</li>
<li>Papatheodoridi, M., Cholongitas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease+%28NAFLD%29%3A+Current+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): Current concepts.</a> Curr Pharm Des. 24 (38), 4574-4586 (2018).</li>
<li>Van Herck, M. A., Vonghia, L., Francque, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease-a+starter%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Animal models of nonalcoholic fatty liver disease-a starter's guide.</a> Nutrients. 9 (10), 1072(2017).</li>
<li>Wieckowska, A., Feldstein, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease%3A+invasive+versus+noninvasive%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Liver+Dis%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease: invasive versus noninvasive.</a> Semin Liver Dis. 28 (4), 386-395 (2008).</li>
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<li>Milić, S., Lulić, D., Štimac, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-alcoholic+fatty+liver+disease+and+obesity%3A+biochemical%2C+metabolic+and+clinical+presentations%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: biochemical, metabolic and clinical presentations.</a> World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).</li>
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<li>Du, J., Zhao, L., Kang, Q., He, Y., Bi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+Oil+Red+O+staining+with+the+salicylic+acid+ethanol+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">An optimized method for Oil Red O staining with the salicylic acid ethanol solution.</a> Adipocyte. 12 (1), 2179334(2023).</li>
<li>Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+neutral+lipids+by+Oil+Red+O+for+analyzing+the+metabolic+status+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging of neutral lipids by Oil Red O for analyzing the metabolic status in health and disease.</a> Nat Protoc. 8 (6), 1149-1154 (2013).</li>
<li>Estes, C., Razavi, H., Loomba, R., Younossi, Z., Sanyal, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+epidemic+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease+demonstrates+an+exponential+increase+in+burden+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Modeling the epidemic of nonalcoholic fatty liver disease demonstrates an exponential increase in burden of disease.</a> Hepatology. 67 (1), 123-133 (2018).</li>
<li>Watkins, P. A., Ellis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomal+acyl-CoA+synthetases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Peroxisomal acyl-CoA synthetases.</a> Biochim Biophys Acta. 1822 (9), 1411-1420 (2012).</li>
<li>Heeren, J., Scheja, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic-associated+fatty+liver+disease+and+lipoprotein+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">Metabolic-associated fatty liver disease and lipoprotein metabolism.</a> Mol Metab. 50, 101238(2021).</li>
<li>Kim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+isoquercitrin+on+free+fatty+acid-induced+lipid+accumulation+in+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Effect of isoquercitrin on free fatty acid-induced lipid accumulation in HepG2 cells.</a> Molecules. 28 (3), 1476(2023).</li>
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<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hesperetin+ameliorates+hepatic+oxidative+stress+and+inflammation+via+the+PI3K%2FAKT-Nrf2-ARE+pathway+in+oleic+acid-induced+HepG2+cells+and+a+rat+model+of+high-fat+diet-induced+NAFLD%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Funct%22%5BJournal%5D)">Hesperetin ameliorates hepatic oxidative stress and inflammation via the PI3K/AKT-Nrf2-ARE pathway in oleic acid-induced HepG2 cells and a rat model of high-fat diet-induced NAFLD.</a> Food Funct. 12 (9), 3898-3918 (2021).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protopanaxadiol+ameliorates+NAFLD+by+regulating+hepatocyte+lipid+metabolism+through+AMPK%2FSIRT1+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Protopanaxadiol ameliorates NAFLD by regulating hepatocyte lipid metabolism through AMPK/SIRT1 signaling pathway.</a> Biomed Pharmacother. 160, 114319(2023).</li>
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<li>Scavo, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oleic%2Fpalmitic+acid+imbalance+in+exosomes+isolated+from+NAFLD+patients+induces+necroptosis+of+liver+cells+via+the+elongase-6%2FRIP-1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">The oleic/palmitic acid imbalance in exosomes isolated from NAFLD patients induces necroptosis of liver cells via the elongase-6/RIP-1 pathway.</a> Cell Death Dis. 14 (9), 635(2023).</li>
<li>Chavez-Tapia, N. C., Rosso, N., Tiribelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+intracellular+lipid+accumulation+in+a+new+model+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Effect of intracellular lipid accumulation in a new model of non-alcoholic fatty liver disease.</a> BMC Gastroenterol. 12, 20(2012).</li>
<li>Ricchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effect+of+oleic+and+palmitic+acid+on+lipid+accumulation+and+apoptosis+in+cultured+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes.</a> J Gastroenterol Hepatol. 24 (5), 830-840 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

MASLD ist ein klinisch-pathologisches Syndrom, das durch eine übermäßige intrazelluläre Fettablagerung in Hepatozyten gekennzeichnet ist, die auf Faktoren zurückzuführen ist, die über Alkohol und andere etablierte leberschädigende Wirkstoffe hinausgehen18. MASLD ist eng mit erworbenem metabolischem Stress und Leberschäden verbunden, insbesondere in Verbindung mit Insulinresistenz und genetischer Anfälligkeit. Um Medikamente effektiv auf MASLD zu untersuchen und zu screenen, ist es entscheidend, ein geeignetes experimentelles Modell auszuwählen. Die Etablierung eines Zellmodells ist in der MASLD-Forschung besonders wichtig, da es ein tieferes Verständnis pathologischer Mechanismen und die Bewertung neuartiger Arzneimittelwirkungen ermöglicht.
Dieses Protokoll beschreibt ein in vitro Modell von MASLD, das durch OA-induzierte HepG2-Zellen etabliert wurde. Die ORO-Färbung und die Analyse des Lipidgehalts dienen als wichtige Methoden für die Erstellung dieses Modells. Darüber hinaus ist die Beurteilung der Zellviabilität und des Gesamt-TG-Gehalts in Zellüberständen für die Bewertung der geeigneten OA-Konzentration unerlässlich. Das diagnostische Kriterium für MASLD beinhaltet das Vorhandensein von mehr als 5 % TG, die in Leberzellen gespeichert sind19,20. MASLD-Zellmodelle stützen sich hauptsächlich auf HepG2-Zellen 21,22,23,24,25,26,27,28, die für ihre erfolgreiche Verwendung bei der Konstruktion von Fettleber-Degenerationsmodellen in verschiedenen nationalen und internationalen Studien bekannt sind. Obwohl HepG2-Zellen aus Hepatomzellen stammen, teilen sie viele phänotypische Merkmale mit Hepatozyten und lassen sich leicht kultivieren und vermehren 29,30. Tests wie das CCK-8-Kit, ORO-Färbung, Lipidgehalt und Gesamt-TG-Messungen bieten einfache, objektive und vernünftige Ansätze zur Beurteilung der Zellviabilität, der Fettansammlung und des Lipidgehalts bei den Studienteilnehmern. In diesem Zusammenhang stimmt OA mit der Pathogenese von MASLD31 überein, bei der überschüssige Energie in Form von Lipiden gespeichert wird, wenn die Energieaufnahme den Verbrauch übersteigt.
Die Forscher haben OA 23,28,31,32,33, Palmitinsäure 34,35 und Kombinationen von Öl-/Palmitinsäure26,36 verwendet, um das MASLD-Modell zu replizieren. Sowohl Palmitinsäure als auch OA tragen zur Leberfettdegeneration und zur Akkumulation von TG bei. Palmitinsäure, die am häufigsten vorkommende gesättigte Fettsäure im menschlichen Körper, weist eine signifikante Lipotoxizität auf, die zu einer Lipidakkumulation in Hepatozyten, erhöhten intrazellulären reaktiven Sauerstoffradikalen und Zelltod oder Nekrose führt37. Umgekehrt führt OA zu einer ausgeprägteren intrazellulären TG-Ablagerung (Abbildung 6) und einer geringeren zellulären Modulation38. Daher verwenden Forscher häufig OA-induzierte HepG2-Zellen, um in vitro MASLD-Modelle zu erstellen. Wie im Protokollschritt 2.2.2 beschrieben, ist es entscheidend, die OA-Lösung bei der Zugabe zu erhitzen. In dieser Studie basierten die ORO-Färbung und die Analyse des Lipidgehalts auf der Lipidabscheidung von HepG2-Zellen, was die Erforschung von in vitro-Modellen von MASLD mit komplexen Mechanismen effektiv unterstützte und den Zeit- und Kostenaufwand für die Forschung reduzierte.
ORO bindet leicht tröpfchenförmig an TG und erzeugt eine orangefarbene bis rote Färbung, die auf Fett hinweist, wobei die Farbintensität von der Lipidkonzentration abhängt. Die ORO-Färbelösung ist jedoch instabil und anfällig für Ausfällungen, so dass sie für eine Vorbereitung im Voraus ungeeignet ist. Daher wurde die ORO-Färbelösung nach Protokollschritt 3.2 hergestellt, wobei Vorsichtsmaßnahmen getroffen wurden, um Lichteinwirkung während der Vorbereitung und Inkubation zu vermeiden (Protokollschritte 3.2, 3.3). Im Protokollschritt 3.5 stellt die Auswahl von Bildern zu mehreren Zeitpunkten (3-, 6-, 9- und 12-Uhr-Richtungen) eine wichtige Änderung des Experiments dar, die für die Verbesserung der Genauigkeit der Ergebnisse unerlässlich ist. Obwohl erhöhte OA-Konzentrationen das Überleben der Zellen beeinflussen und somit eine Einschränkung dieser Methode darstellen, wurde gezeigt, dass eine angemessene OA-Konzentration die Lebensfähigkeit der Zellen sicherstellt.
In dieser Studie wurde ein umfassender Ansatz verwendet, bei dem ein CCK-8-Kit, ORO-Färbung, Lipidgehaltsanalyse und Gesamt-TG-Messung verwendet wurden, um das MASLD-Modell zu etablieren und zu validieren. Das CCK-8-Kit wurde verwendet, um die Wirkung von Medikamenten auf die Zellviabilität zu bewerten, und diente als entscheidender Validierungsschritt. In Zukunft ist dieses Modell vielversprechend für das Wirkstoffscreening und die Mechanismusforschung, die darauf abzielt, die Pathogenese von MASLD zu verstehen und potenzielle therapeutische Ziele zu identifizieren. Um die Qualität der Zuverlässigkeit der Validierung weiter zu gewährleisten, werden die Expressionsniveaus der Zielproteine, die an dem Modell beteiligt sind, mittels Western Blotting und quantitativen Polymerase-Kettenreaktionsanalysen analysiert.

Die mit metabolischer Dysfunktion assoziierte steatotische Lebererkrankung (MASLD) umfasst eine Reihe von Erkrankungen, darunter einfache Steatose, nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH), Zirrhose und hepatozelluläres Karzinom 1,2,3,4,5,6, die alle auf andere Faktoren als den Alkoholkonsum zurückzuführen sind7. MASLD ist die häufigste Lebererkrankung, die durch metabolische Leberschädigung verursacht wird und fast ein Viertel der Weltbevölkerung betrifft 8,9,10,11,12. Während die genaue Pathogenese von MASLD noch nicht geklärt ist, versuchen verschiedene Theorien, ihre Entstehung zu erklären. Eine vorherrschende Auffassung deutet auf eine Abkehr von der klassischen "Two-Hit"-Theorie hin zu einem "Multiple-Hit"-Modellhin 1 hin. Im Mittelpunkt dieser Hypothesen steht die Rolle der Insulinresistenz, von der angenommen wird, dass sie für die Pathogenese von MASLD von zentraler Bedeutung ist13. Untersuchungen deuten darauf hin, dass die Insulinresistenz in den Hepatozyten zu einem erhöhten Spiegel an freien Fettsäuren führt, wodurch Triglyceride gebildet werden, die in der Leber gespeichert werden14,15.
Forscher haben sowohl In-vivo - als auch In-vitro-Modelle verwendet, um die Fettablagerung bei MASLD zu simulieren. Dennoch bleibt es eine Herausforderung, seinen Pathomechanismus vollständig zu replizieren. Trotz dieser Einschränkung waren diese Modelle maßgeblich an der Untersuchung potenzieller therapeutischer Ziele für MASLD beteiligt. Die Entwicklung eines stabilen MASLD-Modells ist jedoch von entscheidender Bedeutung. Tiermodelle sind zwar effektiv, aber zeitaufwändig und teuer, was das wachsende Interesse an in vitro Zellmodellen unterstreicht. Diese Modelle verwenden oft einzelne oder mehrere freie Fettsäuren wie Ölsäure (OA) und Palmitinsäure, um diätinduzierte MASLD nachzubilden. Unter diesen wird die humane Hepatoblastom-Zelllinie HepG2 häufig verwendet, um in vitro zelluläre Modelle von MASLD zu etablieren.
Die OA-Induktion regt HepG2-Zellen an, die Fettablagerung ähnlich wie MASLD zu replizieren, eine Methode mit einer gut etablierten Geschichte. Das Ziel dieser Studie war es, die Lebensfähigkeit, die Färbung von Oil Red O (ORO), den Lipidgehalt und den Triglyceridspiegel (TG) von HepG2-Zellen zu demonstrieren, die mit 0,25 mM OA behandelt wurden. Ziel dieses Experiments war es, weitere Beweise für die Entwicklung von MAFLD-Modellierungsstudien zu liefern.

<table><tbody><tr><td>0,22 &Mikro; m Filter</td><td>Millex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsin-EDTA (1x) Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>0,45 & Mikro; m Filter</td><td>Millex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL Krygenes Fläschchen</td><td>CORNING</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 Zellkulturflasche</td><td>CORNING</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Zellkulturplatte</td><td>CORNING</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Zellkulturplatte</td><td>CORNING</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Blutzinktivplatte</td><td>Shanghai Jing Jing Biochemisches Reagenz & Instrument Co.</td><td></td><td></td>02270113</tr><tr><td>Cell Counting Kit-8 Assays</td><td>Beijing Solarbio Science & Germany Technology Co., Ltd.&nbsp;</td><td>CA1210-1000T</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>NUAIRE</td><td>NU-5710E</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; DMSO Dimethylsulfoxid&nbsp;</td><td>Beijing Solarbio Wissenschaft & Technology Co., Ltd.&nbsp;</td><td>D8371</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>8122691</td><td></td></tr><tr><td>Enzymmarkierungsgerät</td><td>Tecan</td><td>Spark</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum, qualifizierte</td><td>Gibco</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>HepG2-Zelllinie</td><td>Peking Nordchina Chuanglian Biotechnology Research Institute (BNCC)</td><td>221031</td><td></td></tr><tr><td>Humane Triglyceride (TG) ELISA Anleitung</td><td>Nanjing Jiacheng Bioengineering Institute</td><td>20170301</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop für Zellkulturen</td><td>Leica</td><td>DMi1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Tianjin Zhiyuan Chemisches Reagenz Co.</td><td></td><td></td>2021030141</tr><tr><td>Oil Red Stain Kit, für kultivierte Zellen</td><td>Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.&nbsp;</td><td>G1262</td><td></td></tr><tr><td>Ölsäure&nbsp;</td><td>Verifizierter Lieferant - Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A502071</tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>SPSS 24.0</td><td></td><td>Statistik-Software</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro modellierung der fettablagerung bei metabolischer dysfunktion-assoziierter steatotischer lebererkrankung

In Vitro Modeling of Fat Deposition in Metabolic Dysfunction-Associated Steatotic Liver Disease

Die Prävalenz der mit metabolischer Dysfunktion assoziierten steatotischen Lebererkrankung (MASLD) ist aufgrund von Veränderungen in den Wirtschafts- und Lebensstilmustern sprunghaft angestiegen, was zu erheblichen gesundheitlichen Herausforderungen führt. In früheren Berichten wurde die Etablierung von tierischen und zellulären Modellen für MASLD untersucht und die Unterschiede zwischen ihnen hervorgehoben. In dieser Studie wurde ein zelluläres Modell erstellt, indem die Fettakkumulation in MASLD induziert wurde. HepG2-Zellen wurden mit der ungesättigten Fettsäure Ölsäure in verschiedenen Konzentrationen (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) stimuliert, um MASLD zu emulieren. Die Wirksamkeit des Modells wurde mit Hilfe von Zellzählkit-8-Assays, Ölrot-O-Färbung und Lipidgehaltsanalyse bewertet. Ziel dieser Studie war es, ein einfach zu bedienendes zelluläres Modell für MASLD-Zellen zu schaffen. Die Ergebnisse der Zellzählkit-8-Assays zeigten, dass das Überleben von HepG2-Zellen von der Konzentration der Ölsäure mit einem GI50 von 1,875 mM abhing. Die Zellviabilität in den 0,5 mM- und 1 mM-Gruppen war signifikant niedriger als in der Kontrollgruppe (P < 0,05). Darüber hinaus untersuchten die Ölrot-O-Färbung und die Lipidgehaltsanalyse die Fettablagerung bei unterschiedlichen Ölsäurekonzentrationen (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) auf HepG2-Zellen. Der Lipidgehalt der 0,25 mM-, 0,5 mM- und 1 mM-Gruppe war signifikant höher als der der Kontrollgruppe (P < 0,05). Darüber hinaus waren die Triglyceridspiegel in den OA-Gruppen signifikant höher als in der Kontrollgruppe (P < 0,05).

Wirkung von Ölsäure auf die Lebensfähigkeit der Zellen HepG2-Zellen wurden unterschiedlichen Konzentrationen von OA ausgesetzt (0 mM, 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM), was zu einer Abnahme der Zellüberlebensraten bei 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM und 1 mM im Vergleich zu 0 mM führte. Eine statistische Signifikanz wurde bei 0,5 mM (P &lt; 0,05) und 1 mM (P &lt; 0,05) im Vergleich zu 0 mM beobachtet. Die Ergebnisse des Einflusses von OA auf die Zellviabilität, wie sie mit dem CCK-8-Kit bewertet wurden, sind in Abbildung 2 dargestellt. DerGI-50-Wert für OA-behandelte HepG2-Zellen wurde mit 1,875 mM berechnet.
Oil Red O-Färbung zur Beobachtung der intrazellulären Lipidtröpfchenbildung Die ORO-Färbung ist eine häufig verwendete Methode zur Visualisierung von Lipiden 16,17. Folglich wurde die Lipidtröpfchenbildung in HepG2-Zellen, die 24 h lang mit OA inkubiert wurden, nach der ORO-Färbung unter dem Mikroskop beobachtet. Wie in Abbildung 3 und Abbildung 4 gezeigt, war die Intensität der Rotfärbung in den OA-behandelten Zellen höher als in den unbehandelten Zellen. Rote Lipidtröpfchen waren im Plasma von HepG2-Zellen nach der OA-Behandlung vorhanden, wobei die Mengen an Lipidtröpfchen und Lipiden mit steigender OA-Konzentration zunahmen (Abbildung 5).
Auswirkungen unterschiedlicher Konzentrationen von Ölsäure auf das Gesamttriglycerid im HepG2-Zellüberstand Die experimentellen Befunde, wie in Abbildung 6 dargestellt, zeigten, dass die Behandlung von HepG2-Zellen mit unterschiedlichen OA-Konzentrationen (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) im Vergleich zur Kontrollgruppe zu einem signifikanten Anstieg des TG-Gehalts des Zellüberstands in der OA-Gruppe führte (P &lt; 0,05).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66810/66810fig01.jpg"> Abbildung 1: Flussdiagramm für die Ölrot-O-Färbung. Abkürzungen: OA = Ölsäure; OD = optische Dichte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66810/66810fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66810/66810fig02.jpg"> Abbildung 2: Wirkung von Ölsäure auf die Lebensfähigkeit der Zellen, bewertet mit einem Zellzählkit-8-Assay. Jeder Balken stellt den Mittelwert ± SD dar (n = 6). *P &lt; 0,05. Abkürzung: OA = Ölsäure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66810/66810fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66810/66810fig03.jpg"> Abbildung 3: Ölrot-O-Färbebilder zu mehreren Zeitpunkten (3-, 6-, 9- und 12-Uhr-Richtungen). Die Bildung von Lipidtröpfchen wurde mit einem inversen Mikroskop für die Zellkultur bei 40-facher Vergrößerung nachgewiesen. Maßstabsleiste = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66810/66810fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66810/66810fig04.jpg"> Abbildung 4: Wirkung von Ölsäure auf Lipidtröpfchen in den Zellen, beurteilt durch Oil Red O-Färbung. Die Bildung von Lipidtröpfchen wurde mit einem inversen Mikroskop für die Zellkultur bei 40-facher Vergrößerung nachgewiesen. Maßstabsleiste = 250 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66810/66810fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66810/66810fig05.jpg"> Abbildung 5: Einfluss der Ölsäure auf den Lipidgehalt in den Zellen, beurteilt anhand des Wertes der optischen Dichte. Relative Faltungsänderungen werden in den Werten der optischen Dichte in verschiedenen Gruppen dargestellt. Jede Spalte stellt den Mittelwert ± SD dar (n = 16). *P &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66810/66810fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66810/66810fig06.jpg"> Abbildung 6: Auswirkungen verschiedener Konzentrationen von Ölsäure auf die Gesamttriglyceridspiegel im HepG2-Zellüberstand. Relative Faltungsänderungen werden im Wert der Triglyceridspiegel in verschiedenen Gruppen dargestellt. Jede Spalte stellt den Mittelwert ± SD dar (n = 3). *P &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66810/66810fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

In diesem Artikel wird die Verwendung von Ölsäure-induzierten HepG2-Zellen als Modell für eine mit metabolischer Dysfunktion assoziierte steatotische Lebererkrankung beschrieben.

In vitro Modellierung der Fettablagerung bei metabolischer Dysfunktion-assoziierter steatotischer Lebererkrankung

The prevalence of metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD) has surged due to changes in economic and lifestyle patterns, leading ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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