Isolierung, Charakterisierung und proteomische Analyse von aus Plasma gewonnenen extrazellulären Vesikeln zur Entdeckung kardiovaskulärer Biomarker

Zirkulierende extrazelluläre Vesikel als Biomarker sind ein relativ neues Feld in der Biomarkerforschung mit immensem Potenzial. Unser Protokoll zielt darauf ab, einen praktischen Ansatz für die Implementierung der extrazellulären vesikelgebundenen Biomarker-Entdeckung und -Detektion in einer Notaufnahme zu bieten. Neue Erkenntnisse haben gezeigt, dass die molekulare Fracht in extrazellulären Vesikeln und im Blutkreislauf Proteine und RNA enthält, die in mehreren Krankheitskontexten von Interesse sind.

Mehrere neue extrazelluläre Vesikel, eingeschlossene Biomarker, wurden mit der Diagnose und Prognose verschiedener kardiovaskulärer Erkrankungen in Verbindung gebracht. Die größten Herausforderungen auf dem Gebiet der Entdeckung von Biomarkern für zirkulierende extrazelluläre Vesikel sind die Konservierung extrazellulärer Vesikel und die Plasmaakquisition in Abhängigkeit von der Freisetzungsdynamik von EV. Daher ist ein stringentes Protokoll, das in die klinische Routine eingebettet ist, notwendig, um eine EV-Degradation zu vermeiden und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, insbesondere bei der Anwendung von breit angelegten Analysemethoden wie der Proteomik.

Die Entdeckung von Protein-Biomarkern, die in zirkulierendem EV eingeschlossen sind, hängt stark vom Zeitpunkt der ersten Blutabnahme im Verhältnis zum Auftreten der Symptome und der Lagerdauer der Probe aufgrund des natürlichen EV-Abbaus ab. Dieses Protokoll bietet ein praxisorientiertes Protokoll für die Isolierung von Plasma-EV und die Einführung in die Proteomik-Analyse, die in den klinischen Arbeitsablauf einer Notaufnahme integriert werden kann. Unsere bevorstehende Forschung wird sich auf die Integration verschiedener Patientenkollektive in unsere Methodik konzentrieren, darunter Patienten mit dekompensierter Herzinsuffizienz, Herzrhythmusstörungen oder Tachykardie-Kardiomyopathie sowie Längsschnittstudien von Patienten, die sich einer Bypass-Operation unterziehen.

Mit Hilfe dieses Protokolls wollen wir neuartige EV-gebundene Biomarker identifizieren, die zur Diagnose und Prognose der oben genannten Pathologien beitragen. Zu Beginn zentrifugieren Sie das menschliche Blutplasma mit einer Ultra-Zentrifuge mit einem Rotor mit festem Winkel, ohne zu brechen. Nachdem sich die Trümmer und der apoptotische Körper abgesetzt haben, überführen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen und zentrifugieren Sie ihn zwei Stunden lang bei 100.000 G bei vier Grad Celsius, ohne zu brechen, um extrazelluläre Vesikel zu isolieren.

Entfernen Sie das Röhrchen nach der Ultrazentrifugation vorsichtig. Saugen Sie den Überstand vorsichtig mit einer elektronischen Pipette an, so dass etwa ein Milliliter extrazelluläres Vesikel erschöpftes Plasma übrig bleibt. Wechseln Sie zu einer 1000-Mikroliter-Pipette, um das restliche Plasma vorsichtig zu pipettieren, ohne das extrazelluläre Vesikelpellet zu stören.

Kippen Sie das Röhrchen während des Pipettierens allmählich, um sicherzustellen, dass kein Plasma übrig bleibt, und suspendieren Sie das Pellet wieder in PBS. Als nächstes verdünnen Sie die extrazelluläre Vesikel-Stammlösung mit eiskaltem PBS in verschiedenen Verhältnissen, um während der Verfolgung einen endgültigen Zählbereich von 10 bis 100 Nanopartikeln pro Frame zu erreichen. Schalten Sie das NTA-Gerät ein und starten Sie die entsprechende Software auf dem angeschlossenen Computer.

Setzen Sie die Kammer in die Laserschatulle ein und klicken Sie auf Kamera starten, um sie zu aktivieren. Ziehen Sie einen Milliliter PBS in eine Spritze und verbinden Sie sie mit dem vorderen Schlauch. Spülen Sie das Schlauchsystem gründlich und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in der Kammer verbleiben.

Überwachen Sie die Kamera, um Luftblasen oder kontaminierende Partikel zu erkennen. Ziehen Sie nun das vorbereitete extrazelluläre Vesikel in Arbeitsverdünnung in eine Ein-Milliliter-Spritze auf und injizieren Sie es in die Kammer. Gehen Sie zu den Registerkarten "Aufnehmen" und "Verarbeiten", um die Bildschirmverstärkung an die Helligkeit des Monitors anzupassen.

Ändern Sie die Kameraebene, um die Unterscheidung von Nanopartikeln auf dem Bildschirm zu verbessern. Legen Sie auf der Registerkarte "Prozess" einen geeigneten Erkennungsschwellenwert fest, um Partikel von Hintergrundgeräuschen zu unterscheiden. Fokussieren Sie die Kamera mit dem Fokusrad auf jeder Seite des Instruments, bis Nanopartikel auf dem Bildschirm scharf erscheinen.

Nachdem Sie in den Hardware-Einstellungen für alle Messungen eine konstante Temperatur von 22 Grad Celsius eingestellt haben, klicken Sie auf den Run-Button, um die Messung zu starten. Nehmen Sie für jeden Beispiellauf mindestens drei Videos mit einer Länge von jeweils 30 Sekunden auf. Klicken Sie auf Ändern, um den Verdünnungsfaktor der Proben einzugeben, und klicken Sie schließlich auf Exportieren, um die Ergebnisse zu speichern.

Mit Hilfe der Nanopartikel-Tracking-Analyse wurden extrazelluläre Vesikel anhand von Brownie und Bewegung identifiziert und visualisiert. Die Analyse ergab eine durchschnittliche Partikelkonzentration von 1,2 mal 10 hoch 10 Partikeln pro Milliliter im Plasma von gesunden Personen, was das Vorhandensein von extrazellulären Vesikeln zeigt. Die durchschnittliche Größe der extrazellulären Plasmavesikel wurde mit 184,7 Nanometern gemessen, was den typischen extrazellulären Vesikelabmessungen entspricht.