Name: Bewertung der Antikörper-abhängigen, zellvermittelten Zytotoxizität in Krebszellen mit Hilfe des Antikörper-abhängigen zellvermittelten Zytotoxizitäts-Reporter-Bioassays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-13T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Lernen Sie die ADCC-Bioassay-Methode zur Bewertung therapeutischer Antikörper in Krebszellen. Dieses schnelle Protokoll ermöglicht Massenscreenings mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis innerhalb eines Tages.

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<meta charset="utf8"></head><body>Schilddrüsenkrebszellen als Effektoren in einem ADCC-Bioassay für die Krebsimmuntherapie

<ol><li>Zahavi, D., AlDeghaither, D., O'Connell, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity%3A+a+strategy+for+improving+antibody-based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Antib+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhancing antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: a strategy for improving antibody-based immunotherapy.</a> Antib Ther. 1 (1), 7-12 (2018).</li>
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<li>Chung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+fucose+reducing+effects+in+a+humanized+antibody+on+Fcgamma+receptor+binding+and+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+activities%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of fucose reducing effects in a humanized antibody on Fcgamma receptor binding and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity activities.</a> MAbs. 4 (3), 326-340 (2012).</li>
<li>Promega. ADCC Reporter Bioassay Core Kit Technical Manual. , 
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<li>Miller, A. S., Tejada, M. L., Gazzano-Santoro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+measuring+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for measuring antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in vitro.</a> Methods Mol Biol. 1134, 59-65 (2014).</li>
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<li>Gómez Román, V. R., Murray, J. C., Weiner, L. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aG%C3%B3mez+Rom%C3%A1n%2C+VR+%22Antibody+Fc%22">Antibody Fc</a>. Ackerman, M. E., Nimmerjahn, F. , Academic Press. 1-27 (2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,5 % Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>10x in PBS verdünnen, um 0,05 % Trypsin herzustellen</td></tr><tr><td>1x Tris-Puffer Kochsalzlösung (TBS)</td><td>1. BASE</td><td>BUF-3030-1X1L</td><td>Für die Membranwäsche im Western Blotting</td></tr><tr><td>1,5 M Tris-Puffer, pH 8,8</td><td>1. BASE</td><td>BUF-1419-1L-pH8,8</td><td>Für die Herstellung von SDS-Gel</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7522-100ML</td><td>Für die Probenvorbereitung von Western Blotting</td></tr><tr><td>30% Acrylamid/Bis-Lösung</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610158</td><td>Für die SDS-Gelvorbereitung</td></tr><tr><td>4x Laemmli Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610747</td><td>Für die Probenvorbereitung von Western Blotting</td></tr><tr><td>96-Well-Mikroplatten aus weißem Polystyrol mit klarem flachem Boden</td><td>Corning Incorporated</td><td>3610</td><td>Für ADCC-Assays</td></tr><tr><td>ADCC Bioassay Effektorzellen (0,65 mL)</td><td>Promega</td><td>G7011</td><td>Enthält im ADCC-Reporter-Bioassay-Core-Kit (Promega G7010), 1 x 1 Fläschchen</td></tr><tr><td>ADCC-Reporter-Bioassay-Core-Kit</td><td>Promega</td><td>G7010</td><td>Erwähnt als ADCC-Bioassay-Kit für ADCC-Assay in diesem Experiment</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td>Für die SDS-Gelherstellung</td></tr><tr><td>Bevacizumab (humanisierter Anti-VEGF-Antikörper)</td><td>MVASI-Verwendung</td> <td>als Negativkontrollantikörper in ADCC-Asssay</td><td></td></tr><tr><td>BHT-101</td><td>Leibniz-Institut DSMZ</td><td>ACC279</td><td>Humane anaplastische papilläre Schilddrüsenkrebszelllinie</td></tr><tr><td>Bio-Glo Luciferase Assay Puffer</td><td>Promega</td><td>G7941</td><td>Enthält im ADCC Reporter Bioassay Core Kit (Promega G7010), 1 x 10 mL</td></tr><tr><td>Bio-Glo Luciferase Assay Substrat (lyophilisiert)</td><td>Promega</td><td>G7941</td><td>Enthält im ADCC Reporter Bioassay Core Kit (Promega G7010), 1 x 1 Fläschchen</td></tr><tr><td>Zellschaber</td><td>GenFollower GD00235</td><td></td><td>Zur Entnahme von Zellen aus Kulturflasche</td></tr><tr><td>Cetuximab (chimärer Anti-EGFR-Antikörper)</td><td>ERBITUX-Verwendung</td> <td>als therapeutischer Antikörper im ADCC-Assay</td><td></td></tr> <tr><td>Chemilumineszierendes HRP-Substrat</td><td>Merck Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td>Für den Proteinnachweis in Western Blotting</td></tr><tr><td>Destilliertes Wasser</td><td>Gibco</td><td>15230-162</td><td>Für die Herstellung von SDS-Gel</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Nährmedienergänzung</td></tr><tr><td>iBright CL1500 Bildgebungssystem</td><td>Thermo Scientific</td><td>2462621100038</td><td>Für den Proteinnachweis in Western-Blotting-L-Glutamin</td></tr><tr><td>, 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Nahrungsergänzungsmittel für Nährmedien</td></tr><tr><td>Serum mit niedrigem IgG-Gehalt</td><td>Promega</td><td>G7110</td><td>Enthält im ADCC-Reporter-Bioassay-Core-Kit (Promega G7010) 1 x 4 mL</td></tr><tr><td>Megafuge 8R</td><td>Thermo Scientific</td><td>42876589</td><td>Zentrifuge</td></tr><tr><td>Maus monoklonale Anti-EGFR-Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>610016</td><td>Primärer Antikörper im Western Blotting</td></tr><tr><td>Monoklonale Anti-VEGFR-Antikörper der Maus</td><td>BD Biosciences</td><td>571194</td><td>Primärer Antikörper im Western Blotting</td></tr><tr><td>nicht-enzymatischer Zelldissoziationspuffer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5789-100ML</td><td>Für die Zellentnahme aus dem T75-Kolben</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>PAN Biotech</td><td>P06-07100</td><td>Antibakteriell für Nährmedien</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,2, steril filtriert</td><td>1. BASE</td><td>CUS-2048-1x1L</td><td>Verwendung als Waschlösung für Zellen</td></tr><tr><td>Pierce BCA Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Zur Messung der Proteinkonzentration</td></tr><tr><td>Protease- und Phosphatasehemmer</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32959</td><td>Für den Proteinaufschluss in der Probenvorbereitung für Western Blotting</td></tr><tr><td>PVDF Membran (Immobilin-P)</td><td>Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Für den Proteintransfer beim Western Blotting</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Maus IgG, Fc&gamma; HRP-konjugierter Sekundärantikörper</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>315-035-046</td><td>Sekundärantikörper im Western Blotting</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium</td><td>Capricorn Scientific</td><td>RPMI-XA</td><td>Zellkulturmedien</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Promega</td><td>G7080</td><td>Enthält im ADCC-Reporter-Bioassay-Core-Kit (Promega G7010), 1 x 36 mL</td></tr><tr><td>Magermilchpulver</td><td>Merck Millipore</td><td>70166-500G</td><td>Zur Membranblockierung beim Western Blotting</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>1. BASE</td><td>BIO-2050-500g</td><td>Für die Herstellung von SDS-Gel</td></tr><tr><td>SW-1736</td><td>Cytion</td><td>300453</td><td>Plattenepithelkarzinom des menschlichen Schilddrüsenkrebses Zelllinie</td></tr><tr><td>T75 Kulturflaschen</td><td>SPL Lifesciences</td><td>70075</td><td>Zellkulturflasche</td></tr><tr><td>Tecan Multimode Reader Modell Spark 10M</td><td>Tecan</td><td>1607000294</td><td>für Luminizenz-Quantifizierung</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610801</td><td>Für die Herstellung von SDS-Gelen</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Promega</td><td>H5151</td><td>Für die Membranwäsche im Western Blotting</td></tr><tr><td>Vi-cell XR Zellviabilitätsanalysator</td><td>Beckman Coulter</td><td>AL15072</td><td>Zellzähler</td></tr></tbody></table>

bewertung der antikörper-abhängigen, zellvermittelten zytotoxizität in krebszellen mit hilfe des antikörper-abhängigen zellvermittelten zytotoxizitäts-reporter-bioassays

Assessing Antibody-dependent, Cell-mediated Cytotoxicity in Cancer Cells using Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity Reporter Bioassay

Die Expression von EGFR und VEGFR in den Zielzellen BHT-101 und SW-1736 wurde mittels Western Blot nachgewiesen. Sowohl in BHT-101- als auch in SW-1736-Zellen wurde eine EGFR-Expression nachgewiesen, nicht jedoch eine VEGFR-Expression (Abbildung 3).
Mit dem ADCC-Bioassay-Kit konnten wir die ADCC-Reaktion des Anti-EGFR-Antikörpers Cetuximab unter Verwendung der EGFR-positiven Zelllinien BHT-101 und SW-1736 als Zielzellen nachweisen. Bevacizumab, ein VEGF-Inaktivator, wurde als negativer Kontrollantikörper verwendet. Unterschiedliche Konzentrationen von Antikörpern und Effektorzellen wurden mit den Zielzellen inkubiert. Das Lumineszenzsignal wurde mit einem Plattenleser detektiert (Abbildung 2). Eine höhere Faltung der ADCC-Aktivitätsinduktion wurde in Cetuximab-Gruppen (Anti-EGFR-Antikörper) gefunden, aber keine ADCC-Aktivität wurde in Bevacizumab (VEGF-Antagonist) für beide Zelllinien beobachtet. Dies zeigte den ADCC-Effekt, der auf EGFR-extrazelluläre Membranantigene für beide Zelllinien abzielt. Mit dieser Methode wurde die ADCC-Reaktion in Gegenwart von Cetuximab in zwei anaplastischen Schilddrüsenkrebszelllinien (BHT101 und SW1736) validiert (Abbildung 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67077/67077fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Ein schematisches Diagramm, das die ADCC-Reaktion mit dem ADCC-Bioassay-Kit zeigt. Antigen-Bindungsstellen im therapeutischen Antikörper binden an Oberflächenantigene in Zielzellen. Diese Bindung führt zur Bindung des Fc-Teils des Antikörpers an die FcƳRIIIa-Rezeptoren von Effektorzellen, die gentechnisch mit NFAT-RE luc verändert wurden, wodurch ein Lumineszenzsignal in den Effektorzellen erzeugt wird. Diese Zahl wurde aus dem Handbuch des ADCC Reporter Bioassay Core Kits mit Genehmigung12 geändert. Abkürzungen: ADCC = Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität; Fc = Kristallisierbarer Bereich des Fragments; NFAT = Kernfaktor der aktivierten T-Zelle; RE = Antwort-Element; luc = Luziferase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67077/67077fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67077/67077fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Lumineszenzmessung und experimentelles Diagramm des 96-Well-Plattendesigns des ADCC-Cokultursystems. Lumineszenzsignale werden von einem Lumineszenz-Reader ausgelesen. Reihe A: 1bis 9. Wells enthalten ADCC-Bioassay-Puffer. Reihe B: Die3. bis 8. Wells enthalten das ADCC-Reaktionssystem von BHT101 (Zielzellen + Antikörper + Effektorzellen). Die 2. Vertiefung ist ohne Antikörper. Die 9. Vertiefung enthält nur ADCC-Bioassay-Puffer. Reihe C:Die 3. bis 8. Wells enthalten das ADCC-Reaktionssystem von SW-1736 (Zielzelle + Antikörper + Effektorzellen). Die 2. Vertiefung ist ohne Antikörper. Die 9. Vertiefung enthält nur ADCC-Bioassay-Puffer. Reihe D: 1bis 9. Wells enthalten Assay-Puffer. Abkürzungen: ADCC = Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität; AB = ADCC-Bioassay-Puffer; VEGFR = Rezeptor des vaskulären epithelialen Wachstumsfaktors; EGFR = Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor; mAb = monoklonaler Antikörper. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67077/67077fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67077/67077fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Nachweis der EGFR- und VEGFR-Expression bei BHT-101 und SW-1736 Schilddrüsenkarzinomen mittels Western Blotting. Die Expression von EGFR, aber nicht von VEGFR wurde in beiden Zelllinien nachgewiesen. Als Ladekontrolle wurde B-Aktin verwendet. Abkürzungen: EGFR = epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor; VEGFR = vaskulärer epidermaler Wachstumsfaktor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67077/67077fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67077/67077fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Falteninduktion der ADCC-Aktivität. (A) Die Schilddrüsenkrebszelllinie BHT-101 zeigt in Gegenwart des Anti-EGFR-Antikörpers Cetuximab einen ADCC-Effekt. (B) Die Schilddrüsenkrebszelllinie SW-1736 zeigt in Gegenwart des Anti-EGFR-Antikörpers Cetuximab einen ADCC-Effekt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67077/67077fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Bewertung der Antikörper-abhängigen, zellvermittelten Zytotoxizität in Krebszellen mit Hilfe des Antikörper-abhängigen zellvermittelten Zytotoxizitäts-Reporter-Bioassays

The method for antibody-dependent, cell-mediated cytotoxicity (ADCC) represents an important tool to assess the efficacy of therapeutic antibodies in ...

assessing-antibody-dependent-cell-mediated-cytotoxicity-cancer-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Zell-vermittelten Lymphozytotoxizität (CML)-Assays können verwendet werden, um autoreaktive Reaktionen und Studium Mechanismen des Zelltods in vitro zu testen. Allerdings kann die Verwendung lebender Zellen konfokale mikroskopische Bildgebung mit Fluoreszenzfarbstoffen, die Art und Kinetik der Zelltod als auch die Wege genutzt näher untersucht werden.

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Die Chromfreisetzungsassay eine gemeinsame Assay zum Nachweis zytotoxischer T-Zell-Aktivität, hat einige Einschränkungen. Mit Antigen-spezifischen CD8-T-Zellen und menschlichen Mammakarzinom Tumorzelllinie, SKBR3, die in diesem Artikel wurde ein Impedanz-Ansatz für die Fähigkeit des Erfassens Zelltötung untersucht.

Bestimmung der optimalen zytotoxische Aktivität der Menschenrechte Her2neu spezifischen CD8 T-Zellen durch Vergleich der Cr51 Freisetzungsassay dem xCELLigence-System

Dieses Video zeigt einen Assay, der die Antikörper-vermittelte Aktivierung von T-Zell-Effektorfunktionen misst. Die Zugabe eines Influenzavirus-Hämagglutinin (HA)-spezifischen monoklonalen Antikörpers zu transfizierten Säugetierzellen, die HA exprimieren, führt zur Bildung von Immunkomplexen mit HA. Nach der Einführung von gentechnisch veränderten T-Zellen, die Fc-Rezeptoren und einen Luciferase-Reporter exprimieren, werden die T-Zellen durch die Antikörper-HA-Komplexe aktiviert, und diese...

Messung der Aktivierung von Fc-vermittelten Effektorfunktionen durch HA-Antikörper

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Dieses Protokoll stellt eine automatisierte, bildbasierte Hochdurchsatztechnik vor, um Verbindungen zu identifizieren, die die natürliche Killerzell-vermittelte Abtötung von Brustkrebszellen in Gegenwart eines therapeutischen Anti-HER2-Antikörpers modulieren.

High-Content-Screening-Assay zur Identifizierung von Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizitäts-modifizierenden Verbindungen

Die Verwendung von Referenzreagenzien für Zytokinfreisetzungsassays ermöglicht reproduzierbarere und standardisierte In-vitro-Sicherheitsprofile von immuntherapeutischen monoklonalen Antikörpern. Im Folgenden wird beschrieben, wie Zytokin-Freisetzungsassays zusammen mit einem Referenzreagenzienpanel verwendet werden können, um die Sicherheit einiger therapeutischer monoklonaler Antikörper vorherzusagen.

Verwendung von Referenzreagenzien zur Bestätigung der Robustheit von Zytokin-Freisetzungsassays für die Vorhersage der Sicherheit monoklonaler Antikörper

In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur Identifizierung von Verbindungen vor, die den ADCC-Mechanismus, einen wichtigen Krebszell-Abtötungsmechanismus von Antitumor-Antikörpern, modulieren. Die zytotoxische Wirkung von NK-Zellen wird in Brustkrebszell-Sphäroiden in Gegenwart von Trastuzumab gemessen. Die Bildanalyse identifiziert lebende und tote Killer- und Zielzellen in Sphäroide.

Quantifizierung der Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizität in einem Tumor-Sphäroid-Modell: Anwendung für die Wirkstoffforschung

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung von Doppelemulsionströpfchen, die eine T-Zelle und eine Krebszielzelle verkapseln, um die Zellabtötung auf Einzelzellebene zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die duale Quantifizierung sowohl zytotoxischer Moleküle als auch der Apoptose der Zielzellen innerhalb einer großen Population von T-Zellen.

Tröpfchenbasierter Zytotoxizitätsassay zur Beurteilung von chimären Antigenrezeptor-T-Zellen auf Einzelzellebene

Lernen Sie die ADCC-Bioassay-Methode zur Bewertung therapeutischer Antikörper in Krebszellen. Dieses schnelle Protokoll ermöglicht Massenscreenings mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis innerhalb eines Tages.

Bewertung der Antikörper-abhängigen, zellvermittelten Zytotoxizität in Krebszellen mit Hilfe des Antikörper-abhängigen zellvermittelten Zytotoxizitäts-Reporter-Bioassays (Video) | JoVE Journal

Bewertung der Antikörper-abhängigen, zellvermittelten Zytotoxizität in Krebszellen mit Hilfe des Antikörper-abhängigen zellvermittelten Zytotoxizitäts-Reporter-Bioassays

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