Herstellung einer Einzelzellsuspension von Thymus-Epithelzellen der Maus und Färbung intrazellulärer Moleküle für die durchflusszytometrische Analyse

T-Zellen sind Immunzellen, die unseren Körper vor Infektionskrankheiten und Krebs schützen. Der Thymus ist ein Organ, das T-Zellen produziert und die sich entwickelnden T-Zellen entsprechend den Eigenkomponenten des Körpers auswählt. Wir interessieren uns dafür, wie der Thymus T-Zellen produziert und auswählt, die unseren Körper schützen und dennoch tolerant gegenüber dem Körper sind.

Unser Labor hat zur Analyse von Thymusepithelzellen beigetragen, die eine Schlüsselrolle bei der Produktion und Selektion von T-Zellen im Thymus spielen. Die Einzelzellanalyse von Thymusepithelzellen hat uns geholfen, den molekularen Mechanismus der Entwicklung und Selektion von T-Zellen besser zu verstehen. Thymus-Epithelzellen sind sehr vielfältig und komplex strukturiert, was ihre Isolierung zu einer Herausforderung macht.

Die derzeitige Technologie zur Isolierung von einzelligen Suspensionen ist begrenzt und verbesserungswürdig. Trotzdem verbessert die Einzelzellisolierung von Thymus-Epithelzellen unser Verständnis der molekularen Maschinerie, die an ihrer Entwicklung und Funktion beteiligt ist. Wir hoffen, dass unsere Studie zum Verständnis der Entstehung und Regeneration von Immunzellen beitragen wird.

Wir glauben, dass sie als wichtiger Eckpfeiler für die Förderung der menschlichen Gesundheit dienen wird. Nachdem Sie den Thymus aus der Maus entnommen haben, legen Sie ihn in fünf Milliliter RPMI 1640 mit 10 Millimolar HEPES in eine 60 Millimeter große Plastikschale auf Eis. Verwenden Sie unter einem Präpariermikroskop eine gebogene Pinzette mit feiner Spitze, um Blut-, Nicht-Thymus- und Fettgewebe zu entfernen.

Den Thymus mit einer Präparierschere in kleine Stücke schneiden. Übertragen Sie die Thymusstücke in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das drei Milliliter eines Milligramms pro Milliliter Kollagenase und Dispase und eine Einheit pro Milliliter DNase in RPMI 1640 enthält, das 2% FBS enthält. Inkubieren Sie das Röhrchen in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten.

Mischen Sie dann die Suspension mit einer Drei-Milliliter-Transferpipette aus Kunststoff und inkubieren Sie sie etwa 30 Minuten lang oder bis die Gewebefragmente nicht mehr zu sehen sind. Fügen Sie fünf Milliliter fünfmillimolares EDTA in HBSS mit 1 % FBS hinzu. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 60-Mikron-Nylonnetz in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen.

Zentrifugieren Sie die Suspension fünf Minuten lang bei 350 g bei vier Grad Celsius und resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern FACS-Puffer. Lagern Sie die Zellen auf Eis und bestimmen Sie die Zellzahl mit Hilfe eines Zellzählers. Nachdem Sie den Thymus einer neugeborenen Maus entnommen haben, verwenden Sie eine gebogene Pinzette mit feiner Spitze, um Blut-, Nicht-Thymus- und Fettgewebe zu entfernen.

Übertragen Sie den Thymus in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 0,2 Millilitern RPMI 1640 mit 10 Millimolar HEPES. Entsorgen Sie das Medium mit einer 200-Mikroliter-Pipette und fügen Sie dann 0,5 Milliliter 0,5 Milligramm pro Milliliter Kollagenase und Dispase und eine Einheit pro Milliliter Dnase in RPMI 1640 mit 2 % FBS hinzu. Inkubieren Sie das Rohr in einem Heizblock bei 37 Grad Celsius.

Während der Inkubation vorsichtig mit einer Ein-Milliliter-Pipette mischen. Fügen Sie nach 10 Minuten 0,5 Milliliter fünf Millimolar EDTA in HBSS mit 1 % FBS hinzu. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 60-Mikron-Nylonnetz in ein neues konisches 15-Milliliter-Rohr.

Geben Sie neun Milliliter RPMI 1640 mit 10 millimolaren HEPES in das Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei 350 g bei vier Grad Celsius und resuspendieren Sie das Pellet in ein bis drei Millilitern FACS-Puffer. Lagern Sie die Zellen auf Eis und bestimmen Sie die Zellzahl mit Hilfe eines Zellzählers.

Fügen Sie zunächst 16 mal 10 zur Leistung von 6 neonatalen oder postnatalen Maus-Thymuszellen in einem Fünf-Milliliter-Polystyrol-Rundbodenröhrchen hinzu. Die Zellsuspension wird bei 350 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert und der Überstand verworfen. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Mikrolitern Arbeitskonzentration des monoklonalen Anti-FC-Rezeptor-Antikörpers in FACS-Puffer.

Inkubieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Geben Sie jeweils 40 Mikroliter monoklonalen Anti-CD45-Antikörper, monoklonalen Anti-EpCAM-Antikörper, monoklonalen Anti-Ly-51-Antikörper und UEA-1 in FACS-Puffer. Mischen Sie den Inhalt eines Röhrchens und inkubieren Sie es 45 Minuten lang bei vier Grad Celsius.

Fügen Sie nach der Inkubation zwei Milliliter FACS-Puffer hinzu. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei 350 g bei vier Grad Celsius und resuspendieren Sie das Pellet in einem Mikroliter Ghost Dye Violet 510 Lösung. Mischen Sie den Inhalt eines Röhrchens und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius.

Geben Sie nun zwei Milliliter FACS-Puffer hinzu und zentrifugieren Sie die Zellsuspension, bevor Sie die Zellen mit einem Milliliter 2%Paraformaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur fixieren. Geben Sie 3,5 Milliliter PBS in das Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 700 g acht Minuten lang bei vier Grad Celsius und permeabilisieren Sie die Zellen mit einem Milliliter intrazellulärem Fixierungs- und Permeabilisierungspuffer.

Mischen Sie den Inhalt eines Röhrchens und inkubieren Sie es 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellsuspension und fügen Sie einen Milliliter Permeabilisierungspuffer hinzu. Zentrifugieren Sie die Suspension erneut, bevor Sie jeweils 100 Mikroliter Arbeitskonzentrationen von Anti-Beta5t-Antikörpern oder Anti-CCL21-Antikörpern hinzufügen.

60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie einen Milliliter Permeabilisierungspuffer hinzu und zentrifugieren Sie die Zellsuspension acht Minuten lang bei 700 g bei vier Grad Celsius. Fügen Sie nun 100 Mikroliter Arbeitskonzentrationen von Anti-Kaninchen-IgG hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Nach Zugabe von Permeabilisierungspuffer zentrifugieren Sie die Zellsuspension. Das Zellpellet in 200 Mikroliter FACS-Puffer resuspendieren und gut mischen. Filtern Sie die Zellsuspension vor der durchflusszytometrischen Analyse durch ein 60-Mikron-Nylonnetz.

Durchflusszytometrische Profile von Kollagenase und Dispase verdauten Thymuszellen von null Tag alten Mäusen und zwei Wochen alten Mäusen zeigten, dass über 90% der partikulären Signale lebensfähige Zellen darstellten. Fluoreszierende Signale lebensfähiger Zellen wurden durch CD45 und EpCAM repräsentiert. Während der neonatalen Stadien waren cTECs häufiger als mTECs, aber postnatal dominierten mTECs aufgrund der geringen cTEC-Freisetzungseffizienz.

Die Fixierung und Permeabilisierung von Zellen ermöglicht den Nachweis von intrazellulären Molekülen innerhalb von TECs. Die Beta5t-Expression wurde in der Mehrzahl der cTECs nachgewiesen, nicht jedoch in den mTECs. CCL21 wurde in einem Bruchteil der mTECs nachgewiesen, nicht jedoch in cTECs.

Im Vergleich dazu wurde Luft in einer Subpopulation von mTECs exprimiert.