Name: Ein Ansatz zur Konstruktion von Multispezies-Biofilmgemeinschaften aus Rhizosphärenböden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 29 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Multispezies-Biofilmgemeinschaften aus Rhizosphärenböden konstruieren. Diese Methode etabliert synthetische Bakteriengemeinschaften als zweite Generation von Biofertilizienten für nachhaltige Landwirtschaft.

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Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (42307173 und 42107328) und dem National Key Research and Development Program (2022YFD1500202 und 2022YFF1001800). P.W, Z.X hat die Studie konzipiert. P.W, B.X, Z.C, J.X und N.Z analysierten die Daten und erstellten die Zahlen. P.W. schrieb den ersten Entwurf des Manuskripts. Z.X., R.Z. und Q.S. überarbeiteten das Manuskript.

Dieses Protokoll ist allgemein auf die Bodenmikrobiota der Rhizosphäre verschiedener Pflanzen anwendbar. Hier wird die Gurke als Beispiel verwendet. Einzelheiten zu den für die Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Isolierung von Bakterien
<ol><li>Isolierung des Rhizosphärenbodens<ol><li>Gurkenkultur<ol><li>Die Gurkensamen werden mit 75 % Ethanol und 2 % Natriumhypochlorit (NaClO) desinfiziert und anschließend in sterilem Wasser abgespült11.</li>
			<li>Lassen Sie die Samen unter sterilen Bedingungen keimen und wählen Sie diejenigen aus, die das zweiblättrige Stadium12 erreichen. Anschließend pflanzen Sie die gleichmäßig gekeimten Gurkenkeimlinge in Töpfe mit 2 kg Schwarzerde um. HINWEIS: Es werden zwei Arten von Schwarzerde von verschiedenen Standorten im Nordosten Chinas verwendet, um systematische Fehler zu reduzieren.</li>
		</ol></li>
		<li>Vorbereitung der Bodensuspension<ol><li>Bereiten Sie PBS-S-Puffer mit der Formulierung vor: 6,33 g NaH2PO4· H2O, 16,5 g Na2HPO4,7H 2O, 200 μl Silwet L-77 und 1 l destilliertes Wasser.</li>
			<li>Wenn die Sämlinge das vierblättrige Stadium12 erreicht haben, drehen Sie den Topf um und isolieren Sie die Wurzeln zusammen mit 2 mm dicker Rhizosphärenerde mit sterilisierten Handschuhen.</li>
			<li>Legen Sie die Wurzeln in 30 mL PBS-S-Puffer in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen. Nach 20 min Schütteln filtrieren Sie die Suspension durch einen 100 μm Nylon-Zellfilter, um Wurzeln und große Sedimente zu entfernen.</li>
			<li>Das Filtrat wird in ein weiteres 50 mL Zentrifugenröhrchen umgefüllt, bei 3200 x g für 15 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und bei 4 °C zwischengelagert.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Extraktion von Bakterienzellen des Rhizosphärenbodens. ANMERKUNG: Dieses Verfahren verwendet das differentielle Zentrifugationsverfahren13, obwohl das Nycodenz-Dichtegradientenzentrifugationsverfahren14 auch für diesen Schritt gilt.<ol><li>Die Bodensuspension mit einer 0,2%igen Na4P2O7-Lösung auf 500 mL verdünnen und 10 min bei 1.000 x g zentrifugieren, um zunächst Organismen vom Boden zu trennen.</li>
		<li>Den Niederschlag erneut homogenisieren, 60 s lang bei der gleichen niedrigen Geschwindigkeit zentrifugieren und den Vorgang dreimal wiederholen. Kombinieren Sie die Überstände, zentrifugieren Sie sie 20 Minuten lang bei 12.000 x g und entsorgen Sie dann den Überstand.</li>
		<li>Resuspendieren Sie das Präzipitat in 50 mL PBS-S-Puffer, der die bakterielle Zellsuspension des Rhizosphärenbodens bildet.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Sequenzierung und Identifizierung der Mikrobiota des Rhizosphären-Biofilms
<ol><li>Vorbereitung der Medien HINWEIS: Tryptische Sojabrühe (TSB) und Glyceringlutamat (MSgg) mit minimalen Salzen sind im Handel erhältlich. Die folgenden Formulierungen dienen nur als Referenz.<ol><li>Bereiten Sie das TSB-Medium mit der folgenden Formulierung vor: 15 μg/mL Trypton, 5 μg/mL Sojapepton, 5 μg/mL NaCl, pH = 7.</li>
		<li>Bereiten Sie das MSgg-Medium mit der folgenden Formulierung vor: 5 mM KH2PO4, 100 mM 3-(N-morpholino) Propansulfonsäure (MOPS), 2 mM MgCl2, 700 μM CaCl2, 50 μM MnCl2, 50 μM FeCl3, 1 μM ZnCl2, 2 μM Thiamin, 0,5 % Glycerin, 0,5 % Glutamat, 50 μg/ml Tryptophan, 50 μg/ml Phenylalanin, pH-Wert = 7.</li>
		<li>Um TSB-MSgg-Medien vorzubereiten, mischen Sie TSB-Medien mit MSgg-Medien im Verhältnis 1:1 (v/v)15.</li>
	</ol></li>
	<li>Pellicle-Biofilm-Kokultur<ol><li>Inkubieren Sie die Zellsuspension über Nacht (in der Regel 12 h) in TSB-Medium bei 30 °C, um die Bakterien zu aktivieren.</li>
		<li>Platzieren Sie 100 μm Nylon-Zellfilter auf 24-Well-Platten. Inkubieren Sie die Bakterien in TSB-Medien und richten Sie drei Wiederholungen ein. Kultivieren Sie den Pellikel-Biofilm 36 h lang bei 30 °C. HINWEIS: Wenn der Pellikel-Biofilm aus dem letzten Schritt nicht gut kultiviert ist, ist das TSB-MSgg-Medium ein wirksamer Ersatz für das TSB-Medium.</li>
		<li>Entfernen Sie den Filter, der den Pellikel-Biofilm enthält. Geben Sie 2 ml PBS-S-Puffer in eine neue 24-Well-Zellplatte, setzen Sie den 24-Well-Filter ein, um den Biofilm zu waschen, und entfernen Sie die freien Zellen. Wiederholen Sie den Waschvorgang dreimal.</li>
	</ol></li>
	<li>Extraktion der DNA des Pellikel-Biofilms<ol><li>Extrahieren Sie das Biofilm-Genom mit einem DNA-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	</ol></li>
	<li>Hochdurchsatz-Sequenzierung HINWEIS: Biotech-Unternehmen können bei der Durchführung von Sequenzierungsexperimenten für die meisten Labore helfen. Wenn eine mikrobielle Zusammensetzung in der verbleibenden Lösung benötigt wird, sequenzieren Sie sie in diesem Schritt. Der Sequenzierungsschritt variiert je nach Instrument. Bitte beachten Sie die Angaben des Herstellers. Schritt 2.4.1 dient nur als Referenz.<ol><li>Amplifizieren Sie die V3-V4-Regionen des 16S rRNA-Gens basierend auf der Datenbank mit 16S rRNA-Gensequenzen in voller Länge. Erstellen Sie Spezies-OTUs entsprechend der Mindestanzahl von Sequenzen pro Probe16. Gruppieren Sie die Annotationen zur Artenklassifizierung und ermitteln Sie die Zusammensetzung der Gemeinschaften aus jeder Stichprobe.</li>
		<li>Wählen Sie auf der Grundlage der Sequenzierungsdaten die fünf wichtigsten Stämme in Bezug auf ihre relative Häufigkeit aus.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolierung und Kultur von Bakterien mit hohem Durchsatz HINWEIS: Dieser Schritt ist nach der neuesten mikrobiologischen und bioinformatischen Methodik17 konzipiert. Für die bakterielle Isolierung steht hier das verdünnungsbeschichtete Plattenverfahren zur Verfügung, das allerdings im Vergleich zu Hochdurchsatztechniken zeitaufwändiger und weniger zielgerichtet ist.<ol><li>Mischen Sie den kultivierten Biofilm. Verwenden Sie eine begrenzende Verdünnung, um sicherzustellen, dass nicht mehr als 30 % der Vertiefungen in der 24-Well-Platte Bakterienwachstum aufweisen. HINWEIS: Um die am besten geeignete Verdünnung zu bestimmen, führen Sie vorläufige Versuche mit einem breiten Spektrum von Verdünnungsraten durch. Die optimale Verdünnung sollte nicht mehr als zwei kultivierbare Bakterien pro Milliliter enthalten, was einer bakteriellen Inkubation in weniger als 30 % der Vertiefungen entspricht.</li>
		<li>Amplifizieren Sie das 16S rRNA-Gen der Bakterien, fügen Sie Markierungen für die Vertiefungen und Platten hinzu und sequenzieren Sie sie mit der Hochdurchsatz-Illumina-Plattform17.</li>
		<li>Führen Sie bioinformatische Analysen mit kommerziell erhältlicher Software durch, um Informationen zur Reinheit und zum Artentaxonom für jede Kultur zu erhalten.</li>
		<li>Kultivieren Sie die fünf am häufigsten vorkommenden reinen Bakterien durch kontinuierliche Linienkultur und verwenden Sie Glycerin, um die Bakterien bei -80 °C zu konservieren.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Aufbau synthetischer mikrobieller Gemeinschaften
<ol><li>Rekonstruierte Biofilmkultur HINWEIS: Für Details verweisen wir auf Ren et al.18. Die 5 Stämme entsprechen 31 synthetischen Kombinationen, darunter 5 Einzelarten-, 10 Zweiarten-, 10 Dreiarten-, 5 Vierarten- und 1 Fünf-Spezies-Konsortien.<ol><li>Inkubiere die 5 Stämme im TSB-Medium, bis ihr OD600 1 erreicht, um sie zu aktivieren.</li>
		<li>Bereiten Sie mehrere 24-Well-Platten mit TSB-Medium vor und platzieren Sie 100 μm Nylon-Zellfilter darauf. HINWEIS: Wenn der Biofilm aus dem letzten Schritt nicht gut kultiviert ist, ist das TSB-MSgg-Medium ein wirksamer Ersatz für das TSB-Medium.</li>
		<li>Inkubieren Sie die 31 Kombinationen synthetischer Gemeinschaften im Medium. Stellen Sie sicher, dass die Anzahl der Bakterien in jeder Vertiefung konstant ist. Richten Sie für jede Kombination drei Wiederholungen ein.</li>
		<li>Kultivieren Sie den Biofilm bei 30 °C für 36 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantifizierung des Pellikel-Biofilms<ol><li>Gehen Sie genauso vor wie in Schritt 2.2.3.</li>
		<li>Übertragen Sie den Biofilm auf eine neue 24-Well-Platte mit 180 μl kristallvioletter Lösung und färben Sie ihn 20 Minuten lang.</li>
		<li>Übertragen Sie die gefärbte Probe auf eine weitere 24-Well-Platte mit 200 μl 96 % Ethanol, eluieren Sie sie 30 Minuten lang und messen Sie OD590.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Quantifizierung der Zellzahl der Pellicle
HINWEIS: Um den Anteil jeder Spezies und die Zellzahlen in der Pellikel und der verbleibenden Lösung zu bestimmen, ist eine quantitative PCR erforderlich. Für Details siehe Sun et al.16.
<ol><li>Entwicklung stammspezifischer Primer für die ausgewählten synthetischen mikrobiellen Gemeinschaften.</li>
	<li>Verwenden Sie Roary, um Genomvergleiche durchzuführen und die stammspezifischen Einzelkopie-Gene jedes Isolats herauszufinden. Stellen Sie sicher, dass die Primer auf diese Gene ausgerichtet sind.</li>
	<li>Ligasieren Sie die amplifizierten Fragmente zu PMD19T-Plasmiden. Generieren Sie Standardkurven mit den Plasmiden, die entsprechende Fragmente als Vorlagen enthalten.</li>
	<li>Befolgen Sie die gleichen Schritte wie in Schritt 2.2 beschrieben.</li>
	<li>Bereiten Sie die Reaktionskomponenten wie folgt vor: 7,2 μl H2O, 10 μl 2x qPCR Master Mix, 0,4 μl 10 μM jedes Primers und 2 μl Template-DNA.</li>
	<li>Führen Sie die PCR mit einem Echtzeit-PCR-Gerät unter den folgenden Bedingungen durch: 95 °C für 10 Minuten, 40 Zyklen von 95 °C für 30 s und 60 °C für 45 s, gefolgt von einem Standard-Schmelzkurvensegment.</li>
	<li>Führen Sie für jede Behandlung sechs biologische Replikate durch.</li>
</ol>

Entwicklung synergistischer Multispezies-Biofilme aus Rhizosphärenböden

<ol><li>Davey, M. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms%3A+from+ecology+to+molecular+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64 (4), 847-867 (2000).</li>
<li>Campbell, R., Greaves, M. P., Lynch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+community+structure+of+the+rhizosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Rhizosphere%22%5BJournal%5D)">Anatomy and community structure of the rhizosphere.</a> Rhizosphere. , 11-34 (1990).</li>
<li>Berendsen, R. L., Pieterse, C. M., Bakker, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rhizosphere+microbiome+and+plant+health%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">The rhizosphere microbiome and plant health.</a> Trends Plant Sci. 17 (8), 478-486 (2012).</li>
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<li>Compant, S., Clément, C., Sessitsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+growth-promoting+bacteria+in+the+rhizo-+and+endosphere+of+plants%3A+Their+role%2C+colonization%2C+mechanisms+involved+and+prospects+for+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Plant growth-promoting bacteria in the rhizo- and endosphere of plants: Their role, colonization, mechanisms involved and prospects for utilization.</a> Soil Biol Biochem. 42, 669-678 (2010).</li>
<li>Bais, H. P., Fall, R. R., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocontrol+of+Bacillus+subtilis+against+infection+of+Arabidopsis+roots+by+Pseudomonas+syringae+is+facilitated+by+biofilm+formation+and+surfactin+production%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Biocontrol of Bacillus subtilis against infection of Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production.</a> Plant Physiol. 134 (1), 307-319 (2004).</li>
<li>Trivedi, P., Leach, J. E., Tringe, S. G., Sa, T., Singh, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-microbiome+interactions%3A+From+community+assembly+to+plant+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plant-microbiome interactions: From community assembly to plant health.</a> Nat Rev Microbiol. 18, 607-621 (2020).</li>
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<li>Ren, D., Madsen, J. S., Sørensen, S. J., Burnolle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+biofilm+synergy+among+bacterial+soil+isolates+in+cocultures+indicates+bacterial+interspecific+cooperation%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">High prevalence of biofilm synergy among bacterial soil isolates in cocultures indicates bacterial interspecific cooperation.</a> ISME J. 9, 81-89 (2015).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+colonization+by+beneficial+rhizobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Root colonization by beneficial rhizobacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 48 (1), 066(2024).</li>
<li>Palková, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+microorganisms%3A+Laboratory+versus+nature%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Multicellular microorganisms: Laboratory versus nature.</a> EMBO Rep. 5, 470-476 (2004).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+communication+in+plant-microbe+beneficial+interactions%3A+a+toolbox+for+precise+management+of+beneficial+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chemical communication in plant-microbe beneficial interactions: a toolbox for precise management of beneficial microbes.</a> Curr Opin Microbiol. 72, 102269(2023).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Gemäß dem Protokoll wird eine Reihe robuster synthetischer Multispezies-Biofilmgemeinschaften aufgebaut, die auf der Mikrobiota im Rhizosphärenboden verschiedener Pflanzen basieren. Mit quantitativen PCR-Techniken wird die Zusammensetzung jeder Gemeinschaft eindeutig entschlüsselt. Die Biomasse des Biofilms deutet auf die Stärke ihrer potentiellen metabolischen Wechselwirkungen hin, wenngleich verschiedene Eigenschaften und Mechanismen hinter der Kooperation hier nicht aufgeklärt werden konnten19. Angesichts der Größe und Komplexität natürlicher mikrobieller Gemeinschaften stellen synthetische Gemeinschaften (SynComs) ein Modellsystem zur Überwindung bestehender Hindernissedar 14. Dieses Protokoll unterstreicht die systematische und grundlegende Methodik der Konstruktion synthetischer Biofilmgemeinschaften aus komplexen Rhizosphären-Bodenmikrobiota.
Aus dem letzten Teil wird deutlich, dass SQR9, XL-1 und XL-2 ein starkes Potenzial für eine stabile Besiedlung in der realen Rhizosphäre aufweisen. Forscher können damit beginnen, die metabolischen Beziehungen und Co-Besiedlungsmechanismen auf der Grundlage dieser Stämme zu untersuchen. Nachfolgende Forschungen zu mikrobiellen Impfmitteln für Gurken sind danach ebenfalls zugänglich.
Trotz der genannten Vorteile ist es wichtig, die Nachteile des Protokolls nicht zu übersehen. Aufgrund von Unterschieden zwischen Laborkulturen und In-situ-Bedingungen können die Ergebnisse der einzelnen synthetischen Gemeinschaften die Mikrobiota im realen Rhizosphärenboden möglicherweise nicht genau repräsentieren20. Eine Bestätigung durch weitere Rhizosphären-Inokulation ist notwendig. Darüber hinaus ist die Reproduzierbarkeit dieser Ergebnisse relativ schlecht. Pellicle-Biofilm-Spezies im Labor können im Vergleich zu Wildtypen im Boden über viele Generationen hinweg Mutationen durchlaufen haben, was zu einigen unkontrollierbaren Ungenauigkeiten führt.
Es gibt mehrere Alternativen zu bestimmten Schritten im Protokoll. Zum Beispiel ist in Schritt 1.2 das Nycodenz-Dichtegradienten-Zentrifugationsverfahren relativ effizienter für die Entnahme von Bodenzellproben13. Darüber hinaus wird in Schritt 2.4 durch die neueste Hochdurchsatz-Kultivierung und Identifizierung von Bakterien die experimentelle Effizienz deutlich erhöht, wenn auch mit höheren Kosten. Daher ist das traditionelle Verfahren der verdünnungsbeschichteten Platten nach wie vor für die Auswahl einiger weniger Spezies geeignet. In Schritt 3.2 schließlich kann die Biomasse des kultivierten Biofilms sowohl durch Kristallviolettfärbung als auch durch direktes Wiegen auf einer Analysenwaage beurteilt werden.
Dieses Protokoll geht über die bloße Erstellung grundlegender experimenteller Materialien für die mikrobielle und Umweltforschung hinaus. Die Identifizierung der robustesten synthetischen bakteriellen Multispezies-Biofilmgemeinschaften ist nur der erste Schritt, um das offene und komplexe Rhizosphären-Ökosystem zu entwirren. Durch die Fokussierung auf die Kernspezies von SynComs können Forschende gezielter und schneller Einblicke in reale In-situ-Situationen gewinnen. Dieser Ansatz könnte auch eine neue Perspektive für die Erforschung von Biofilmen in größerem Maßstab, wie z. B. Rhizosphären-Bodenaggregate, und für ein präzises Management der mikrobiellen Gemeinschaften der Rhizosphäre für Pflanzenwachstum und -gesundheitbieten 21.
Vor allem aber wird diese Methodik Aufschluss über die weitere Erforschung der Wechselwirkungen zwischen den Arten geben, die die Zusammensetzung und Dynamik der Bodenmikrobiota der Rhizosphäre bestimmen. Wenn es sich beispielsweise um eine komplexe Rhizosphärengemeinschaft handelt, werden andere Analysemethoden wie die Analyse von Kookkurrenznetzwerken oder die metabolische Modellierung auf Genomebene15 häufig mit diesen grundlegenden Schritten kombiniert, um künstlich eine repräsentative Biofilmgemeinschaft zu konstruieren. Dazu gehören auch Überlegungen zu den Beziehungen zwischen den Spezies.

Biofilme stellen komplizierte mikrobielle Gemeinschaften dar, die entweder an Oberflächen befestigt oder mit Grenzflächen verbunden sind. Es ist allgemein anerkannt, dass die Mehrheit der Bakterien, die in verschiedenen Umgebungen, wie z. B. natürlichen Lebensräumen, klinischen Umgebungen und industriellen Kontexten, vorkommen, in Biofilmgemeinschaften überdauern1. Im Boden bildet die Rhizosphäre, die die Wurzeloberfläche und den angrenzenden 2 mm dicken Bereich umfasst, eine ökologische Nische mit erhöhter Nährstoffverfügbarkeit. Spezifische Bakterien haben Strategien entwickelt, um diese Nische zu nutzen, die mikrobielle Proliferation zu fördern und die Bildung von Biofilmgemeinschaften in der Rhizosphäre zu fördern2.
Rhizosphären-Mikroben gelten als das "zweite Genom" von Pflanzen3. Pflanzenwachstumsfördernde Mikroorganismen (PGPM) gehen eine mutualistische Symbiose mit Pflanzen ein und bieten so eine signifikante Wachstumsförderung und biologische Schädlingsbekämpfung4. Einerseits kann PGPM die Pflanzenwurzeln mit Nährstoffen versorgen, die Nährstoffaufnahme verbessern, Krankheitserreger abwehren und Schadstoffe im Rhizosphärenboden abbauen5. Auf der anderen Seite nutzt PGPM das Ausscheiden der Pflanzenwurzeln als Nährstoffquelle für Wachstum und Evolution und beeinflusst so den Rhizosphärenboden und das Wurzelsystem durch ihren eigenen Stoffwechsel. Es ist erwähnenswert, dass die Voraussetzung für all diese Funktionen die effektive Besiedlung von PGPM in der Pflanzenrhizosphäre ist, die stabile Biofilmebildet 6.
Der Rhizosphären-Biofilm beeinflusst den Assemblierungsprozess von Rhizosphären-Mikroben, und die zeitlichen und räumlichen Eigenschaften der Rhizosphären-Mikroben-Assemblierung stehen in engem Zusammenhang mit der Interaktion von Multispezies-Biofilmen7. Es dient als Drehscheibe für Pflanzen-Mikrobiom-Interaktionen und bietet eine stabile und kontrollierbare Nische, in der sie effektiv interagieren können. Daher ist die Untersuchung des Rhizosphären-Biofilms auch eine wichtige Richtung, um Einblicke in die Interaktion zwischen Pflanzen und Mikroben zu gewinnen.
Derzeit gibt es jedoch nur wenige Forschungen zu Multispezies-Biofilmen in der Rhizosphäre. Die hohe Komplexität der Zusammensetzung des Mikrobioms macht es schwierig, grundlegende ökologische Fragen rund um natürliche mikrobielle Gemeinschaften zu beantworten8. Bei den Experimenten müssen viele Bedingungen, wie z. B. die Bodenart, die Pflanzenart und die große Anzahl mikrobieller Gemeinschaften, berücksichtigt werden. Verschiedene Faktoren schränken die Erforschung von Rhizosphären-Multispezies-Biofilmen ein.
Um Multispezies-Biofilmgemeinschaften aus Rhizosphärenböden weiter zu untersuchen, wie z.B. synergistische Wechselwirkungen zwischen den Spezies oder Metaboliten-Crossfeeding8, ist es wünschenswert, eine vereinfachte, repräsentative, stabile und handhabbare synthetische mikrobielle Gemeinschaft unter Laborbedingungen künstlich zu konstruieren 9,10. Hier kombiniert ein standardisiertes Protokoll mehrere der neuesten mikrobiologischen und bioinformatischen Techniken.

<table><tbody><tr><td>0,2 % Na4P2O7 Lösung</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.</td><td>20041418</td><td>Wird verwendet, um die Bodensuspension zu verdünnen.</td></tr><tr><td>100 μ m Nylon Zellfilter</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>F613463-0001</td><td>Zur Filterung der Kulturlösung und zur Abtrennung des Pellikel-Biofilms.</td></tr><tr><td>2% NaClO-Lösung</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd.</td><td>L03336903</td><td>Wird zum Sterilisieren der Samen verwendet.</td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>Merck &amp; Co., Inc.</td><td>PSRP010</td><td>Wird für die Mikobienkultivierung und die Trennung von Pellikel-Biofilmen verwendet.</td></tr><tr><td>3-(N-Morpholino)-Propansulfonsäure (MOPS)</td><td>Bioolook Scientific Research Special</td><td>2360010</td><td>Wird zur Herstellung von MSgg-Medien verwendet.</td></tr><tr><td>50 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd.</td><td>62.547.254</td><td>Zentrifugenröhrchen in der richtigen Größe für unser Protokoll.</td></tr><tr><td>75% C2H5OH-Lösung</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>801769680</td><td>Wird verwendet, um die Samen zu sterilisieren.</td></tr><tr><td>Acinetobacter baumannii XL-1</td><td>Nanjing Agricultural University</td><td>N/A</td><td>Stämme, die aus Rhizosphärenboden isoliert wurden.</td></tr><tr><td>Bacillus velezensis SQR9</td><td>Nanjing Agricultural University</td><td>N/A</td><td>Stämme, die aus dem Rhizosphärenboden isoliert wurden.</td></tr><tr><td>Bakterien-DNA-Kit</td><td>Nanjing Dinsi Biotechnologie Co., Ltd.</td><td>D3350020000K04U021</td><td>Wird verwendet, um bakterielle DNA zu extrahieren.</td></tr><tr><td>Schwarzerde I</td><td>Nanjing Agricultural University</td><td>N/A</td><td>Schwarze Erde aus der Provinz Jilin.</td></tr><tr><td>Black Soil II</td><td>Nanjing Agricultural University</td><td>N/A</td><td>Schwarze Erde aus der Provinz Heilongjiang.</td></tr><tr><td>Burkholderia cenocepacia XL-2</td><td>Nanjing Agricultural University</td><td>N/A</td><td>Stämme, die aus Rhizosphärenboden isoliert wurden.</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd.</td><td>10035048</td><td>Wird zum Vorbereiten von MSgg-Medien verwendet.</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.</td><td>G508009-0001</td><td>Hochgeschwindigkeits-Zentrifuge.</td></tr><tr><td>ChamQ SYBR qPCR Master Mix</td><td>Vazyme Biotech Co., Ltd.</td><td>Q311-02</td><td>Wird für die DNA-Amplifikation in der qPCR verwendet.</td></tr><tr><td></td><td>Verifizierter Lieferant - Saubere Bank Suzhou Antai Airtech Co., Ltd.</td><td>NB026143</td><td>Wird für den aseptischen Betrieb verwendet.</td></tr><tr><td>Inkubator mit konstanter Temperatur</td><td>ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd</td><td>GNP-9080BS-<img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/66926/66926eq01.jpg" style="margin: auto; "></td><td>Wird für die mikrobielle Kultivierung verwendet.</td></tr><tr><td>Cristal Violet Farbstoff</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>A600331</td><td>Wird für die Färbung und Quantifizierung von Pellikelbiofilmen verwendet.</td></tr><tr><td>Gurkensaatgut</td><td>Nanjing Agricultural University</td><td>N/A</td><td>"Jinchun I" Gurkensamen.</td></tr><tr><td>Culturome v 1.0</td><td>The Institute of Genetics and Developmental Biology der Chinesischen Akademie der Wissenschaften</td><td>N/A</td><td>Wird für die Kultivierung und Identifizierung von Rhizosphären-Bodenbakterien mit hohem Durchsatz</td></tr> verwendet <tr><td>FeCl3</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10011918</td><td>Wird zur Herstellung von MSgg-Medien verwendet.</td></tr><tr><td>Kühlschrank</td><td>Hefei Midea Kühlschrank Co., Ltd.</td><td>BCD-556WKPM(Q)</td><td>Wird zur Stammerhaltung verwendet.</td></tr><tr><td>Glutamat</td><td>Bioolook Scientific Research Special</td><td>2180020</td><td>Wird zur Vorbereitung von MSgg-Medien verwendet.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10010618</td><td>Wird zur Herstellung von MSgg-Medien verwendet.</td></tr><tr><td>Hydroponischer Pflanzkorb</td><td>Yulv Furniture Store</td><td>6526262626</td><td>Wird für Gurken-Hydrokulturen verwendet.</td></tr><tr>Verifizierter Lieferant - <td>KH2PO4</td><td>Xilong Scientific Co.,Ltd.</td><td>10017618</td><td>Wird zum Vorbereiten von MSgg-Medien verwendet.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd.</td><td>7791186</td><td>Wird zum Vorbereiten von MSgg-Medien verwendet.</td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd.</td><td>10400101</td><td>Wird zum Vorbereiten von MSgg-Medien verwendet.</td></tr><tr><td>Msgg Medium</td><td>Shanghai Bioesn Biotechnology Co., Ltd.</td><td>BES20791KB</td><td>Pellicle Biofilm-Kulturmedium.</td></tr><tr><td>Na2HPO4· 7H2O</td><td>Merck &amp; Co., Inc.</td><td>S9390-100G</td><td>Wird zur Vorbereitung von TSB-Medien verwendet.</td></tr><tr><td></td><td>Verifizierter Lieferant - NaCI Chinasun Specialty Products Co., Ltd.</td><td>HS0416</td><td>Wird zur Vorbereitung von TSB-Medien verwendet.</td></tr><tr><td>NaH2PO4· H2O</td><td>Merck &amp; Co., Inc.</td><td>S9638-25G</td><td>Wird zur Vorbereitung von TSB-Medien verwendet.</td></tr><tr>Verifizierter Lieferant - <td>PBS-S Buffer</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.</td><td>E607008-0001</td><td>Basischer Puffer für lebendes Gewebe.</td></tr><tr><td>Phenylalanin</td><td>RYON</td><td>RT3486L005</td><td>Wird zur Vorbereitung von MSgg-Medien verwendet.</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Beijing Labgic Technology Co., Ltd.</td><td>BS-1000-T</td><td>Wird für die Stamminokulation verwendet.</td></tr><tr><td>PMD19T Plasmid</td><td>Takara Biomedizinische Technologie (Beijing) Co., Ltd.</td><td>D102A</td><td>Wird zum Generieren von qPCR-Standardkurven verwendet.</td></tr><tr><td>Topf</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd.</td><td>YHHWS2401</td><td>Wird für die Gurkenbodenkultur verwendet.</td></tr><tr><td>Primer für qPCR</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.</td><td>N/A</td><td>Wird für die DNA-Amplifikation in der qPCR verwendet.</td></tr><tr><td>Echtzeit-PCR-Instrument</td><td>Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd.</td><td>4484073</td><td>Wird verwendet, um qPCR auf ausgewähltem Pellikel-Biofilm durchzuführen.</td></tr><tr><td>Roary</td><td>The Wellcome Trust SangerInstitute</td><td>N/A</td><td>Wird verwendet, um Primer für qPCR</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd</td><td>ZQTY-50S</td><td>zu entwerfen Wird zum Mischen von Lösungen und zur mikrobiellen Kultivierung verwendet.</td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Cytiva Bio-technology (Hangzhou) Co., Ltd.</td><td>SL77080596</td><td>Wird zur Vorbereitung von TSB-Medien verwendet.</td></tr><tr><td>Soja-Pepton</td><td>Qingdao Hi-Tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd</td><td>HB8275</td><td>Wird zur Vorbereitung von TSB-Medien verwendet.</td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Shanghai Yidian Analysis Instrument Co., Ltd.</td><td>76713100010</td><td>Wird für die Quantifizierung des Cristalvioletts des Pellikel-Biofilms verwendet.</td></tr><tr><td>Steriles Wasser</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd.</td><td>SW150302</td><td>Wird verwendet, um den Pellikel-Biofilm zu waschen.</td></tr><tr><td>Sterilisierte Nitrilhandschuhe</td><td>Beijing Labgic Technology Co., Ltd.</td><td>223016852LLZA</td><td>Wird für grundlegende experimentelle Operationen verwendet.</td></tr><tr><td>Vorlage DNA</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>N/A</td><td>Wird für die DNA-Amplifikation in der qPCR verwendet.</td></tr><tr><td>Thiamine</td><td>Bioolook Scientific Research Special</td><td>2180020</td><td>Wird zur Vorbereitung von MSgg-Medien verwendet.</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0042B</td><td>Wird zur Vorbereitung von TSB-Medien verwendet.</td></tr><tr><td>Tryptophan</td><td>Bioolook Scientific Research Special</td><td>2190020</td><td>Wird zur Vorbereitung von MSgg-Medien verwendet.</td></tr><tr><td></td><td>Verifizierter Lieferant - TSB Medium Guangdong Huankai Microbial Sci. &amp; Tech. Co., Ltd.</td><td>024048</td><td>Bakterielles Breitspektrum-Medium.</td></tr><tr><td>TSB-Msgg Meidium</td><td>Nanjing Agricultural University</td><td>N/A</td><td>Mischmedium für die Pellikel-Biofilmkultur mit breiterer Anwendbarkeit.</td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Nanjing Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>C0310520123</td><td>Wird zur Vorbereitung von MSgg-Medien verwendet.</td></tr></tbody></table>

ein ansatz zur konstruktion von multispezies-biofilmgemeinschaften aus rhizosphärenböden

An Approach to Constructing Multispecies Biofilm Communities from Rhizosphere Soil

Der Multispezies-Biofilm ist eine natürlich vorkommende und dominante Lebensweise von Bakterien in der Natur, auch im Rhizosphärenboden, auch wenn das derzeitige Verständnis dafür begrenzt ist. Hier bieten wir einen Ansatz an, um schnell synergistische Multispezies-Biofilmgemeinschaften zu etablieren. Der erste Schritt besteht darin, Zellen aus dem Rhizosphärenboden mit der Differenzialzentrifugationsmethode zu extrahieren. Anschließend werden diese Bodenzellen in das Kulturmedium inokuliert, um einen Pellikel-Biofilm zu bilden. Nach 36 Stunden Inkubation wird die bakterielle Zusammensetzung des Biofilms und der darunter liegenden Lösung mit der 16S rRNA-Gen-Amplikon-Sequenzierungsmethode bestimmt. In der Zwischenzeit wird die bakterielle Isolierung mit hohem Durchsatz aus dem Pellikel-Biofilm mit der limitierenden Verdünnungsmethode durchgeführt. Dann werden die Top 5 der bakteriellen Taxa mit der höchsten Abundanz in den 16S rRNA-Gen-Amplikon-Sequenzierungsdaten (Pellikel-Biofilmproben) für die weitere Verwendung bei der Konstruktion von Multispezies-Biofilmgemeinschaften ausgewählt. Alle Kombinationen der 5 bakteriellen Taxa wurden schnell mit einer 24-Well-Platte etabliert, die durch den Kristallviolett-Färbeassay für die stärkste Biofilmbildungsfähigkeit ausgewählt und durch qPCR quantifiziert wurde. Schließlich wurden die robustesten synthetischen bakteriellen Multispezies-Biofilmgemeinschaften mit den oben genannten Methoden erhalten. Diese Methodik bietet eine informative Anleitung für die Durchführung von Forschungen zum Multispezies-Biofilm der Rhizosphäre und die Identifizierung repräsentativer Gemeinschaften für die Untersuchung der Prinzipien, die die Interaktionen zwischen diesen Arten bestimmen.

Nach dem genannten Verfahren werden signifikante Gradienten in der Biofilmbildungskapazität der Gurken-Rhizosphären-Bodenmikrobiota beobachtet (Abbildung 1). Die Sequenzierung von Biofilm-Amplikonen bestätigte die Spezies im Pellikel (Abbildung 2). Basierend auf dem Heatmapping der Sequenzierungsdaten wurden die fünf wichtigsten Bakterienarten ausgewählt, deren Häufigkeit im Pellikel größer ist als die in der verbleibenden Lösung (Abbildung 3). Hier wurde eine typische Gruppe synthetischer Gemeinschaften als Beispiel genommen. Kristallviolett-Färbung und quantitative PCR visualisieren direkt die Unterschiede in der Perlikel-Biomasse und die relative Häufigkeit jeder Art in den Gemeinschaften. Eine erhöhte Kokulturbiomasse deutet auf den Erfolg der Konstruktion synergistischer Multispezies-Biofilmgemeinschaften aus Rhizosphärenboden hin (Abbildung 4 und Abbildung 5).
Die Ergebnisse zeigen, dass Bacillus velezensis SQR9, Acinetobacter baumannii XL-1 und Burkholderia cenocepacia XL-2 prominente synergistische Konsortien bilden können, wobei die robusteste Gemeinschaft aus allen drei Arten besteht. Es wird prognostiziert, dass sie einen starken Synergismus bei der Biofilmbildung aufweisen. Bemerkenswert ist auch, dass XL-1 als "Widmungsträger" dient. Es fördert die Biofilmbildung von XL-2 und SQR9, trotz seines schlechten Wachstums und seiner geringen Häufigkeit in den Konsortien (Abbildung 5). Während eine Reihe von Multispezies-Kokultur-Biofilmen einen synergistischen Phänotyp darstellen, sind einige Spezies, wie z. B. Chryseobacterium sp., immer negativ mit anderen Stämmen verwandt, indem sie die Biomasse des synthetischen Biofilms reduzieren (Abbildung 2). Obwohl dieses Phänomen nicht mit dem Ziel dieses Protokolls zusammenhängt, könnte es sich lohnen, es in Zukunft weiter zu untersuchen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig01.jpg"> Abbildung 1: Biofilmbildung verschiedener synthetischer Gemeinschaften (SynComs). Hier befinden sich die Proben in Standard-24-Well-Platten. Die Fotos werden ohne jegliche Vergrößerung aufgenommen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig02.jpg"> Abbildung 2: Bakterielle Zusammensetzung in Pellikel und Lösung. Die Diagramme basieren auf 16S rRNA-Gen-Amplikon-Sequenzierungsdaten, die in Protokollschritt 2.3 erwähnt wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig03.jpg"> Abbildung 3: Heatmap der Biofilmbildungskapazität in Pellikel und Lösung. Rot steht für die Häufigkeit des Biofilms, die höher ist als die der Lösung, und Blau steht für das Gegenteil. Gattung zeigte keinen Unterschied sind nicht dargestellt. Die Arten der Top 5 der Häufigkeit sind links angekreuzt. BB: schwarzer Biofilm; BS: Schwarze Lösung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig04v2.jpg"> Abbildung 4: Quantifizierung der Biofilmbiomasse von synthetischen Gemeinschaften in Abbildung 1. Die Daten stammen aus der Kristallviolett-Quantifizierung mit OD = 590 nm. Bei den dargestellten Daten handelt es sich um den Mittelwert ± SD, n = 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig05.jpg"> Abbildung 5: Zellzahlen und relative Häufigkeit von synthetischen Gemeinschaften in Abbildung 1. Die Daten stammen aus der quantitativen PCR. Bei den dargestellten Daten handelt es sich um den Mittelwert ± SD, n = 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Hier wird ein schnelles und standardisiertes Verfahren zur Etablierung synergistischer Multispezies-Biofilmgemeinschaften aus verschiedenen Rhizosphärenböden vorgestellt. Es handelt sich um ein einzigartiges Protokoll, das entwickelt wurde, um die komplexe Bodenmikrobiota der Rhizosphäre zu untersuchen und zu simulieren.

Ein Ansatz zur Konstruktion von Multispezies-Biofilmgemeinschaften aus Rhizosphärenböden

The multispecies biofilm is a naturally occurring and dominant lifestyle of bacteria in nature, including in rhizosphere soil, although the current ...

an-approach-to-constructing-multispecies-biofilm-communities-from

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Quelle: Miquel Guennoc, C., et al. Neue Methode zur qualitativen multiskaligen Analyse bakterieller Biofilme auf filamentösen Pilzkolonien mittels Konfokal- und Elektronenmikroskopie. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Herstellung einer Pilzkultur auf behandelten Zellophanmembranen zur Unterstützung der Koloniebildung und des radialen Wachstums. Anschließend zeigt es die Kultivierung und Vorbereitung von bakteriellen Bodenzellen für Interaktionstests. Abschließend zeigt sie, wie...

Etablierung einer pilzbakteriellen Kokultur zur Biofilmbildung

Das Ziel dieser Verfahren ist es, die Papier Verwendung eines mikrofluidischen Systems für die Entwicklung von Mehrarten Biofilmen, die typischerweise bei humanen supragingivale Plaque identifiziert Arten enthalten beschreiben. Methoden, um die Biofilmarchitektur Biofilm Lebensfähigkeit und ein Konzept für die Ernte Biofilm für kulturabhängig oder kulturunabhängige Analysen hervorgehoben zu beschreiben.

Verwendung eines Hochdurchsatz-<em&gt; In-vitro-</em&gt; Mikrofluidik-System auf die mündliche Multi-Spezies-Biofilme entwickeln

Biofilme haben komplexe Wechselwirkungen mit ihrer Umgebung. Um Biofilm-Umwelt-Wechselwirkungen umfassend zu untersuchen, stellen wir hier eine Reihe von Methoden vor, um eine heterogene chemische Umgebung für die Biofilmentwicklung zu schaffen, die lokale Strömungsgeschwindigkeit zu quantifizieren und den Stofftransport in und um Biofilmkolonien zu analysieren.

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Die Rolle des Sortiments (räumliche Trennung) in evolutionären Szenarien können mit einfachen mikrobiellen Systemen im Labor untersucht werden, die eine Anpassung der räumlichen Verteilung gesteuert ermöglichen. Durch eine Modifikation können die Gründer Zelldichte, verschiedene Sortiment Ebenen fluoreszenzmarkierte Bakterienstämme in der Kolonie Biofilme von Bacillus subtilis verwendet werden sichtbar gemacht .

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Bioreaktor-Assemblierung für die kontinuierliche Kultivierung komplexer Stuhlgemeinschaften

Erfahren Sie, wie Sie Multispezies-Biofilmgemeinschaften aus Rhizosphärenböden konstruieren. Diese Methode etabliert synthetische Bakteriengemeinschaften als zweite Generation von Biofertilizienten für nachhaltige Landwirtschaft.

Ein Ansatz zur Konstruktion von Multispezies-Biofilmgemeinschaften aus Rhizosphärenböden

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