Name: Poröse substratbasierte Elektroporation mit transepithelialer elektrischer Impedanzüberwachung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Erfahren Sie die poröse Substrat-Elektroporation mit transepithelialer elektrischer Impedanzüberwachung für Zellbiologie. Diese Methode ermöglicht präzise Substanzlieferung bei hoher Zellviabilität.

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<meta charset="utf8"></head><body>TEEI-Methode zur Elektroporationsanalyse und Verabreichungsvorhersage in A431-Zellen

<ol><li>Brooks, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+and+highly+controllable+methods+for+in+vitro+intracellular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">High throughput and highly controllable methods for in vitro intracellular delivery.</a> Small. 16 (51), e2004917(2020).</li>
<li>Stewart, M. P., Langer, R., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+delivery+by+membrane+disruption%3A+Mechanisms%2C+strategies%2C+and+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Intracellular delivery by membrane disruption: Mechanisms, strategies, and concepts.</a> Chem Rev. 118 (16), 7409-7531 (2018).</li>
<li>Canatella, P. J., Karr, J. F., Petros, J. A., Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+study+of+electroporation-mediated+molecular+uptake+and+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative study of electroporation-mediated molecular uptake and cell viability.</a> Biophys J. 80 (2), 755-764 (2001).</li>
<li>Pliquett, U., Gift, E. A., Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+electric+field+and+anomalous+heating+caused+by+exponential+pulses+with+aluminum+electrodes+in+electroporation+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochem+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Determination of the electric field and anomalous heating caused by exponential pulses with aluminum electrodes in electroporation experiments.</a> Bioelectrochem Bioenerg. 39 (1), 39-53 (1996).</li>
<li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+membrane+damage+and+cargo+delivery+in+nano-electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Cell membrane damage and cargo delivery in nano-electroporation.</a> Nanoscale. 15 (8), 4080-4089 (2023).</li>
<li>Boukany, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nat Nanotechnol. 6 (11), 747-754 (2011).</li>
<li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-%2Fnanoscale+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Micro-/nanoscale electroporation.</a> Lab Chip. 16 (21), 4047-4062 (2016).</li>
<li>Patino, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+high-throughput+localized+electroporation+workflow+with+deep+learning-based+analysis+for+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Multiplexed high-throughput localized electroporation workflow with deep learning-based analysis for cell engineering.</a> Sci Adv. 8 (29), 7637(2022).</li>
<li>Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion force microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 471-476 (1999).</li>
<li>Ishibashi, T., Takoh, K., Kaji, H., Abe, T., Nishizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+porous+membrane-based+culture+substrate+for+localized+in+situ+electroporation+of+adherent+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+Actuators+B%3A+Chem%22%5BJournal%5D)">A porous membrane-based culture substrate for localized in situ electroporation of adherent mammalian cells.</a> Sensors Actuators B: Chem. 128 (1), 5-11 (2007).</li>
<li>Mukherjee, P., Nathamgari, S. S. P., Kessler, J. A., Espinosa, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+numerical+and+experimental+investigation+of+localized+electroporation-based+cell+transfection+and+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Combined numerical and experimental investigation of localized electroporation-based cell transfection and sampling.</a> ACS Nano. 12 (12), 12118-12128 (2018).</li>
<li>Brooks, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+equivalent+circuit+model+for+localized+electroporation+on+porous+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">An equivalent circuit model for localized electroporation on porous substrates.</a> Biosens Bioelectron. 199, 113862(2022).</li>
<li>Brooks, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+electrical+impedance+increase+following+porous+substrate+electroporation+enables+label-free+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Transepithelial electrical impedance increase following porous substrate electroporation enables label-free delivery.</a> Small. 20 (25), 2310221(2023).</li>
<li>Vindiš, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+electrotransfer+into+mammalian+cells+using+commercial+cell+culture+inserts+with+porous+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Gene electrotransfer into mammalian cells using commercial cell culture inserts with porous substrate.</a> Pharmaceutics. 14 (9), 1959(2022).</li>
<li>Ye, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+with+real-time+impedance+assessment+using+a+constriction+microchannel%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation with real-time impedance assessment using a constriction microchannel.</a> Micromachines. 11 (9), 856(2020).</li>
<li>Bednarek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+methods+for+measuring+the+permeability+of+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers.</a> Methods Protoc. 5 (1), 17(2022).</li>
<li>Harhaj, N. S., Antonetti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+tight+junctions+and+loss+of+barrier+function+in+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of tight junctions and loss of barrier function in pathophysiology.</a> Int J Biochem Cell Biol. 36 (7), 1206-1237 (2004).</li>
<li>Hunter, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHunter%2C+RJ+%22Zeta+potential+in+colloid+science%3A+Principles+and+applications%22">Zeta potential in colloid science: Principles and applications</a>. 2, Academic Press. (2013).</li>
<li>Wong, P. K., Wang, T. -H., Deval, J. H., Ho, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrokinetics+in+microdevices+for+biotechnology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE%2FASME+Trans+Mechatron%22%5BJournal%5D)">Electrokinetics in microdevices for biotechnology applications.</a> IEEE/ASME Trans Mechatron. 9 (2), 366-376 (2004).</li>
<li>Qian, K., Wang, Y., Lei, Y., Yang, Q., Yao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+theoretical+study+on+cell+swelling+for+osmotic+imbalance+induced+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">An experimental and theoretical study on cell swelling for osmotic imbalance induced by electroporation.</a> Bioelectrochemistry. 157, 108637(2024).</li>
<li>Fox, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cells+in+microfluidic+devices%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cells in microfluidic devices: A review.</a> Anal Bioanal Chem. 385 (3), 474-485 (2006).</li>
</ol>

Die Elektroporation ist eine Technik, bei der Zellen einem elektrischen Feld ausgesetzt werden, wodurch temporäre Poren in der Zellmembran entstehen, durch die Frachten, einschließlich Proteine, RNA und DNA, gelangen können 1,2. Die am weitesten verbreitete Variante ist die Bulk-Elektroporation (BEP). Die BEP wird durchgeführt, indem eine Küvette mit einem Elektrolyten gefüllt wird, der Millionen von Zellen enthält, der Elektrolyt einer Hochspannung ausgesetzt wird und die Fracht durch Diffusion oder Endozytosein die Zellen gelangt 1. BEP bietet viele Vorteile, darunter einen hohen Durchsatz und zahlreiche kommerziell erhältliche Systeme. Es gibt jedoch Einschränkungen bei der BEP-Lieferung. Eine inkonsistente Zellpositionierung relativ zu den Elektroden und die Abschirmung des elektrischen Feldes von benachbarten Zellen führen zu einer signifikanten Variabilität der Exposition gegenüber elektrischen Feldern während BEP 3,4. Die für BEP erforderliche hohe Spannung hat auch einen erheblichen negativen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen5. Seit ihrer Einführung im Jahr 20116 besteht ein wachsendes Interesse an einer Elektroporationsmethode, die als poröse Substratelektroporation (PSEP) bezeichnet wird, obwohl sie manchmal auch mit anderen Namen bezeichnet wird, darunter lokalisierte Elektroporation und Nano- oder Mikroelektroporation 1,7,8. Im Gegensatz zur Zellsuspension von BEP wird PSEP an Zellen durchgeführt, die an einem porösen Substrat haften. Nicht nur, dass für die Mehrzahl der menschlichen Zelllinien9 ein adhärenter Zustand bevorzugt ist, sondern die Poren im Substrat fokussieren sich auch auf den elektrischen Strom, wodurch das elektrische Transmembranpotential (TMP) in spezifischen Regionen der Zellmembranlokalisiert wird 10,11. Diese Lokalisierung ermöglicht eine signifikante Reduzierung der angelegten Spannung, eine Verringerung der Beschädigung und eine Erhöhung der Zellviabilität. Diese Kombination von Effekten hilft, die Porenentwicklung der Zellmembran zu kontrollieren, was zu einer konsistenteren und effizienteren Abgabe führt 1,5,12.
In einer kürzlich durchgeführten Studie wurde ein PSEP-Gerät mit einem vergoldeten Elektrodenarray mit sechs Vertiefungen zum Halten von kommerziell erhältlichen porösen Membraneinsätzen13 vorgestellt (Abbildung 1A,B), eine Praxis, die erstmals von Vindis et al. eingeführt wurde14. Das Gerät kann Impulse anlegen und die elektrische Impedanz über die Zellmonoschicht, die als transepitheliale elektrische Impedanz (TEEI) bezeichnet wird, in Echtzeit messen13. Die Benutzeroberfläche des Geräts ermöglicht die vollständige Kontrolle über die Wellenform und Polarität der Elektroporation. Wichtig ist, dass Echtzeit-Impedanzmessungen verwendet werden können, um die Verabreichungsergebnisse vorherzusagen, ohne dass teure Reagenzien oder Fluoreszenzmarker erforderlich sind, ein Konzept, das als markierungsfreie Verabreichung bekannt ist15.
Die PSEP-Plattform besteht aus zwei großen kundenspezifischen elektrischen Komponenten: dem Hauptkörper des Geräts, in dem sich der Impulsgenerator und die TEEI-Messgeräte befinden, und dem Elektrodenarray, in das die porösen Substrate eingebracht werden und die Elektroporation stattfindet. Diagramme für alle kundenspezifischen Elektronikgeräte und 3D-gedruckten Komponenten finden Sie auf GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI. Neben der kundenspezifischen Elektronik ist auch ein Computer erforderlich, damit die Plattform ordnungsgemäß funktioniert. Die benutzerdefinierte Software erfordert MATLAB (Version 2021a oder höher), um ausgeführt zu werden, und Microsoft Excel, um Daten für die Analyse zu speichern und darauf zuzugreifen. Das Programm steuert die kundenspezifische Elektronik und stellt die grafische Benutzeroberfläche (GUI) zum Anpassen von Einstellungen zur Verfügung. Diese Programme wurden auch auf GitHub zur Verfügung gestellt: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI.
Vorläufige Daten deuten darauf hin, dass dieser Prozess für verschiedene Arten von adhärenten Zellen möglich ist (Abbildung 1C), aber in diesem Artikel wird nur die Präparation von A431-Zellen unter Verwendung von Parametern behandelt, die von Brooks et al. als optimal für diese Zelllinie befunden wurden.13. Da die Propidiumiodid (PI)-Fracht zytotoxisch ist, werden außerdem zwei Experimente durchgeführt, das erste mit einem hochkonzentrierten PI-Transfektionsmedium zur Quantifizierung der Verabreichungseffizienz und das zweite nur mit Zellkulturmedien zur Messung von TEEI über längere Zeiträume. Bei diesen Experimenten werden identische Elektroporationswellenformen verwendet, so dass die Ergebnisse korreliert werden können (Abbildung 1D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66971/66971fig01.jpg"> Abbildung 1: Montagediagramm des Elektrodenarrays und grundlegende Daten. (A) CAD-Modell eines Einsatzes in einer Vertiefung des Elektrodenarrays. (B) CAD-Modell des Elektrodenarrays. (C) Impedanzerhöhung aufgrund von PSEP für ausgewählte Zelllinien, n = 3 pro Zelllinie. Fehlerbalken: Standardfehler des Mittelwerts. (D) Liefereffizienz vs. TEEI erhöhen die Korrelationsdaten. Die Verabreichungseffizienz wurde berechnet, indem die Anzahl der Zellen, die sowohl in PI- als auch in Calstein-Bildern aus Verabreichungsexperimenten markiert waren, durch die Gesamtzahl der mit Hoechst identifizierten Zellen dividiert wurde. Die Zellzahl wurde mit einer benutzerdefinierten CellProfiler-Pipeline bestimmt, n = 6 pro Spannung. Fehlerbalken: (x- und y-Achse) Standardfehler des Mittelwerts. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Brooks et al.13 übernommen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66971/66971fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table><tbody><tr><td>15 mL konisches Zentrifugenröhrchen</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>2-Chip-Einweg-Hämozytometer</td><td>Bulldog Bio</td><td>DHC-N01</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Gewebekulturflasche</td><td>Fisherbrand</td><td>FB012937</td><td></td></tr><tr><td>A431 Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1555</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Invitrogen</td><td>C3099</td><td></td></tr><tr><td>Klasse II Typ A2 Biosicherheitswerkbank</td><td>Labgard</td><td>NU-543-600</td><td></td></tr><tr><td>Custom Components</td><td>YangLab</td><td></td><td>https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI</td></tr><tr><td>Einweg-Zentrifugenröhrchen (50 ml)</td><td>fisherbrand</td><td>05-539-6</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>A5670401</td><td></td></tr><tr><td>Flüssigkeitsabsaugsystem</td><td>vacuubrand</td><td>20727403</td><td></td></tr><tr><td>HERACELL 240i</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026331</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Menschliches Plasma-Fibronektin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FIBRP-RO</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Fluoreszenzmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>491916-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Labomed</td><td>TCM 400</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>cytiva</td><td>SH30256.02</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Röhrchen 200 & Mikro; L</td><td>Sarstedt</td><td>72.737</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Pipette (0,2-2 &micro; L)</td><td>fisherbrand Elite</td><td>FBE00002</td><td></td></tr><tr><td>Pipette (100-1000 & Mikro; L)</td><td>fisherbrand Elite</td><td>FBE01000</td><td></td></tr><tr><td>Pipette (20-200 & Mikro; L)</td><td>fisherbrand Elite</td><td>FBE00200</td><td></td></tr><tr><td>Pipette (2-20 & Mikro; L)</td><td>fisherbrand Elite</td><td>FBE00020</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodid</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Reaktionsröhrchen 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.300</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 16R Zentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004240</td><td></td></tr><tr><td>Thincert (24-Well)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662 641</td><td>0,4 &Mikro; M Porendurchmesser, 2x106 cm-2 Porendichte, transparente</td></tr><tr><td>PET-Gewebekulturplatte (24-Well)</td><td>fisherbrand</td><td>FB012929</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20mL</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15090046</td><td></td></tr></tbody></table>

poröse substratbasierte elektroporation mit transepithelialer elektrischer impedanzüberwachung

Porous Substrate-Based Electroporation with Transepithelial Electrical Impedance Monitoring

Das vorliegende Protokoll etabliert eine Methode zur Verwendung von TEEI-Messungen, um die Zwischenprozesse der Elektroporation zu untersuchen und Vorhersagen über die Verabreichung zu treffen, insbesondere für die A431-Zelllinie und die PI-Fracht. Während die Modifikation dieses Protokolls in diesem Artikel weiter diskutiert wird, ist es wichtig zu beachten, dass sich die spezifischen Werte zwar ändern können, die allgemeinen Trends in der Reaktion jedoch konsistent bleiben. Zum Beispiel entsprechen TEEI-Daten, die unter den ursprünglichen Ausgangswert fallen, dem Zelltod, während der maximale Anstieg des TEEI-Werts über dem Minimum der Verabreichungseffizienzentspricht 13. Diese allgemeinen Trends und ihre Auswirkungen werden im Folgenden untersucht.
Wie in Abbildung 2A gezeigt, können bei der Verwendung der PSEP-Plattform eine Reihe von TEEI-Mess- und Zellbildgebungstrends auftreten. Das ideale Ergebnis dieses Protokolls besteht darin, eine Kurve zu erzeugen, die den optimierten gesunden Daten in Abbildung 2Ai ähnelt. Dies wird als ideales Ergebnis bezeichnet, da es keinen Einbruch unter den Ausgangswert gibt, was auf einen sehr geringen oder gar keinen Zelltod hinweist. Darüber hinaus weist die optimierte fehlerfreie Kurve den größten Anstieg des TEEI vom Minimum aus auf, was auf ein hohes Maß an Liefereffizienzhinweist 13. Diese Schlussfolgerungen werden durch die Post-PSEP-Bildgebung der Zellmonoschicht unterstützt, die einen vernachlässigbaren Zelltod und eine gesunde, vollständig konfluente Zellmonoschicht zeigt (Abbildung 2Aiii). Darüber hinaus kann ein erfolgreiches Verabreichungsexperiment mit identischen PSEP-Wellenformen durch die in Abbildung 2B gezeigten Bilder charakterisiert werden. Die richtige Anwendung der Elektroporationswellenform und die Ladungskonzentration führen zu einem hohen Maß an Verabreichungskonsistenz und Zellviabilität.
Die Gesundheit und Konfluenz der Zellmonoschicht sind entscheidend für die erfolgreiche Anwendung von TEEI-basierten Verabreichungsvorhersagen16,17. Selbst bei einer optimierten Wellenform führt eine ungesunde oder unvollständige Zellmonoschicht zu einer verminderten TEEI-Antwort, wie die optimierten ungesunden Daten in Abbildung 2Aii zeigen. Es ist jedoch zu beachten, dass die Bilder für dieses Ergebnis (Abbildung 2Avi) immer noch der Interpretation der TEEI-Antwort von Brooks et al. entsprechen.13. Es gibt keinen Einbruch unter den Ausgangswert, was auf einen Zelltod nahe Null hinweist (Abbildung 2C,D). Darüber hinaus wirkt sich die reduzierte Erhöhung gegenüber dem Minimum negativ auf die Verabreichungseffizienz aus, da weniger Zellen in der Monoschicht die Gesamt-PI-Abgabe reduzieren (Abbildung 2C,D).
Wenn eine nicht optimierte Wellenform angewendet wird, ist es möglich, eine noch deutlichere Abnahme der TEEI-Reaktion zu erzielen. Abhängig von der Gesamtenergie und dem Zeitrahmen, in dem sie angewendet werden, können unoptimierte Wellenformen zu Ergebnissen führen, die von einer verminderten Effizienz bis hin zur nahezu vollständigen Vernichtung der Zellmonoschicht reichen (Abbildung 2Ai,iii,v). Sowohl die unoptimierte als auch die sehr unoptimierte Kurve zeigen einen signifikanten Rückgang gegenüber dem Ausgangswert, was auf einen erheblichen Zelltod hindeutet. Zunehmend unoptimierte Wellenformen behindern jedoch die Zellregeneration, was zu einer verminderten Verabreichungseffizienz führt.
Die Verabreichungseffizienz wurde berechnet, indem die Anzahl der Zellen, die sowohl in PI- als auch in Calstein-Bildern aus Verabreichungsexperimenten markiert waren, durch die Gesamtzahl der mit Hoechst identifizierten Zellen dividiert wurde. Der Tod wurde berechnet, indem die in TEEI-Messexperimenten mit PI markierten Zellen durch die Gesamtzahl der mit Hoechst identifizierten Zellen dividiert wurden. Die Zellenanzahl wurde mithilfe einer benutzerdefinierten CellProfiler-Pipeline für beide Metriken bestimmt.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66971/66971fig02.jpg"> Abbildung 2: TEEI-Reaktionskurven und Bildgebung für häufige Bedingungen. (A) (i) TEEI-Antwortdaten, die die prozentuale TEEI-Änderung für optimierte und nicht optimierte Bedingungen veranschaulichen. (ii) Vergleich der TEEI-Reaktion zwischen gesunden und ungesunden Monoschichten unter optimierten Wellenformbedingungen. iii-v) Repräsentative Bildgebung potenzieller Ergebnisse für optimierte und nicht optimierte Wellenformbedingungen, die Zelltod (rot) und lebende Zellen (grün) zeigen. (vi) Repräsentative Bildgebung einer ungesunden Monoschicht nach Anwendung optimierter Wellenformbedingungen, die den Zelltod (rot) und lebende Zellen (grün) zeigen. (B) Bilder, die die erfolgreiche PI-Verabreichung (rot), lebende Zellen (grün) und Zellkernpositionen (blau) zeigen. Alle Bilder werden zur besseren Schärfe aufgehellt. Maßstabsbalken: 1000 μm. (C) TEEI-Abnahme vom Ausgangswert vor dem PSEP auf das Minimum nach dem PSEP und Anstieg vom Minimum nach dem PSEP auf den Spitzenwert nach dem PSEP für gegebene Spannungen. (D) Übertragungseffizienz und Zelltodprozentsätze für gegebene Spannungen. Fehlerbalken stellen das SEM dar (n = 6). (C,D) Reproduktion von Brooks et al.13 mit Genehmigung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66971/66971fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Poröse substratbasierte Elektroporation mit transepithelialer elektrischer Impedanzüberwachung

Porous substrate electroporation (PSEP) is an emerging method of electroporation that provides high throughput and consistent delivery. Like many other ...

porous-substrate-based-electroporation-with-transepithelial

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

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Aufschluss über die elektromechanische Steuerung der Gewebehomöostase mit einem zweischichtigen mikrofluidischen Gerät

Erfahren Sie die poröse Substrat-Elektroporation mit transepithelialer elektrischer Impedanzüberwachung für Zellbiologie. Diese Methode ermöglicht präzise Substanzlieferung bei hoher Zellviabilität.

Poröse substratbasierte Elektroporation mit transepithelialer elektrischer Impedanzüberwachung

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