Name: Bildgebung von anfänglichen Ca2+ -Mikrodomänen in primären T-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Lernen Sie die Bildgebung von Ca²⁺-Mikrodomänen in primären T-Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Calcium-Signalwegen in Immunzellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Hochauflösendes bildgebendes Verfahren zum Nachweis von Ca2+ -Mikrodomänen in T-Zellen

<ol><li>Wolf, I. M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frontrunners+of+T+cell+activation%3A+Initial%2C+localized+Ca2%2B+signals+mediated+by+NAADP+and+the+type+1+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Frontrunners of T cell activation: Initial, localized Ca2+ signals mediated by NAADP and the type 1 ryanodine receptor.</a> Sci Signal. 8 (398), 102(2015).</li>
<li>Taguchi, T., Mukai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+signalling+and+membrane+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Innate immunity signalling and membrane trafficking.</a> Curr Opin Cell Biol. 59, 1-7 (2019).</li>
<li>Trebak, M., Kinet, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling in T cells.</a> Nat Rev Immunol. 19 (3), 154-169 (2019).</li>
<li>Diercks, B. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORAI1%2C+STIM1%2F2%2C+and+RYR1+shape+subsecond+Ca2%2B+microdomains+upon+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">ORAI1, STIM1/2, and RYR1 shape subsecond Ca2+ microdomains upon T cell activation.</a> Sci Signal. 11, 0358(2018).</li>
<li>Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+sparks%3A+Elementary+events+underlying+excitation-contraction+coupling+in+heart+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Calcium sparks: Elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle.</a> Science. 262 (5134), 740-744 (1993).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+in+lymphocyte+activation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling in lymphocyte activation and disease.</a> Nat Rev Immunol. 7 (9), 690-702 (2007).</li>
<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Kummerow, C., Junker, C., Kruse, K., Rieger, H., Quintana, A., Hoth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse+controls+local+and+global+calcium+signals+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse controls local and global calcium signals in T lymphocytes.</a> Immunol Rev. 231 (1), 132-147 (2009).</li>
<li>Brock, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X4+and+P2X7+are+essential+players+in+basal+T+cell+activity+and+Ca2%2B+signaling+milliseconds+after+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">P2X4 and P2X7 are essential players in basal T cell activity and Ca2+ signaling milliseconds after T cell activation.</a> Sci Adv. 8 (5), 9770(2022).</li>
<li>Weiß, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+laminin-1+and+collagen+IV+induces+the+formation+of+Ca2%2B+microdomains+that+sensitize+mouse+T+cells+for+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Adhesion to laminin-1 and collagen IV induces the formation of Ca2+ microdomains that sensitize mouse T cells for activation.</a> Sci Signal. 16 (790), 9405(2023).</li>
<li>Diercks, B. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Ca2%2B+microdomains+for+the+adaptive+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The importance of Ca2+ microdomains for the adaptive immune response.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1871 (5), 119710(2024).</li>
<li>Woelk, L. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DARTS%3A+an+open-source+Python+pipeline+for+Ca2%2B+microdomain+analysis+in+live+cell+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">DARTS: an open-source Python pipeline for Ca2+ microdomain analysis in live cell imaging data.</a> Front Immunol. 14, 1299435(2024).</li>
<li>Diercks, B. -P., Werner, R., Schetelig, D., Wolf, I. M. A., Guse, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+calcium+imaging+method+for+local+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution calcium imaging method for local calcium signaling.</a> Methods Mol Biol. 1929, 27-39 (2019).</li>
<li>Python. Python. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.python.org/downloads/">https://www.python.org/downloads/</a> (2024).</li>
<li>Anaconda. Anaconda. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://docs.anaconda.com/free/anaconda/install/index.html">https://docs.anaconda.com/free/anaconda/install/index.html</a> (2024).</li>
<li>git. git. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://git-scm.com/book/en/v2/Getting-Started-Installing-Git">https://git-scm.com/book/en/v2/Getting-Started-Installing-Git</a> (2024).</li>
<li>DARTS. DARTS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/IPMI-ICNS-UKE/DARTS">https://github.com/IPMI-ICNS-UKE/DARTS</a> (2024).</li>
<li>DARTS. DARTS GitHub Repository. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ipmi-icns-uke.github.io/DARTS/">https://ipmi-icns-uke.github.io/DARTS/</a> (2024).</li>
<li>Oracle. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.oracle.com/de/java/technologies/downloads/">https://www.oracle.com/de/java/technologies/downloads/</a> (2024).</li>
<li>Time-Dependent Entropy Deconvolution. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ipmi-icns-uke.github.io/TDEntropyDeconvolution/General/2-usage.html#input-parameters">https://ipmi-icns-uke.github.io/TDEntropyDeconvolution/General/2-usage.html#input-parameters</a> (2024).</li>
<li>Gu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+NADPH+oxidases+DUOX1+and+DUOX2+synthesize+NAADP+and+are+necessary+for+Ca2%2B+signaling+during+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Dual NADPH oxidases DUOX1 and DUOX2 synthesize NAADP and are necessary for Ca2+ signaling during T cell activation.</a> Sci Signal. 14 (709), 3800(2021).</li>
<li>Roggenkamp, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HN1L%2FJPT2%3A+A+signaling+protein+that+connects+NAADP+generation+to+Ca2%2B+microdomain+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">HN1L/JPT2: A signaling protein that connects NAADP generation to Ca2+ microdomain formation.</a> Sci Signal. 14 (675), 5647(2021).</li>
<li>Heßling, L. D., Troost-Kind, B., Weiß, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAADP-binding+proteins+-+Linking+NAADP+signaling+to+cancer+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophy.+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">NAADP-binding proteins - Linking NAADP signaling to cancer and immunity.</a> Biochim Biophy. Acta Mol Cell Res. 1870 (7), 119531(2023).</li>
<li>Dynes, J. L., Amcheslavsky, A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+targeted+single-channel+optical+recording+reveals+multiple+Orai1+gating+states+and+oscillations+in+calcium+influx%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetically targeted single-channel optical recording reveals multiple Orai1 gating states and oscillations in calcium influx.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (2), 440-445 (2016).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>&alpha;-CD3</td><td>BD Pharmingen</td><td>553058</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-CD28</td><td>BD Pharmingen</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>Anaconda</td><td>Anaconda</td><td>https://docs.anaconda.com/free/anaconda/install/index.html&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb</td><td>Biofil</td><td>CSS-013-070</td><td>70 &micro; m Durchmesser</td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>A49865</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Paul Marienfeld GmbH</td><td>101202</td><td></td></tr><tr><td>DARTS</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/IPMI-ICNS-UKE/DARTS&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>EasySep CD4+ T-Zell-Isolationskit</td><td>Stammzelle</td><td>19852</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnetische</td><td>Multistand-Stammzelle</td><td>18010</td><td></td></tr><tr><td>Fluo 4-AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Fura Red-AM</td><td>Invitrogen</td><td>F3020</td><td></td></tr><tr><td>Gibco RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td></td><td></td>11875093</tr><tr><td>Git</td><td>GitHub</td><td>https://git-scm.com/book/en/v2/Getting-Started-Installing-Git</td><td></td></tr><tr><td>Immersionsöl</td><td>Leica</td><td>11513859</td><td></td></tr><tr><td>Kalbsserum für Neugeborene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4637</td><td></td></tr><tr><td>Oracle</td><td></td><td>Oracle https://www.oracle.com/de/java/technologies/downloads/&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptamycin</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Protein G magnetische Kügelchen</td><td>Merck</td><td>LSKMAGG02</td><td>10 & Mikro; M Durchmesser</td></tr><tr><td>Python</td><td>Python</td><td>https://www.python.org/downloads/&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Silikonfett (Basylon)</td><td>Bayer</td><td>291-1220</td><td></td></tr><tr><td>Zeitabhängige Entropie-Dekonvolution</td><td>GitHub</td><td>https://ipmi-icns-uke.github.io/TDEntropyDeconvolution/General/2-usage.html#input-parameters</td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>q-biogene</td><td>TWEEN201</td><td></td></tr></tbody></table>

bildgebung von anfänglichen ca2+ -mikrodomänen in primären t-zellen

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

In diesem Protokoll haben wir eine aktualisierte Methode zur Abbildung und Analyse anfänglicher Ca2+-Mikrodomänen in primären Maus-T-Zellen vorgestellt, die auf früheren Arbeiten unserer Gruppe 1,13 basiert. Dieser Ansatz war maßgeblich daran beteiligt, die Beteiligung von CRAC-Kanälen wie ORAI1, STIM1 und STIM2 sowie von intrazellulären Ca2+-Freisetzungskanälen wie RyR1 an frühen Ca2+-Signalereignissen zu entschlüsseln4.
Zu diesem Zweck untersuchten wir die spontane Bildung von Ca2+-Mikrodomänen, indem wir nicht-stimulierte primäre Maus-Orai1-/-, Stim1-/-, Stim2-/-- und Ryr1-/- abbildeten und sie mit WT-primären Maus-T-Zellen verglichen. Die Analyse der Ca2+-Mikrodomänenbildung umfasste die Signalbeginngeschwindigkeit, die Ca2+-Amplitude und die Anzahl der Signale pro konfokaler Ebene. Mit Ausnahme von Stim2-/- T-Zellen zeigten alle KO T-Zellen im Vergleich zu WT-Zellen eine signifikante Abnahme der lokalenCa2+-Signale und eine reduzierte basale freie zytosolischeCa2+-Konzentration. Dies führte uns zu dem Schluss, dass die Bildung von Ca2+-Mikrodomänen eng mit der Interaktion von ORAI1, STIM1 und RyR1verbunden ist 4. Darüber hinaus ist es uns gelungen, spontane Ca2+-Mikrodomänen an der Plasmamembran zu identifizieren und zu charakterisieren. Diese Ca2+-Mikrodomänen wurden durch eineCa2+-Amplitude von 290 nm ± 12 nm charakterisiert. Die Verwendung eines farbcodierten Ansatzes für Ca2+-Signale ermöglichte die Visualisierung von Ca2+-Mikrodomänen in der gesamten Zelle. Die Ergebnisse unterstreichen ferner das schnelle Einsetzen von Ca2+-Mikrodomänen, die innerhalb von Millisekunden sichtbar sind, und die Fähigkeit dieser Methode, Ca2+-Signale mit einer Langlebigkeit von wenigen Millisekunden zu detektieren4. Diese spontanen Ca2+-Mikrodomänen wurden später als adhäsionsabhängige Ca2+-Mikrodomänen (ADCM) identifiziert, die nicht nur von SOCE abhängen, sondern auch über die FAK/PLC-γ/IP 3-Signalkaskade10 und die Beteiligung von P2X49 wirken. Darüber hinaus war diese Technik von grundlegender Bedeutung für die Bestätigung der dualen Oxidasen 1 und 2 (DUOX1/2) als NAADP-produzierende Enzyme21 und HN1L/JPT222 als eines der neu entdeckten NAADP-bindenden Proteine23.
Abbildung 2 zeigt repräsentative Beispiele für Ca2+ -Mikrodomänen in primären CD4+ T-Zellen nach Bead-Kontakt von WT sowie P2x4-/- und P2x7-/- Mäusen. Die Zellen wurden mit denCa-2+ -Farbstoffen Fluo-4 AM und Fura Red AM beladen und mit einer Erfassungsrate von 25 ms (40 Frames/s) abgebildet. Um die Bildung von T-Zell-Synapsen nachzuahmen, wurden die Zellen mit anti-CD3/anti-CD28-beschichteten Kügelchen stimuliert. Die anfängliche Ca2+ -Mikrodomänenbildung wurde 1 s vor und bis zu 15 s nach dem Bead-Kontakt mit Hilfe der DART-Pipeline analysiert. Nach dem Kontakt mit der Bead zeigte die WT-Zelle in der ersten Sekunde nach der Stimulation an der Kontaktstelle der Beads eine schnelle Bildung von Ca2+ -Mikrodomänen (Abbildung 2A). Diese Ca2+ -Mikrodomänen dehnten sich in den folgenden 15 s nach dem Bead-Kontakt weiter in der Zelle aus. Im Gegensatz zur WT-Zelle zeigten die P2x4-/- und P2x7-/- Zellen (Abbildung 2B) eine verminderte Ca2+ -Mikrodomänenbildung nach Bead-Stimulation, ebenso wie die P2x4-/-a niedrigere Basalebene vor dem Bead-Kontakt. Diese repräsentativen Befunde stehen im Einklang mit den zuvor veröffentlichten Ergebnissen von Brock et al.9, die auf eine Ca2+ -Mikrodomänenbildung in WT-T-Zellen direkt nach dem Bead-Kontakt über 15 s und niedrigere Signale pro Frame in P2x4-/- und P2x7-/- Zellen hinweisen. Darüber hinaus wurde die Amplitude in P2x4-/-Zellen signifikant reduziert, was die Rolle des purinergen Signalwegs in adhäsionsabhängigen Ca2+ -Mikrodomänen weiter belegt.
Darüber hinaus kann diese Methode auch verwendet werden, um anfängliche Ca2+ -Mikrodomänen in primären humanen CD4+ T-Zellen sichtbar zu machen (Abbildung 3). In Übereinstimmung mit primären murinen T-Zellen werden anfängliche Ca2+ -Mikrodomänen an der Kontaktstelle der Kügelchen evoziert. Die gesamteCa2+ -Antwort scheint jedoch auf einer anderen Zeitskala zu erfolgen als bei murinen CD4+ T-Zellen.
Die manuelle Analyse lokaler Ca2+ -Signale ist nicht durchführbar, da sie recht mühsam und subjektiv für den einzelnen Untersucher ist. Aus diesem Grund haben wir zuvor einen Algorithmus in MATLAB Simulink entwickelt, der seine Bildverarbeitungs- und Optimierungs-Toolboxen für die Nachbearbeitung13 zur Analyse lokaler Ca2+ -Mikrodomänen verwendet.
Vor kurzem haben wir eine neue Open-Source-Postprocessing-Pipeline namens DARTS für die Ca2+ -Mikrodomänenanalyse in der hochauflösenden Lebendzellbildgebung mit der Softwareplattform Python12 entwickelt. Hier können je nach Präferenz des Benutzers verschiedene Dekonvolutionsalgorithmen ausgewählt, eine Zellformnormalisierung zur Kompensation morphologischer Zellformänderungen durchgeführt und mikroskop- und messspezifische Parameter definiert werden (z. B. Skala, Bildrate, gemessene Zeit) (Abbildung 4).
Nach der Auswahl der Parameter für die Ca2+ Microdomain-Analyse wird für jede einzelne Messung ein zweites Pop-up-Fenster geöffnet, in dem der Bead-Kontakt definiert werden kann (Abbildung 5). Um den Raupenkontakt zu definieren, kann der Benutzer mit dem Schieberegler manuell durch die TIFF-Datei scrollen und den Raupenkontaktrahmen einzeln auswählen. Der Raupenkontakt wird durch Klicken auf die Raupenkontaktstelle (Abbildung 5, Raupen- und Raupenkontakt durch gelben Ring und Pfeil gekennzeichnet) sowie durch Zellauswahl ausgewählt. Dieser Schritt muss für jede interessierende Zelle wiederholt werden. Abschließend wird die automatisierte Bildnachbearbeitung angewendet und die Ergebnisdaten werden zusammengefasst und in einer Tabelle gespeichert.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig01.jpg"> Abbildung 1: Arbeitsablauf bei der Vorbereitung des Objektträgers für die Bildgebung. (A) Fügen Sie sowohl BSA als auch PLL hinzu und verteilen Sie sie mit einem zweiten Glasabdeckglas auf dem Objektträger. (B,C) Um eine Kammer zu bauen, kleben Sie die Gummi-O-Ringe mit Silikonfett auf den Schlitten. Stellen Sie sicher, dass der gesamte Ring mit einer dünnen Fettschicht bedeckt ist, um eine ordnungsgemäße Isolierung der Kammer zu gewährleisten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig02.jpg"> Abbildung 2: Repräsentative Zellen von T-Zell-Rezeptor-abhängigen Ca2+ -Mikrodomänen in einer primären murinen Wildtyp-(A), P2x4-/- oder P2x7-/-(B) CD4+ T-Zelle. CD4+ T-Zellen wurden negativ isoliert und mit Fluo-4 AM und Fura Red beladen, wie oben beschrieben. T-Zellen wurden mit der DARTS-Pipeline analysiert, was zu vergleichbaren Zellbildern mit zuvor veröffentlichten Ergebnissenführte 9. (A) Primäre WT-T-Zelle 1 s vor der Stimulation mit anti-CD3/anti-CD28-beschichteten Kügelchen und bis zu 15 s nach der Stimulation (Maßstabsbalken 5 μm), sowie 3D-Oberflächendiagramm eines Zoom-Hineinzooms von 0 s bis 0,65 s im Kugelkontaktbereich (Maßstabsbalken 1 μm). (B) Obere Spur: repräsentative P2x4-/- primäre T-Zelle 1 s vor und bis zu 15 s nach der Bead-Stimulation. Untere Spur: repräsentative P2x7-/- primäre T-Zelle 1 s vor und bis zu 15 s nach der Bead-Stimulation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig03.jpg"> Abbildung 3: Ca2+ -Mikrodomänen in einer repräsentativen primären humanen T-Zelle nach TCR-Stimulation. Primär humane CD4+ T-Zellen wurden aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) aus Buffy-Coats isoliert und mit Fluo-4 AM und Fura Red beladen, wie oben beschrieben. Die Abbildung zeigt eine primäre humane T-Zelle 1 s vor der Stimulation mit anti-CD3-beschichteten Kügelchen und bis zu 15 s nach der Stimulation (Maßstabsbalken 5 μm) sowie einen 3D-Oberflächenplot eines Zoom-Ins von 6,25 s auf 7,5 s im Kugelkontaktbereich (Maßstabsbalken 1 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig04.jpg"> Abbildung 4: Die grafische Benutzeroberfläche (GUI) von DARTS. Die GUI ist in vier Bereiche unterteilt. Im Bereich Eingabe/Ausgabe müssen Sie Informationen über die Rohdaten angeben, einschließlich des Quellverzeichnisses und der Bildkonfiguration (entweder zwei Kanäle pro Datei oder separate Kanäle) sowie des Ergebnisverzeichnisses. Im Bereich Eigenschaften der Messung muss das Experiment mit allen relevanten Informationen beschrieben werden, wie z. B. Maßstab (Mikrometer pro Pixel), Bildrate und Messintervall relativ zum später ermittelten Startpunkt. Als nächstes kann eine Verarbeitungspipeline bestehend aus Nachbearbeitungsschritten, Formnormalisierung und der eigentlichen Analyse (Microdomain-Erkennung und Dartboard-Datenakkumulation) zusammengestellt werden. Schließlich können die Einstellungen auf dem Computer gespeichert oder von diesem geladen werden. Sobald die Analyse eingerichtet ist, klicken Sie auf Start , um fortzufahren. Um mehr über die Einrichtung zu erfahren, besuchen Sie https://ipmi-icns-uke.github.io/DARTS/General/Usage.html. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig05.jpg"> Abbildung 5: Manuelle Definition von Perlenkontakten. Wenn den Zellen während des Experiments Kügelchen hinzugefügt werden, müssen die anfängliche Kontaktzeit der Kügelchen mit einer interessierenden Zelle und die Kontaktstelle manuell definiert werden. Dazu scrollt man mit dem Schieberegler durch die Frames und findet eine Position (x,y) zu einem Zeitpunkt t. Um das Feld für die Kontaktinformationen der Perle automatisch auszufüllen, klickt der Benutzer auf die linke Hälfte des Mikroskopbildes an der Position des Perle-Kontakts. Um als Nächstes eine Zelle mit dem Raupenkontakt zu verknüpfen, klickt der Benutzer auf eine Position innerhalb der Zelle, die über einen Raupenkontakt verfügt. Die Angaben müssen durch Auswahl von ADD bead bestätigt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Bildgebung von anfänglichen Ca2+ -Mikrodomänen in primären T-Zellen

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...

imaging-initial-ca2-microdomains-in-primary-t-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Die Aufspaltung der Proteine ​​entweder innerhalb der Plasmamembran oder in intrazellulären Orten eines Regulierungsmechanismus, stark beeinflussen können Signalisierung Ergebnisse, daher zu verstehen Signalisierung ist es wichtig, die räumliche und zeitliche Verhalten der beteiligten Proteine ​​zu untersuchen. Wir beschreiben hier eine TIRF-Mikroskopie basierendes System zur Signaltransduktion in T-Zellen zu studieren, aber ist breit anwendbar.

Ein TIRF Mikroskopie-Technik für Echtzeit-, Einzigartige Bilder aus dem TCR und der damit verbundenen Signalproteine

Hier präsentieren wir Techniken zur Abbildung lokaler IP3-vermittelter Ca2+-Ereignisse mittels Fluoreszenzmikroskopie in intakten Säugetierzellen, die mit Ca2+-Indikatoren beladen sind, zusammen mit einem Algorithmus, der die Identifizierung und Analyse dieser Ereignisse automatisiert.

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in kultivierten Säugetierzellen

Die adaptive Immunität wird durch dynamische 'immunologische Synapsen' gesteuert, die zwischen T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen gebildet werden. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung von Endothelzellen sowohl als wenig untersuchte physiologische APCs als auch als eine neuartige Art von "planarem zellulärem APC-Modell".

Ein Endothelial Planar Zellmodell für Imaging immunologischen Synapse Dynamics

Die Mechanismen, die die interstitielle Motilität von CD4 Effektor T-Zellen an Entzündungsstellen bestimmen, sind relativ unbekannt. Wir stellen eine nicht-invasive Ansatz zu visualisieren und in vitro -geprimte CD4 - T - Zellen in den entzündeten Ohr Dermis, so dass für das Studium des dynamischen Verhaltens dieser Zellen in situ zu manipulieren.

Imaging CD4 T-Zell-Interstitial Migration in den entzündeten Dermis

Um die Strömungsgeschwindigkeiten und die Richtungsabhängigkeit von filamentösem Aktin an der immunologischen T-Zell-Synapse zu untersuchen, wird die hochauflösende Bildgebung lebender Zellen mit Totalreflexionsfluoreszenz kombiniert und mit räumlich-zeitlicher Bildkorrelationsspektroskopie quantifiziert.

Kortikalen Aktin Fluss in T-Zellen durch Raum-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie von Structured Illumination Microscopy Daten Quantifizierte

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für den Nachweis von einem oder mehreren Plasma und/oder intrazellulären Membranproteinen mit Grundzustand Erschöpfung (GSD) Super-Auflösung Mikroskopie in Säugerzellen. Hier besprechen wir die Vorteile und die Überlegungen der Verwendung solcher Ansätze zur Visualisierung und Quantifizierung von zellulären Proteinen.

Grundzustand Erschöpfung Super-Resolution Imaging in Säugerzellen

Dieses Protokoll beschreibt eine Imaging-basierte Methode zur Aktivierung der T-Lymphozyten mit Photoactivatable Peptid-MHC, ermöglicht präzise räumlich-zeitliche Steuerung der T-Zell-Aktivierung.

Räumliche und zeitliche Steuerung der T-Zell-Aktivierung mit Hilfe einer Photoactivatable-Agonist

Das Protokoll beschreibt eine Technik, um die Fähigkeit der primären polyklonale menschlichen T-Zellen synaptische Schnittstellen mit planaren Lipid Bilayer bilden zu studieren. Wir verwenden diese Technik, um die differenzielle Synapse Bildung Fähigkeit der menschlichen primäre T Zellen aus Lymphknoten und peripheren Blut zu zeigen.

Bewertung der synaptischen Schnittstelle der primären menschlichen T-Zellen aus peripherem Blut und Lymphgewebe

Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie die Lattice Light-Sheet-Mikroskopie verwendet wird, um die Dynamik von Oberflächenrezeptoren in lebenden Zellen vierdimensional zu visualisieren. Hier werden T-Zellrezeptoren auf CD4+ primären T-Zellen gezeigt.

Visualisierung der Oberflächen-T-Zell-Rezeptordynamik vierdimensional mit Lattice Light-Sheet-Mikroskopie

Dieses Protokoll zeigt sowohl die immunologische Synapsenbildung als auch den anschließenden polarisierten Sekretorischen Verkehr zur immunologischen Synapse. Zelluläre Konjugate wurden zwischen einer superantigen-gepulsten Raji-Zelle (als Antigen-präsentierende Zelle) und einem Jurkat-Klon (als Effektorhelfer T-Lymphozyten) gebildet.

Bildgebung der humanen immunologischen Synapse

Der Kalziumeinstrom, ein Maß für die T-Zell-Signalübertragung, ist ein effektiver Weg, um Reaktionen auf die Stimulation von T-Zell-Rezeptoren zu analysieren. Dieses Protokoll zum Multiplexen von Indo-1 mit Antikörpern, die auf Zelloberflächenmoleküle gerichtet sind, nutzt die hochflexiblen Möglichkeiten der Vollspektrum-Durchflusszytometrie.

Analyse des T-Zellrezeptor-induzierten Kalziumeinstroms in primäre murine T-Zellen mittels Vollspektrum-Durchflusszytometrie

Lernen Sie die Bildgebung von Ca²⁺-Mikrodomänen in primären T-Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Calcium-Signalwegen in Immunzellen.

Bildgebung von anfänglichen Ca²⁺ -Mikrodomänen in primären T-Zellen

Weitere Videos entdecken