Name: Immunmetabolische Schaltkreise in der Infektion zur Weiterentwicklung wirtsgerichteter Therapien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Erfahren Sie, wie tetracyclin-kontrollierbare synthetische Schaltkreise bei Leishmania major-Infektionen Parasitenelimination und Zytokinexpression modulieren. Diese Methode ermöglicht innovative wirtsgerichtete Therapien.

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Die Autoren danken dem Direktor des Biotechnology Research and Innovation Council - National Centre for Cell Science (BRIC-NCCS) in Pune für die Unterstützung unserer Forschung und der BRIC-NCCS Bioinformatics Facility.

Entwicklung von Tetracyclin-gesteuerten synthetischen Schaltkreisen für die Leishmaniose-Therapie

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die erzielten Ergebnisse unterstreichen die Effizienz der Pipeline, die für das Design und die Implementierung eines synthetischen Kreislaufs kanalisiert wurde. Der Aufbau dieses synthetischen Schaltkreises war ein Schritt zur Entwicklung der Präzisionsmedizin für Infektionskrankheiten wie Leishmaniose. Durch die in silico Assemblierung genetischer Teile und deterministische Simulation wurde die ausgeprägte modulatorische Wirkung des TetON-Systems überwacht. Der Effekt der Schaltung könnte insbesondere zur reziproken bistabilen Expression von TetR und SDHA/GFP geführt haben. Die Expression von SDHA war periodisch, was darauf hindeuten könnte, dass die Expression nur in Gegenwart von Doxycyclin erhöht war. Um mögliche Veränderungen der Expressionsmuster über einen Zeitraum zu beobachten, wurde eine Zeiteinheit von 100 gewählt. Die Ergebnisse zeigen, dass der synthetische Schaltkreis ein periodisches Verhalten für TetR und SDHA/GFP zeigte, was wahrscheinlich auf seine orthogonale Natur zurückzuführen ist21. Die Zusammenstellung genetischer Teile aus dem iGEM-Teileregister spielte eine zentrale Rolle, da sie genetische Komponenten lieferte, die für den Aufbau synthetischer Schaltkreise erforderlich waren22. Die modulare Anordnung der genetischen Teile ist unerlässlich, da die Translation und Funktion des Schaltkreises beeinträchtigt werden können, was zu einer ineffizienten Expression und modulatorischen Wirkung in Zellen führen kann23.
Die Einfügegröße des synthetischen Schaltkreises betrug ungefähr 1,3 kb, um sicherzustellen, dass die Größe des Vektors nicht zu groß ist, was möglicherweise die Transformationseffizienzverringern könnte 24. Die Auswahl eines geeigneten Vektors ist ein kritischer Schritt, da er genetische Teile besitzen muss, die für die Erhöhung der Kopienzahl im bakteriellen System und die Erzielung einer hohen Plasmidkopie unerlässlich sind, und seine Expressionsmaschinerie muss sich im Säugetiersystem gut anpassen25. Der pEGFP-N1-Vektor ist in der RAW264.7-Zelllinie gut charakterisiert und besitzt eine kompakte Plasmidstruktur mit einer multiplen Klonierungsstelle26. Für die Plasmidisolierung wurden laborstandardisierte Pufferlösungen verwendet, um die Produktion von hochkonzentrierten und reinen Plasmiden zu gewährleisten, was durch spektrophotometrische Schätzung und AGE validiert wurde. Die Insertion des synthetischen Schaltkreises in den pEGFP-N1-Vektor wurde durch Restriktionsverdau validiert, und die Proben wurden mittels AGE und Sequenzierung analysiert. Die AGE-Ergebnisse stellten eine 1,3-kb-Bande des Inserts, eine 4,7-kb-Bande des pEGFP-N1-Vektors und eine 6-kb-Bande des gesamten synthetischen Schaltkreises dar. 
Es wurde eine Transfektion mit einem Verhältnis von 1:1, 1:2 und 2:1 von DNA:PEI durchgeführt, wobei das beobachtete Verhältnis von 1:1 am besten funktionierte, ohne die Zellmorphologie zu stören (Daten nicht gezeigt). Es wird empfohlen, eine Konzentration von 400 μg/ml bis 1000 μg/ml von G418 für die Selektion von transfizierten Zellenzu verwenden 27. Für die Selektion von transfizierten Zellen wurde eine Dosis von 500 μg/ml G418 verwendet, da es das Wachstum von nicht transfizierten Zellen wirksam unterdrückte, ohne das Zellwachstum oder die Morphologie der transfizierten Zellen zu beeinträchtigen (Daten nicht gezeigt). Angesichts der Bedeutung des Zellphänotyps für die Transfektionseffizienz, insbesondere bei Makrophagen-Zelllinien, die eine Differenzierung durchlaufen können und schwer zu transfizieren sind, wurde eine niedrige Passagezahl der RAW264.7-Zelllinie für die Transformation verwendet28. Die Anzahl der Zellpassagen könnte auch ein kritischer Faktor für die Effizienz der Transfektion sein. Eine hohe Passagezahl kann zu einer ineffizienten Transfektionführen 29. Dox ist aufgrund seiner hohen Bindungseffizienz an TetR, der günstigen Gewebeverteilung, der geringen Toxizität und einer Halbwertszeit von 24 h30 der bevorzugte Induktor für das Tet-ON-Induktionssystem. Nach der Transfektion wurden die Zellen 24 h lang mit Dox induziert und auf ihre GFP-Expression hin beobachtet. Für RAW264.7-Zellen betrug die Dox-Konzentration, die für die Induktion synthetischer Schaltkreise verwendet wurde, 1 μg/ml, was im empfohlenen Bereich von 1-2 μg/mlliegt 31 (Daten nicht gezeigt). Die Regulation der SDHA-Konzentration nach der Induktion war jedoch unbestimmt. Insgesamt sind die Bestimmung und Standardisierung der Zellpassagenzahl, der DNA:PEI-Konzentration, der Transfektionsmarkerkonzentration bei Säugetieren und der Doxycyclin-Induktionskonzentration entscheidende Faktoren im Transfektionsprozess.
Nach der Induktion des synthetischen Schaltkreises nach der Infektion zu verschiedenen Zeitpunkten wurde eine signifikante Verringerung der intrazellulären Parasitenlast beobachtet. Ein Vergleich der Parasitenlast zwischen infizierten und IMTI-Proben ergab eine geringere Belastung in den Zellen, die durch den synthetischen Schaltkreis induziert wurde, was wahrscheinlich auf die SDHA-Expression zurückzuführen ist. Da die SDHA-Expression mit der NO-Produktion assoziiert ist, wurde beobachtet, dass IMTI-Zellen eine unregelmäßige und grobe morphologische Form aufweisen, die in der RAW264.7-Zelllinie auftritt, wenn NO produziert wird32. Die IL-10- und IL-12-Spiegel nach einer 6-stündigen Infektion waren am höchsten, da berichtet wurde, dass beide Zytokine zu diesem Zeitpunkt hochreguliert sind, was einer weiteren phänotypischen Modifikation unterliegt, um IL-10 mehr als IL-12zu produzieren 19. Da sich die IL-10- und IL-12-Spiegel nach der Transfektion und in IMTI-Proben nicht signifikant veränderten, wurde ein Zytokin-Profiling durchgeführt, um proinflammatorische und entzündungshemmende Zytokinreaktionen nachzuweisen. 
Die Expressionsniveaus von TNF-α, IFN-γ und TGF-β wurden in 6-stündigen Infektions-, IMT- und 24-stündigen IMTI-Proben identifiziert. Um intrazelluläre Parasiten zu eliminieren, sind TNF-α und IFN-γ hauptsächlich essentiell, da sie oxidative Ausbrüche durch NO-Produktion induzieren. M2-polarisierte Makrophagen exprimieren TGF-β, das proinflammatorische Zytokine herunterreguliert33. Die 24-Stunden-IMTI-Probe zeigte eine erhöhte TNF-α- und IFN-γ-Expression als TGF-β, was darauf hindeutet, dass die Makrophagen nach Transfektion und Infektion mit L. major zu einem proinflammatorischen Zytokin-exprimierenden Phänotyp polarisiert haben könnten. Die Studie gibt daher Einblick in die phänotypischen Veränderungen, die bei der Transfektion mit einem synthetischen Schaltkreis induziert werden, und beleuchtet die Infektionsdynamik. Die Wirkung der synthetischen Schaltkreise als Therapeutikum kann untersucht werden, da ihre Induktion die proinflammatorische Zytokinexpression im Vergleich zu antiinflammatorischen Zytokinen signifikant erhöht hat. So etablierte die Studie nicht nur den Aufbau und die Verabreichungspipeline des synthetischen Schaltkreises, sondern demonstrierte auch ihr therapeutisches Potenzial in einem Leishmaniose-Modell durch die Hochregulierung von proinflammatorischen Zytokinen in Leishmaniose-Wirtszellen.

Die Weiterentwicklung der ganzheitlichen, integrativen Medizin ist ein bedeutender Zusammenhang, der zwischen metabolischen Veränderungen in Immunzellen und ihrer Fähigkeit, den Immunzellphänotyp bei Infektionskrankheiten zu modulieren, identifiziert wurde. Der Immunstoffwechsel bietet neue Perspektiven für die Aufklärung der Pathogenese der beim Menschen weit verbreiteten Infektionskrankheiten. Darüber hinaus bietet sie vielversprechende Techniken für die Entwicklung von Impfstoffen und Medikamenten, indem sie neue Ziele für Interventionen identifiziert1. Die metabolische Reprogrammierung von Immunzellen wird bei verschiedenen Infektionskrankheiten, einschließlich Leishmaniose, festgestellt. Leishmania spp. ist verantwortlich für die Entstehung von Leishmaniose, von der Leishmania major (L. major) kutane Leishmaniose (CL) verursacht. L. Hauptparasiten haben einen signifikanten Einfluss auf den Stoffwechsel von Wirtszellen, insbesondere in Makrophagen, für die Proliferation und das Überleben als intrazelluläre Parasiten2. Makrophagen können typischerweise in entweder klassisch aktivierte (M1) oder alternativ aktivierte (M2) Untergruppen polarisieren, wobei M1-Zellen eine hohe proinflammatorische Zytokinsekretion und Produktion von Stickstoffmonoxid (NO) durch den Metabolismus von Stickstoffspezies besitzen. M2-Zellen weisen erhöhte Spiegel an entzündungshemmenden Zytokinen auf und weisen eine hohe Arginase-Aktivität durch den Stickstoffstoffwechselauf 3. Beide Phänotypen unterscheiden sich also nicht nur durch ihre Immunantwort, sondern auch in ihren Stoffwechselwegen.
Die Systembiologie der Leishmaniose zielt darauf ab, molekulare Ziele für die Entwicklung neuartiger Therapeutika durch Wirkstoffdesign und -entwicklung zu identifizieren. Die Rekonstruktion von Signalnetzwerken und Stoffwechselwegen hilft dabei, Leishmaniose als ganzheitliches Modell zu verstehen und Erkenntnisse zur Identifizierung der Hauptkomponente zu gewinnen, die den erkrankten Zustand antreibt. Die mathematische Modellierung ist einer der beliebtesten angewandten analytischen Ansätze zum Verständnis der Komplexität von Leishmaniose4. Immunmetabolische Netzwerke und mathematische Modelle ermöglichten die Identifizierung der Succinatdehydrogenase (SDHA) als Schlüsselkomponente des M1-Phänotyps, der exprimiert wird, um den Parasitenzu eliminieren 5. Die Synthetische Biologie findet Anwendung in der Diagnostik, der Impfstoffentwicklung und in der Therapie bei Leishmaniose. Der Stoffwechsel, der auf die Modulation der Immunantwort abzielt, kann durch Werkzeuge der synthetischen Biologie erreicht werden. Zur Modulation der Inositolphosphoryl-Ceramid-Synthase, die den Sphingolipidstoffwechsel reguliert und die Immunsignalisierung des Wirts verändert, wurde ein genetischer Schaltkreis mit bistabilem Verhalten verwendet, um die intrinsische Robustheit des L. major-Infektionsmodellssynthetisch einzustellen 6,7. Die Systembiologie und die Synthetische Biologie können somit eine modellbasierte gentechnische Plattform für die Entwicklung der Präzisionsmedizin im Leishmania-Modellsystem bieten.
Der M1-Phänotyp ist durch die Expression von immunmetabolischen Signalnetzwerken gekennzeichnet, bei denen die Produktion von inflammatorischen Zytokinen und Stoffwechselwegen die Parasiteneliminierung synergistisch verbessert. Die M1-Polarisation bedeutet die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen wie Interleukin-12 (IL-12), Interferon-gamma (IFN-γ) und Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α). Zu den Stoffwechselwegen, die im M1-Phänotyp stark angereichert sind, gehören die Glykolyse, der Pentosephosphat-Weg und der verkürzte Tricarbonsäurezyklus (TCA-Zyklus)5. Der verkürzte TCA-Zyklus steuert die Parasiteneliminierungsmaschinerie durch erhöhte Succinat- und Citratwerte, die die Produktion von NO3 steuern. Die Akkumulation von Succinat durch SDHA führt zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors Hypoxie-induzierbarer Faktor 1-alpha (HIF-1α), der die Produktion von IL-1β8 induziert. Im M2-Phänotyp werden die Oxidation von Fettsäuren, eine Erhöhung der Glutaminverwertung und eine verstärkte oxidative Phosphorylierung von Glukose zusammen mit der Produktion von entzündungshemmenden Zytokinen wie Interleukin-10 (IL-10), dem transformierenden Wachstumsfaktor beta (TGF-β), Interleukin-4 (IL-4) und Interleukin-13 (IL-13)3 beobachtet. M2 weist längliche Mitochondrien als charakteristisches Merkmal auf, was zu einer erhöhten Effizienz bei der Energieerzeugung führt. Sie verwenden Fettsäuren, Glukose und Glutamin als Substrate, um den TCA-Zyklus anzutreiben, und erzeugen dadurch ATP durch oxidative Phosphorylierung mit einer höheren Rate, um das Wachstum und die Proliferation von Parasiten zu fördern9. Das SDHA-Enzym, das für die Succinatakkumulation durch verkürztes TCA verantwortlich ist, kann nicht nur die NO-Produktion fördern, sondern auch einen succinatabhängigen Sauerstoffverbrauch durch den Elektronentransport initiieren10. In Leishmania-infizierten Makrophagen wird SDHA um das 2,17-fache herunterreguliert, was darauf hindeutet, dass auch die aerobe Atmung herunterreguliert sein könnte11. Um den Succinatkonsum zu erhöhen, um eine entzündungsfördernde Zytokin-vermittelte NO-Produktion zu induzieren und die Parasiteneliminierung zu fördern, ist die Expression von SDHA unerlässlich.
Der synthetische Schaltkreis bietet präzisionsgerichtete Therapien, die das erkrankte System verändern können, um eine bistabile Oszillation zu erreichen, die einen gesunden Phänotyp auf raumzeitlicher Ebene wiederherstellen kann. Die synthetische Schaltung und der Ausdruck machen das System dynamisch und robust. Ein entscheidender Faktor, der zur Weiterentwicklung der synthetischen Biologie beiträgt, liegt in der Fähigkeit, genetische Teile und Elemente modular zusammenzusetzen, um die Generierung komplexer Architekturen und maßgeschneiderter Funktionalitäten zu ermöglichen12. Einschränkungen, die mit traditionellen Expressionstechniken verbunden sind, haben die Entstehung von Tetracyclin-Operon-basierten induzierbaren Plasmid-Syntheseschaltkreisen vorangetrieben, die eine schnelle Bewertung des Plasmids und eine einfache Verabreichung über verschiedene Zelltypen hinweg ermöglichen13. Das Tetracyclin-responsiver Repressor (TetR)-Protein zeigt, wenn es als Dimer vorliegt, eine starke Bindungsaffinität zum Tet-Operon (TetO), wodurch die Transkription effektiv unterdrückt wird. Bei der Wechselwirkung seines Liganden, Doxycyclin (dox), erfährt TetR jedoch eine strukturelle Veränderung, die zu seiner Dissoziation von TetO führt, wodurch die Transkription ungehindert ablaufen kann. Dieser Schaltkreis kann eine Proteintranslationskontrolleaufweisen 14. Daher wurde durch die definierte Methodik der entworfene Tetracyclin-Operon-basierte induzierbare Plasmidsynthesekreislauf in die Lage versetzt, SDHA im pEGFP-N1-Vektor zu exprimieren. Die Bewertung der Transformationseffizienz der Schaltung und ihrer Ausbeute gab Aufschluss über die Kompetenz der Lieferung. Durch den Restriktionsverdau des Vektors konnte die Bestimmung der Klonierungseffizienz bestätigt werden. Des Weiteren wurde eine transfizierte RAW264.7-Maus-Makrophagen-Zelllinie, die von Peritonealmakrophagen von Balb/c-Mäusen abgeleitet wurde, für die Doxycyclin-dosisabhängige Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) in transfizierten Zellen beobachtet. Zusätzlich wurde der Effekt der Parasiteneliminierung in transfizierten Zellen durch eine Expression des synthetischen Schaltkreises bestätigt. Darüber hinaus wurde eine Induktion und Expression von proinflammatorischen Zytokinen beobachtet, die durch eine Erhöhung des Infektionszeitpunkts in den transfizierten und induzierten Zellen des synthetischen Schaltkreises gesteuert wurde, was direkt mit der Funktion des synthetischen Schaltkreises verbunden war.

<table><tbody><tr><td>10 &mu; L-Spitzen</td><td>Tarson</td><td>521050</td><td></td></tr><tr><td>10X Restriktionspuffer</td><td>BioLabs</td><td>R0146S</td><td>Restriktionsaufschluss</td></tr><tr><td>1mL-Spitzen</td><td>Tarson</td><td>521016</td><td></td></tr><tr><td>1mL-Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L-Spitzen</td><td>Tarson</td><td>521010</td><td></td></tr><tr><td>25cm2 Kolben</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>Für die Zellkultur</td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-phenylindol</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>D1306</td><td>Kernfärbung</td></tr><tr><td>50mL Röhrchen</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>60mm</td><td>Platten Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6X TrackIt Cyan/Orange Ladepuffer</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>10488085</td><td>Laden von Proben für AGE</td></tr><tr><td>96 Well Deckglas Bodenplatte</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>160376</td><td>Für die konfokale Bildgebung und Transfektion</td></tr><tr><td>96 Well Mikrotestplatte mit flachem Boden Wells</td><td>Tarson</td><td>941196</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>Für AGE</td></tr><tr><td>Agarose Gelelektrophorese</td><td>Baugruppe GeNei</td><td>93</td><td>Für AGE</td></tr><tr><td>Bakterielle laminare Strömung</td><td>ESCO Lifesciences</td><td>2120765</td><td>Für die Transformation</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Merck</td><td>C4901</td><td>Puffer-/Reagenzienvorbereitung</td></tr><tr><td>Laminare Luftströmung für Zellkulturen</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>1323TS</td><td>Für Zellkultur</td></tr><tr><td>Zellschaber</td><td>Genetix</td><td>90020</td><td>Für Zellkultur</td></tr><tr><td>Zellverteiler</td><td>Fischer Scientific</td><td>12822775</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge für 1,5 mL Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>EP5404000537</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge für 50 mL falcon</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>75004210</td><td></td></tr><tr><td>Chlorofrom</td><td>Fischer Scientific</td><td>67-66-3</td><td>Für die RNA-Isolierung</td></tr><tr><td>CO2-Inkubator</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>3110</td><td>Für Zellkulturküvetten</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>6138000018</td><td>Schätzung der Plasmidkonzentration</td></tr><tr><td>CYTIVA IQ 500 Gel Imager</td><td>Cytiva</td><td>29655893</td><td>Für AGE</td></tr><tr><td>DEPC TREATED H2O 1000 ML</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>750023</td><td>Für die RNA-Isolierung</td></tr><tr><td>Doxycyclin</td><td>Merck</td><td>33429</td><td>Für die Induktion transfizierter</td></tr><tr><td>Zellen Trockener Heizblock</td><td>Labnet</td><td></td><td>Zur Transformation und Inaktivierung von Restriktionsenzymen</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Nationales Zentrum für Zellforschung</td><td></td><td>Für Zellkulturen</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00983</td><td>Puffer / Reagenzienzubereitung</td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Sigma</td><td>E7637</td><td>Für AGE</td></tr><tr><td>Ethylendiamin Tetraessigsäure</td><td>Fischer Scientific</td><td>12635</td><td>Puffer / Reagenzienvorbereitung</td></tr><tr><td>Evos Hellfeldmikroskop</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>ExPasy</td><td>https://web.expasy.org/translate/</td><td></td> <td>für die Konstruktion eines synthetischen Schaltkreises</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>Für Zellkulturen</td></tr><tr><td>FV31S-SW Software</td><td>Olypmus</td><td></td><td>Bilderfassung</td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Gibco</td><td>1563411</td><td>für die Transfektion</td></tr><tr><td>Gibson-Assemblierungsmethode für die Klonierung</td><td>BIOMATIK</td><td></td><td>Aufbau eines synthetischen Schaltkreises</td></tr><tr><td>Graphpad-Prisma</td><td>Graphpad</td><td></td><td>Statistische Analyse</td></tr><tr><td>Reverse-Transkriptionskit für cDNA mit hoher Kapazität</td><td>ThermoFischer Scientific</td> 4368814 <td>für die cDNA-Synthese</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>13825</td><td>Puffer-/Reagenzienvorbereitung</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma</td><td>60615</td><td>Für die Transformation und Kolonieauswahl</td></tr><tr><td>Luria Bertini Bouillon</td><td>Himedia</td><td>M1245</td><td>Für die Kultivierung von E.coli</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP214</td><td>Puffer-/Reagenzienvorbereitung</td></tr><tr><td>Micro Filt Vertical Laminar Air Flow</td><td>Microfilt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0,1 mL</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4358293</td><td>Für qRT-PCR</td></tr><tr><td>MicroAmp Optische 8-Cap Strips</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4323032</td><td>Für qRT-PCR</td></tr><tr><td>Mikrowellenherd</td><td>LG</td><td>MC-7649DW</td><td>Für AGE</td></tr><tr><td>Mm00434228_m1 (IFN-&gamma;)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>Taqman Sonden</td></tr><tr><td>Mm00443258_m1 (TNF)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>Taqman Sonden</td></tr><tr><td>Mm01321739_m1 (TGFB)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>Taqman Sonden</td></tr><tr><td>Maus ELISA Kit IL-10</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>BMS614</td><td>Für ELISA</td></tr><tr><td>Maus ELISA Kit IL-12</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>BMS616</td><td>für ELISA</td></tr><tr><td>Multiskan Sky mit Touchscreen + &mu; Tropfplatte</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>51119600DP</td><td>für ELISA</td></tr><tr><td>MX-M Mikrotiterplattenmischer 96-Well-Zellkulturplattenmischer Einstellbar 0-1500 U/min Laborschüttler Rührwerk</td><td>DIAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nationales Zentrum für Biotechnologie Information</td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov</td><td></td><td>für den Bau eines synthetischen Kreislaufs</td></tr><tr><td>Neubauer's Kammer</td><td>Marienfeld superior</td><td>640010</td><td>Für die Zellzahl</td></tr><tr><td>Nicht belüfteter 25cm2 Kolben</td><td>Corning</td><td>353014</td><td>Für die Kultivierung von Parasiten</td></tr><tr><td>NotI</td><td>BioLabs</td><td>R3189M</td><td>Restriktionsenzym</td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Biodesign</td><td>1QIA</td><td>Reagenzienvorbereitung</td></tr><tr><td>Olympus Cell Sens Dimension Desktop 2.3 Software</td><td>Olypmus</td><td></td><td>Bildverarbeitung</td></tr><tr><td>Olympus FV 3000</td><td>Olympus</td><td></td><td>Für die konfokale Bildgebung</td></tr><tr><td>OPTI-MEM-Medien</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>Medien für die Transfektion</td></tr>, <tr><td>pEGFP-N1-Vektor, kloniert mit synthetischem Schaltkreis</td>, <td>Biomatik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Penicillin</td><td>, ThermoFischer, Scientific</td><td>15070063</td><td>Für Zellkulturen</td></tr><tr><td>: Polyethylenimin,</td><td>MERCK</td><td>764965 für</td><td>die Transfektion</td></tr><tr><td>, Kaliumacetat</td>, <td>Fischer Scientific</td><td>YBP364500</td><td>Puffer-/Reagenzpräparation</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP366</td><td>Puffer-/Reagenzpräparation</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat Monobasic</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Puffer-/Reagenzienvorbereitung</td></tr><tr><td>Netzteil</td><td>BIORAD</td><td>1645070</td><td>Für AGE</td></tr><tr><td>Register of Standard Biological parts</td><td>https://parts.igem.org/Main_Page</td><td></td><td>für den Aufbau eines synthetischen Schaltkreises</td></tr><tr><td>RNAiso Plus</td><td>Takara</td><td>38220090</td><td>Für die RNA-Isolierung</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>12091021</td><td>Vorbereitung von Puffern / Reagenzien</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute Medium</td><td>Nationales Zentrum für Zellwissenschaften</td><td></td><td>Für die Kultivierung von Parasiten</td></tr><tr><td>Shaker-Inkubator</td><td>REMI</td><td>CIS 24 plus</td><td>Für die Kultivierung von E.coli</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Qualigens</td><td>Q27605</td><td>Puffer / Reagenzienzubereitung</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>Puffer / Reagenzienzubereitung</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Fischer Scientific</td><td>15895</td><td>Puffer / Reagenzpräparat</td></tr><tr><td>Natriumphosphat Dibasic</td><td>Sigma</td><td>S5136</td><td>Puffer / Reagenz Vorbereitung</td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Schätzung der Plasmidkonzentration</td></tr><tr><td>Spin win</td><td>Trason</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>StepOne plus Real Time PCR System</td><td>Life technologies</td><td>272006777</td><td>Für qRT-PCR</td></tr><tr><td>StepOne Software Version 2.3</td><td>Life technologies</td><td></td><td>Für qRT-PCR</td></tr><tr><td>TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X), kein AmpErase UNG</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4366072</td><td></td></tr><tr><td>Tinker</td><td></td><td></td><td>cell Konstruktion und Simulation von synthetischen Schaltkreisen</td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus DNA-Leiter</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>10488085</td><td>Für AGE</td></tr><tr><td>Tris (Hydroxymethyl) Aminomethanhydrochlorid</td><td>Himedia</td><td>MB029</td><td>Puffer-/Reagenzienvorbereitung</td></tr><tr><td>Tris-Acetat-EDTA</td><td>SERVA</td><td>42549.1</td><td>Puffer-/Reagenzienvorbereitung</td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Für die Zellzählung</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>BioLabs</td><td>R0146S</td><td>Restriktionsenzym</td></tr></tbody></table>

immunmetabolische schaltkreise in der infektion zur weiterentwicklung wirtsgerichteter therapien

Immunometabolic Circuits in Infection for Advancing Host Directed Therapies

Der Immunstoffwechsel ist eine zentrale Determinante für das Fortschreiten der Leishmaniose. Der auf synthetischer Biologie basierende Ansatz hat als Schritt hin zu therapeutischen Interventionen, die auf wirtsassoziierte Faktoren abzielen, die Leishmaniose verursachen, große Aufmerksamkeit erregt. Die Synthetische Biologie befasst sich mit der orthogonalen und modularen Entwicklung genetischer Komponenten, um biologische Systeme präzise zu modulieren und Zellen neue Funktionen zu verleihen. In der vorliegenden Studie wurde die Aufklärung einer systematischen Pipeline für die Entwicklung eines induzierbaren Tetracyclin-kontrollierten (TetON)-basierten synthetischen Schaltkreises zum Ziel gesetzt, Succinatdehydrogenase als Therapeutikum zu liefern, um die Eliminierung intrazellulärer Leishmania-Parasiten zu erleichtern. Das skizzierte Protokoll beschreibt den Entwurf einer synthetischen Schaltung und deren anschließende Validierung. Die vorgeschlagene Strategie konzentriert sich auch auf den Einbau von synthetischen Schaltkreisen in das Plasmid-Rückgrat als Transportvehikel. Darüber hinaus wurden Verabreichungsmaschinen mit Polyplex-basierten Nanopartikeln für die Verabreichung synthetischer Schaltkreise in murinen Makrophagen-Zelllinien eingesetzt, ohne die zelluläre Morphologie zu beeinträchtigen. Es wurde eine Standardisierung der Methode zur Selektion transfizierter Zellen und zur Bestimmung der optimalen Induktionskonzentration für die Expression synthetischer Schaltkreise durchgeführt. Beobachtungen zeigen eine deutliche Verringerung der intrazellulären Parasitenlast in transfizierten Zellen im Vergleich zu infizierten Zellen. Proinflammatorische Zytokine wurden nach der Infektion in einem synthetischen Schaltkreis exprimiert, transfiziert und induzierte Zellen als Mechanismus zur Förderung der Parasiteneliminierung. Dies unterstreicht die auf synthetischer Biologie basierende Methode als wirksamen Ansatz bei Leishmaniose, indem sie auf Wirtsfaktoren abzielt, die mit dem Fortschreiten der Krankheit verbunden sind.

Die Anordnung der genetischen Teile, die den synthetischen Schaltkreis bilden, um den synthetischen Schaltkreis zu exprimieren, ist in (Abbildung 1A) dargestellt. Die entsprechenden Teile wurden in einem pEGFP-N1-Vektor orthogonal und modular kloniert, was in Abbildung 1B dargestellt ist. Die Simulation des synthetischen Schaltkreises zeigte die oszillatorische Dynamik sowohl in SDHA als auch im Tetracyclin-Repressor. Diese Beobachtung deutet auf ein reziprokes Expressionsmuster hin, das durch periodische Wellenfunktionen gekennzeichnet ist. Der Anstieg der SDHA-Konzentration kann auf die Induktion von Doxycyclin zurückgeführt werden, während die Expression von TetR aus einem Rückgang des Doxycyclinspiegels resultieren kann (Abbildung 1C). Angesichts der induzierbaren oszillatorischen Expression von SDHA und TetR, die in silico beobachtet wurde, wurde eine Strategie für die Verabreichung des synthetischen Schaltkreises durch den pEGFP-N1-Plasmidvektor entworfen und implementiert.
Zu den für die Studie identifizierten iGEM-Teilen gehören BBa_K1493803 für TetO, BBa_K4344028 für die Kozak-Sequenz, BBa_C0040 für TetR bzw. BBa_K1537016 für P2A. Die NCBI-Beitritts-ID für SDHA lautet NM_025848. Diese Komponenten wurden zu einem Doxycyclin-induzierbaren TetON-Syntheseschaltkreis zusammengesetzt, der insgesamt 1317 Basenpaare umfasst (Ergänzende Datei 1). Da TetO als regulatorisches Element der DNA fungiert, wurde seine Sequenz nicht translatiert. Für die In-silico-Validierung der Translation wurde die Sequenz stromabwärts der Kozak-Sequenz ausgewählt, die sich von 5' TetR bis zum 3'-Ende von P2A erstreckt und stromabwärts von SDHA positioniert ist. Die Beobachtung ergab das Fehlen von internen Stoppcodons, die eine ununterbrochene Translation über die gesamte Sequenzlänge gewährleisten (Ergänzende Datei 2). Die regulatorischen Teile eines synthetischen Schaltkreises mit 1317 bp wurden zwischen den NotI- und XhoI-Restriktionsstellen eingefügt, die 5' stromaufwärts von EGFP liegen (Abbildung 1B). Die Sequenzierungsergebnisse zeigen, dass die Insertsequenz im Plasmid kloniert wurde (Ergänzungsdatei 3).
Die Einführung eines immunmetabolischen Schaltkreises in den E. coli DH5α-Stamm führte zum Wachstum transformierter Kolonien, die eine Resistenz gegen Kanamycin zeigten, das Antibiotikum, das als selektiver Marker während der bakteriellen Transformation eingesetzt wird. Das häufige Vorhandensein von transformierten Kolonien auf der Selektionsplatte war höher, was darauf hindeutet, dass die kompetenten Zellen ein hohes Transformationspotenzial aufwiesen, was auf die Effizienz des verwendeten Transformationsprotokolls hinweist (Abbildung 1D).
Eine einzelne Kolonie wurde isoliert und in 10 ml LB besiedelt, das mit Kanamycin zur Isolierung des Plasmids ergänzt wurde. Die Plasmidausbeute aus einer 10-ml-Kultur ist in Tabelle 1 aufgeführt. Für dieses Verfahren wurde eine Standardmethode zur Plasmidisolierung verwendet. Die Pufferlösungen wurden am Tag vor der Plasmidisolierung frisch hergestellt, und die Inkubationsbedingungen wurden optimiert, um die Plasmidausbeute zu maximieren. Die erhaltene Plasmidkonzentration überstieg 1 μg/μL, wobei die Verhältnisse 260/280 und 260/230 1,8 bzw. 2,0 übertrafen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die isolierten Plasmide von hoher Reinheit und frei von Verunreinigungen wie Proteinen, EDTA, Kohlenhydraten und Phenol waren.
Die elektrophoretische Mobilitätsverschiebung für den isolierten synthetischen Schaltkreis wurde bewertet. Der Restriktionsverdau wurde mit NotI- und XhoI-Restriktionsenzymen durchgeführt, da dies die Restriktionsstellen waren, an denen der synthetische Schaltkreis eingefügt wurde. Auf 1% Agarosegel wurden zwei Banden beobachtet, eine Bande in der Nähe von 1500 bp und eine zwischen 4 kb und 5 kb. Angesichts der Tatsache, dass die Einsatzgröße 1317 bp beträgt, entspricht die Bande bei 1500 bp wahrscheinlich der Einsatzfläche. Der pEGFP-N1-Vektor hat eine Größe von 4.7 kb. Daher wird angenommen, dass die Bande in der Nähe von 5 kb der pEGFP-N1-Vektor ist. Folglich wurde der Schluss gezogen, dass ein vollständiger und intakter synthetischer Schaltkreis innerhalb des Verabreichungsvektors vorhanden war. Zusätzlich wurde eine etwa 6 kb-Bande für den unverdauten intakten synthetischen Schaltkreis detektiert, was darauf hindeutet, dass der pEGFP-N1-Vektor ein Insert von fast 1,3 kb innerhalb des Plasmidvektors beherbergt (Abbildung 1E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig01.jpg"> Abbildung 1: Entwurf und Validierung eines synthetischen Schaltkreises. (A) Darstellung synthetischer Schaltkreise durch den Zusammenbau von genetischen Teilen und regulatorischen Komponenten. (B) Deterministisches Simulationsdiagramm, das die periodische Expression von SDHA und TetR in 100-Zeiteinheiten zeigt. (C) Synthetischer Kreislauf transformierte Kolonien von E. coli DH5α, die gegen Kanamycin resistent sind. Die Einheit ist eine 100-fache Einheit, da es sich um eine deterministische Simulation handelt. (D) Agarose-Gelelektrophorese eines intakten und restriktionsverdauten synthetischen Kreislaufs unter Verwendung von NotI- und XhoI-Restriktionsenzymen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Konzentration des Plasmids (μg/mL)</td>
			<td>260/280</td>
			<td>260/230</td>
		</tr><tr><td>1248.5</td>
			<td>1.95</td>
			<td>2.45</td>
		</tr><tr><td>1123.1</td>
			<td>1.89</td>
			<td>2.43</td>
		</tr><tr><td>1155.8</td>
			<td>1.87</td>
			<td>2.41</td>
		</tr><tr><td>1056.8</td>
			<td>1.94</td>
			<td>2.47</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Ausbeute des Konstrukts des synthetischen Schaltkreises, das nach der Plasmidisolierung erhalten wurde. Die Tabelle zeigt die Konzentration von Plasmiden in μg/ml, ihr Verhältnis von 260/280 und 260/230.
In den Kontrollzellen und infizierten Zellen war die beobachtete Fluoreszenzintensität für GFP gering. Es wurde jedoch beobachtet, dass die Transfektion des synthetischen Schaltkreises mit einem Verhältnis von 1:1 von Plasmid und PEI mit 500 μg/mL G418 und die Induktion mit 1 μg/μl dox eine hohe GFP-Expression in IMT-Zellen induzierte. In 6-h-IMTI-Zellen war die GFP-Expression ebenfalls signifikant höher, obwohl die GFP-Expression niedriger war als in der IMT-Probe (Abbildung 2A,B). Darüber hinaus wurde ein Anstieg der GFP-Expression in 12-stündigen IMTI-, 18-stündigen IMTI- und 24-stündigen IMTI-Proben beobachtet. Dieser Anstieg könnte auf eine Verlängerung des Infektionszeitpunkts zurückzuführen sein, die möglicherweise zu höheren metabolischen Veränderungen in Makrophagen durch den Wohnparasiten17 geführt haben könnte. Intrazelluläre SDHA-Spiegel können aufgrund einer Verlängerung der Infektionszeit beeinflusst werden18. Da dox zu diesen IMTI-Proben addiert wurde, könnten die SDHA-Spiegel durch synthetische Schaltkreise angestiegen sein, was zu einer Erhöhung der SDHA-Expression führte.
Die DAPI-Färbung wurde durchgeführt, um die Anzahl der lebenden Parasiten in den Makrophagen zu identifizieren. Bei 6 h L. major infizierten Makrophagen betrug die beobachtete Anzahl intrazellulärer Parasiten 6 Zellen pro Makrophage, was höher ist als bei der 6 h IMTI-Probe, die 1-2 intrazelluläre Parasiten pro Makrophagen aufwies. Nach der Transfektion und der Dox-Induktion wurde zu verschiedenen Zeitpunkten der Infektion eine signifikante Verringerung der intrazellulären Parasitenlast beobachtet (Abbildung 2C). Beobachtungen deuteten darauf hin, dass synthetische Schaltkreise durch Stimulierung der SDHA-Expression parasiteneliminierende Effekte hervorgerufen haben könnten.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig02.jpg"> Abbildung 2: Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie. Bilder von Kontroll-, Infizierten-, IMT- und IMTI-Proben. (A) Expressionsanalyse von GFP in allen Versuchsproben mit einem Maßstabsbereich von 50 μm für die Kontrolle, 6 h infiziert und IMT, 20 μm für 6 h IMTI, 10 μm für 12 h IMTI, 18 h IMTI bzw. 24 h IMTI. Die verwendeten Kanäle waren DIC, DAPI, GFP und zusammengeführte Bilder aller Kanäle. (B) Einseitige ANOVA mit Tukey-Korrekturtest aller experimentellen Stichproben (n=3) für die GFP-Expression (p &lt; 0,05 wird als signifikant angesehen) Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. (C) Es wurde eine einfache ANOVA mit dem Tukey-Korrekturtest durchgeführt, bei der die Parasitenlast in 100 Makrophagenzellen für Proben aus (A) (n=3) durchgeführt wurde (p &lt; 0,05 wird als signifikant angesehen). Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Der Nachweis von IL-10- und IL-12-Spiegeln in den Medien aller Proben zeigte, dass die Konzentration von IL-10 und IL-12 6 h nach der Infektion am höchsten war, mit einer Herunterregulierung der Zytokinspiegel nach 24 h Infektion. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den IL-10- und IL-12-Spiegeln bei der Transfektion und Induktion synthetischer Schaltkreise. Außerdem gab es einen nicht signifikanten Unterschied zwischen den IL-10- und IL-12-Spiegeln in den IMTI-Stichproben zum Zeitpunkt (Abbildung 3). Es wurde bereits berichtet, dass die 6 h infizierte Probe eine Expression von IL-10 und IL-12zeigte 19,20, die Beobachtung eines nicht signifikanten Unterschieds zwischen IL-10 und IL-12 veranlasste uns, die Wirkung des synthetischen Schaltkreises auf andere Zytokine zu untersuchen.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig03.jpg"> Abbildung 3: ELISA von IL-10 und IL-12 zur Identifizierung ihrer sekretorischen Konzentrationen in Medien verschiedener Proben. Die Proben (n=2) umfassen Kontrolle, 6 h Infizierte, 24 h Infizierte, IMT, 6 h IMTI, 12 h IMTI, 18 h IMTI, 24 h IMTI. Es wurde eine bidirektionale ANOVA mit der Analyse des Tukey-Korrekturtests durchgeführt (p &lt;.05 wird als signifikant angesehen). Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Der Nachweis der Transkriptspiegel von TNF-α, IFN-γ und TGF-β in 6-stündigen infizierten, IMT- und 24-stündigen IMTI-Proben zeigte, dass in 24-stündigen IMTI-Proben im Vergleich zu Infektions- und IMT-Proben ein signifikanter Anstieg der TNF-α auf das 2,5-fache beobachtet wurde (Abbildung 4). In der 24-stündigen IMTI-Probe wurde ein 35-facher Anstieg der IFN-γ-Spiegel im Vergleich zu Infektions- und IMT-Proben beobachtet. Obwohl sie in der 24-Stunden β-IMTI-Probe eine signifikante Hochregulation auf das 1,5-fache zeigten, war die relative Faltungsänderung im Vergleich zu TNF-α und IFN-γ geringer, was darauf hindeutet, dass pro-inflammatorische Zytokine in der 24-Stunden-IMTI-Probe signifikant hochreguliert sind.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig04.jpg"> Abbildung 4: qRT-PCR-Analyse von Zytokinen. (A) TNF-α, (B) IFN-γ und (C) TGF-β für 6 h infizierte, IMT- und 24 h IMTI-Proben (n=2). Es wurde eine unidirektionale ANOVA mit dem Tukey-Korrekturtest durchgeführt (p &lt; 0,05 wird als signifikant angesehen). Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Datei 1: Nukleotidsequenz von genetischen Teilen, die zum synthetischen Schaltkreis zusammengesetzt sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%201_RE.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 2: Übersetzte Sequenz eines synthetischen Schaltkreises, der TetR, P2A und SDHA exprimiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%202_RE.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 3: Sequenzierungsergebnis des klonierten synthetischen Schaltkreises im pEGFP-N1-Plasmid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%203_RE.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Hier wird ein Protokoll für das Design, die Konstruktion und die Bereitstellung eines tetracyclingesteuerten induzierbaren synthetischen Schaltkreises vorgestellt. Die Wirkung der synthetischen Schaltkreise auf die Parasiteneliminierung und die Zytokinexpression kann durch Kanalisierung der vorgestellten Pipeline untersucht werden. Dieses Protokoll ist relevant für Forscher, die synthetische Schaltkreise bei Infektionskrankheiten untersuchen.

Immunmetabolische Schaltkreise in der Infektion zur Weiterentwicklung wirtsgerichteter Therapien

Immuno-metabolism is a pivotal determinant in the progression of leishmaniasis. Synthetic biology-based approach has garnered significant attention as a ...

immunometabolic-circuits-infection-for-advancing-host-directed

Research

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JoVE Journal

Bioengineering

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Monozyten sind integrale Bestandteile des menschlichen angeborenen Immunsystems, die auf den glykolytischen Stoffwechsel angewiesen sind, wenn sie aktiviert werden. Wir beschreiben ein durchflusszytometrisches Protokoll zur Messung der Glukosetransporterexpression und der Glukoseaufnahme durch Gesamtmonozyten und Monozyten-Subpopulationen in frischem Vollblut.

Eine einfache Durchflusszytometrischer Methode Glukoseaufnahme und Glukosetransporter-Expression für Monozytensubpopulationen in Vollblut zu messen

Dieses Protokoll beschreibt , wie C57BL / 6J - Mäuse mit dem Stamm EGD von Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) und zur Messung der Interferon-γ (IFN-γ) Antworten , die durch natürliche Killer (NK) Zellen, natürliche Killer - T (NKT) -Zellen zu inokulieren, und adaptive T-Lymphozyten nach der Infektion. Dieses Protokoll beschreibt auch , wie Überlebensstudien bei Mäusen mit einer modifizierten LD 50 Dosis des Erregers nach der Infektion zu führen.

Experimentelle Infektion mit<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Als Modell für die Untersuchung Host-Interferon-γ Antworten

Dieses Protokoll beschreibt einen detaillierten Workflow für die Generierung und ex-Vivo Charakterisierung von onkolytische Viren für den Ausdruck von Immunmodulatoren, Masern-Viren Codierung bispezifische T Zelle Engagers als Beispiel verwenden. Anwendung und Anpassung an andere Vektor-Plattformen und transgene beschleunigt die Entwicklung von neuartigen Immunovirotherapeutics für klinische Übersetzung.

Paramyxoviruses für Tumor-gezielte Immunmodulation: Gestaltung und Evaluation Ex Vivo

Wir beschreiben eine menschliche periphere Mononuklezelle (PBMC) – basierendes humanisiertes Xenograft-Mausmodell für translationale Immunonkologieforschung. Dieses Protokoll könnte als allgemeine Leitlinie für die Erstellung und Charakterisierung ähnlicher Modelle für die Bewertung von I-O-Therapien dienen.

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research

Im Zeitalter der Immuntherapie und des genomischen Profilings von Einzelzellen erfordert die Krebsbiologie neuartige In-vitro- und Computerwerkzeuge, um die Tumor-Immun-Schnittstelle in einem geeigneten raumzeitlichen Kontext zu untersuchen. Wir beschreiben Protokolle zur Nutzung von mikrofluidischen Kokulturen des Tumor-Immunsystems in 2D- und 3D-Umgebungen, die mit einer dynamischen, multiparametrischen Überwachung zellulärer Funktionen kompatibel sind.

Mikrofluidische Co-Kulturmodelle zur Analyse der Immunantwort in in vitro Tumormikroumgebungen

Vollblutbasierte Immunoassays bieten ein einfaches und ressourceneffizientes Werkzeug zur Analyse der antigenspezifischen Immunität für Diagnose- und Forschungszwecke. Dieser Artikel bietet ein optimiertes Vollblut-basiertes Protokoll mit dualer Co-Stimulation für eine umfassende Analyse der Immunität des Wirts gegen pilzliche und virale Krankheitserreger, einschließlich einer Version mit geringem Volumen für pädiatrische Patienten und Kleintiere.

Vollblutassay mit dualer Co-Stimulation zur antigenspezifischen Analyse der Immunität des Wirts gegen pilzliche und virale Krankheitserreger

Dieser Bericht beschreibt ein automatisiertes Protokoll für Multiplex-Immunfluoreszenz-Assays (mIF) auf einem automatisierten Objektträgerfärbegerät. Es demonstriert die hohe Reproduzierbarkeit der räumlichen Proteomik auf Standard-Hochdurchsatz-Gewebe-Autostainern und Ganzobjektträger-Fluoreszenz-Imagern, was ideal für kundenspezifische mIF-Assays über eine große Anzahl von Gewebeobjektträgern in der translationalen Forschung ist.

Automatisierte Hochdurchsatz-Multiplex-Immunfluoreszenz-Assays für die translationale Forschung

Das vorliegende Protokoll beschreibt einen experimentellen Arbeitsablauf, der die ex vivo Analyse der Stimulation humaner T-Zellen in einem allogenen Co-Kultursystem mit vorbehandelten Tumorzellen ermöglicht.

Analyse der Aktivität humaner T-Zellen in einer allogenen Co-Kultur von vorbehandelten Tumorzellen

Dieser Artikel beschreibt eine vielseitige Methode zur cell-derived Gewebe Ringe durch zelluläre self-assembly erstellen. Glatte Muskelzellen in ringförmige Agarose Brunnen sammeln und Vertrag robust dreidimensionale (3D-) Gewebe innerhalb von 7 Tagen bilden ausgesät. Millimeter-Skala Gewebe Ringe sind förderlich für die mechanische Prüfung und dienen als Bausteine ​​für Gewebe Montage.

Directed Cellular Self-Assembly to Cell-Derived Tissue Ringe für biomechanische Analyse und Tissue Engineering Fabricate

Dieses Protokoll zeigt Methoden verwendet werden, um 2D-und 3D-Umgebungen in speziell angefertigten electrotactic Kammern einzurichten, die Zellen verfolgen...

Electric Field-gesteuerte gerichtete Wanderung von neuralen Vorläuferzellen in 2D-und 3D-Umgebungen

Erfahren Sie, wie tetracyclin-kontrollierbare synthetische Schaltkreise bei Leishmania major-Infektionen Parasitenelimination und Zytokinexpression modulieren. Diese Methode ermöglicht innovative wirtsgerichtete Therapien.

Immunmetabolische Schaltkreise in der Infektion zur Weiterentwicklung wirtsgerichteter Therapien

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