Immunmetabolische Schaltkreise in der Infektion zur Weiterentwicklung wirtsgerichteter Therapien

Die Systembiologie bietet Einblicke in die biologischen Netzwerke und Mechanismen in Infektionsmodellen, während die synthetische Biologie eine Präzisionstherapie ermöglicht. Wir erforschen den Immunmetabolismus bei einer schweren Leishmaniose-Infektion und das Potenzial biosynthetischer Schaltkreise für die Krankheitsaufklärung und revolutionieren damit Immuntherapeutika. In den letzten Jahren hat sich die synthetische Biologie als vielversprechend erwiesen, wenn es um die Entwicklung neuerer und wirksamer Strategien zur Bekämpfung von Leishmaniose geht.

Einige der jüngsten Entwicklungen betreffen das Engineering synthetischer Zytokine, den bistabilen synthetischen Schaltkreis CRISPR-Cas9 und synthetische Peptide werden als Therapeutika untersucht. Unser Protokoll zielt auf das Wirtsprotein ab, das vom Parasiten für sein Überleben moduliert wird. So untersuchen wir die Wirkung auf den Schaltkreis nicht nur auf den Parasiten, sondern auch auf den Wirt.

Darüber hinaus untersuchten wir die Wirkung synthetischer Schaltkreise auf die Adressierung der Orthogonalitäts- und Modularitätsfunktion bei der Auslieferung im Wirt. Um zu beginnen, öffnen Sie auf einem Computer die TinkerCell-Software und klicken Sie auf den Teile-Tab. Wählen Sie die CMV-Promotorkomponente aus der Bibliothek aus und platzieren Sie sie auf der Leinwand, um den Cytomegalievirus-Promotor innerhalb des synthetischen Schaltkreises zu symbolisieren.

Verschmelzen Sie diese genetischen Elemente, um die Konstruktion der synthetischen Teile zu erleichtern. Bauen Sie eine Spacer-Region, die durch das porzine Teschovirus 12A spaltbar ist, auf die Leinwand ein. Führen Sie eine zusätzliche kodierende Region ein, die Succinatdehydrogenase oder SDHA, die das Gen von Interesse im synthetischen Konstrukt darstellt und es mit den anderen Elementen integriert.

Integrieren Sie neben der SDHA-kodierenden Region eine weitere Spacerregion, die durch die zelluläre Protease des porzinen Teschovirus 12A spaltbar ist. Führen Sie eine kodierende Region ein, die das Reportergen repräsentiert, und markieren Sie sie als GFP in das Konstrukt. Fügen Sie neben GFP ein Abschlusszeichen hinzu.

Um die Bildung eines funktionellen genetischen Schaltkreises zu überprüfen, klicken Sie auf einen beliebigen Teil des Schaltkreises. Die Schaltung wird beim Klicken rot angezeigt. Weisen Sie auf der Registerkarte Reaktion dem Tetracyclin-responsiven Repressor, SDHA und GFP regulatorische Raten zu, um die Translationsreaktion innerhalb des synthetischen Schaltkreises abzugrenzen.

Fügen Sie ein kleines Molekül aus der Registerkarte "Teile" hinzu und nennen Sie es Doxycyclin. Um Doxycyclin eine Wellenfunktion zuzuweisen, wählen Sie auf der Registerkarte Teile und Verbindungen die Option Eingang und klicken Sie auf Welleneingang. Klicken Sie auf der Registerkarte Reaktion auf Verdrängungsreaktion.

Um die transkriptionelle regulatorische Reaktion zwischen dem Tetracyclin-responsiven Repressorprotein und der Repressor-Bindungsstelle zu implementieren, wählen Sie die Reaktion aus der Reaktionsregisterkarte aus und platzieren Sie sie auf der Leinwand zwischen dem Tetracyclin-responsiven Repressor und dem Tetracyclin-Operator. Doppelklicken Sie auf jede Komponente und Reaktion, um eine Anfangskonzentration und einen Parameter für die Simulation festzulegen. Klicken Sie auf Simulation, wählen Sie deterministisch und simulieren Sie die Schaltung für 100 Zeiteinheiten.

Passen Sie das Simulationsdiagramm über das Bedienfeld an und beobachten Sie das Diagrammmuster für SDHA und Tetracyclin-responsive repressive Proteine. Öffnen Sie das Register der biologischen Standardteile, klicken Sie auf Suchen und geben Sie den Namen der genetischen Komponente ein. Um die Nukleotidsequenz des CMV-Promotors zu erhalten, klicken Sie auf die Teilesequenz abrufen und speichern Sie die Datei als Textdatei.

Um die proteinkodierende Sequenz von SDHA zu erhalten, öffnen Sie NCBI und wählen Sie Nukleotid aus der Dropdown-Liste neben dem Suchfenster aus. Typisieren Sie Succinatdehydrogenase und Mus musculus und suchen Sie nach der Nukleotidsequenz. Klicken Sie auf die Option CDS, um die Codierungssequenz von SDHA abzurufen und die Sequenz in einer Textdatei zu speichern.

Führen Sie die Nukleotidsequenz aller genetischen regulatorischen Teile sequentiell in einer Datei zusammen. Fügen Sie ein Startcodon ATG direkt nach der Kozak-Sequenz hinzu und entfernen Sie interne Stoppcodons, um die Bildung naszierender Polypeptide zu vermeiden. Öffnen Sie die Expasy-Website und fügen Sie die Nukleotidsequenz ein.

Klicken Sie auf die Option Sequenz übersetzen, wählen Sie dann fünf Primzahlen mit drei Primzahlen und entfernen Sie die Stoppcodons. Zu Beginn werden RAW264.7-Zellen bei 37 Grad Celsius kultiviert, bis eine Konfluenz von 90 % erreicht ist. Bereiten Sie die folgenden Proben vor, um die parasiteneliminierende Wirkung des induzierten synthetischen Kreislaufs zu bestimmen.

Kratzen Sie die RAW264.7-Zellen aus einem 25-Quadratzentimeter-Kolben. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei 300 g und suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter DMEM-Komplettmedium. Übertragen Sie 10 Mikroliter der resuspendierten Zellsuspension in ein 100-Mikroliter-Röhrchen.

Geben Sie 10 Mikroliter 0,5% Trypanblau zu den Zellen und mischen Sie gut. Laden Sie 10 Mikroliter Zell- und Trypanblau-Mischung auf den Objektträger der Zellzählkammer und entnehmen Sie die Zellzählung aus vier Kammern. Platten Sie zweimal 10 hoch vier Zellen pro Vertiefung in eine 96-Well-Platte mit Deckschicht und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.

Um eine sechsstündige infizierte Probe vorzubereiten, zentrifugieren Sie einen Milliliter Leishmania major Promastigotes in der stationären Phase bei 7.273 G für 10 Minuten und suspendieren Sie das Pellet erneut in 500 Mikrolitern DMEM-Komplettmedium. Addieren Sie nach dem Zählen zweimal mal 10 zur Potenz von fünf L.major Promastigoten in der 96-Well-Platte mit Deckglasboden. Inkubieren Sie die Zellen sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.

Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation dreimal mit PBS. Um die IMT- und IMTI-Proben vorzubereiten, züchten Sie zweimal 10 hoch fünf L.major-Promastigoten für 6, 12, 18 und 24 Stunden. Geben Sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen 24 Mikroliter reduziertes Serummedium und ein Mikrogramm Plasmid des synthetischen Schaltkreises.

In ein weiteres 1,5-Milliliter-Röhrchen geben Sie 24 Mikroliter reduziertes Serummedium und einen Mikroliter Polyethylenimin oder PEI. Ich mische gut, indem ich mindestens 10 Mal pipettiere und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiere. Übertragen Sie die PEI-Mischung in das 1,5-Milliliter-Röhrchen mit der DNA und mischen Sie sie gut.

Inkubieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang. Entsorgen Sie das Medium aus den Vertiefungen auf der 96-Well-Abdeckung, schieben Sie die Bodenplatte ein und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Geben Sie mit einer Pipette den DNA-PEI-Mix tropfenweise zu den Zellen und schütteln Sie die Platte vorsichtig.

Inkubieren Sie die Zellen drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Geben Sie anschließend 200 Mikroliter frisches reduziertes Serummedium in die Zellen, schütteln Sie die Platte vorsichtig und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Entsorgen Sie das Medium am nächsten Tag.

Nachdem Sie die Zellen zweimal mit PBS gewaschen haben, geben Sie DMEM-Komplettmedium mit Genetik und Doxycyclin zu den Zellen und inkubieren Sie es 24 Stunden lang. Die Simulation des synthetischen Schaltkreises zeigte die oszillatorische Dynamik sowohl in SDHA als auch im Tetracyclin-Repressor. Die Einführung des synthetischen Schaltkreises in Escherichia coli DH5-alpha führte zu transformierten Kolonien, die eine Resistenz gegen Kanamycin zeigten, was auf eine effiziente Transformation hinweist.

Die Transfektion mit dem synthetischen Schaltkreis und die Induktion mit Doxycyclin erhöhten die GFP-Expression in IMT-Zellen im Laufe der Zeit signifikant. Nach der Transfektion und Doxycyclin-Induktion wurde bei infizierten Makrophagen eine signifikante Verringerung der intrazellulären Parasitenlast beobachtet. Die Zytokinspiegel von Interleukin 10 und Interleukin 12 waren sechs Stunden nach der Infektion am höchsten, wobei bei der Transfektion und Induktion synthetischer Schaltkreise kein signifikanter Unterschied beobachtet wurde.

In der 24-Stunden-IMTI-Probe wurde ein signifikanter Anstieg des Tumornekrosefaktors alpha, des Interferon-gamma und des transformierenden Wachstumsfaktors beta beobachtet, was auf eine Hochregulierung der proinflammatorischen Zytokine hinweist.