Name: Nachweis von DNA-Brüchen in sich teilenden menschlichen Zellen durch neutralen Kometen-Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Erfahren Sie, wie der neutrale Kometen-Assay DNA-Brüche in sich teilenden menschlichen Zellen erfasst. Diese Methode untersucht Replikationsstress und die Rolle von SNF2L bei der DNA-Synthese.

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Wir danken den Mitgliedern des Dungrawala-Labors für ihren Input und ihr Feedback. Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse R35GM137800 für die Huntington-Krankheit finanziert.

Dieses Protokoll (Abbildung 1) verwendet in erster Linie adhärente U2OS-Krebszelllinien, ist aber auch an eine Vielzahl von adhärenten und Suspensionszellen anpassbar, die in Gewebekulturen gezüchtet wurden. Die in dieser Studie verwendeten Lösungen und Puffer sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Vorbereitung der Materialien
<ol><li>Stellen Sie vor dem Tag des Experiments die mitgelieferte Flasche mit niedrigschmelzender Agarose (1% niedrigschmelzende Agarose in PBS) für 5-10 Minuten in ein heißes Wasserbad, um sicherzustellen, dass die Agarose vollständig geschmolzen ist. HINWEIS: Erhitzen Sie die Flasche nicht in der Mikrowelle.</li>
	<li>Nach dem Schmelzen aliquotieren Sie schnell 100 μl der Agarose in 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen nach Bedarf und lagern Sie die Röhrchen bei 4 °C. Die erstarrte Agarose kann bei 4 °C bis zu 1 Jahr gelagert werden.</li>
	<li>Am Tag des Versuchs ist die erforderliche Anzahl von Zentrifugenröhrchen aus dem 4 °C-Lager zu entnehmen. Schmelzen Sie die Agarose, indem Sie die Röhrchen in einen Wärmeblock oder ein Wasserbad bei 42 °C legen. HINWEIS: Stellen Sie die Röhrchen vor der Ernte der Zellen bei 42 °C auf, um sicherzustellen, dass die Agarose für die Resuspension vollständig geschmolzen ist (Schritt 3.7).</li>
	<li>Bereiten Sie am Tag des Experiments frischen Lysepuffer und TAE-Puffer vor und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei Raumtemperatur bzw. 4 °C. Aliquotieren Sie außerdem 1x PBS in einem konischen 15-ml-Röhrchen und stellen Sie es in den Kühlschrank, um es in der Resuspensionsstufe (Schritt 3.5) zu verwenden.</li>
	<li>Markieren Sie die Probenidentifikationen auf dem mattierten Ende der 2-Well-Kometenobjektträger und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei Raumtemperatur.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Proben
<ol><li>Vor dem Tag des Experiments werden die Zellen in einer 6-Well-Schale ausgesät und über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO2 kultiviert. Für U2OS-Zellen wurden für jede Probe etwa 2-3 x 105 Zellen ausgesät. HINWEIS: Die Anzahl der Zellen muss je nach dem für die Analysen verwendeten Zelltyp möglicherweise angepasst werden.</li>
	<li>Behandeln Sie die Zellen am Tag des Experiments mit den Bedingungen gemäß dem Versuchsplan. Als Positivkontrolle zum Nachweis der replikationsabhängigen Bruchinduktion werden die Zellen 1 h lang mit 1 μM CPT behandelt. CPT ist ein Topoisomerase-1-Inhibitor, der Doppelstrangbrüche replikationsabhängig induziert14.</li>
</ol>3. Zellresuspension und Lyse
<ol><li>Zellkulturmedien aspirieren und zweimal mit 1x PBS spülen.</li>
	<li>Geben Sie 300 μl Trypsin in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Schale in einem Gewebekultur-Inkubator für 2-3 Minuten. HINWEIS: Eine längere Inkubation in Trypsin kann bei Kometenanalysen zu falschen Ergebnissen führen.</li>
	<li>Geben Sie 700 μl Zellkulturmedium in jede Vertiefung. Resuspendieren Sie die Proben vorsichtig und überführen Sie sie in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. HINWEIS: Es wird empfohlen, Zellen in diesem Schritt zu zählen, um die entsprechende Zelldichte in Schritt 3.6 zu erhalten und die Häufigkeit von überlappenden Schwänzen während der Analyse zu reduzieren.</li>
	<li>Die Zellsuspension bei 2400 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.</li>
	<li>Aspirieren Sie das Medium und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml kaltem 1x PBS.</li>
	<li>Schritt 3.4 und Schritt 3.5 zweimal wiederholen und die Zellen in Kälte 1x PBS bei einer Zelldichte von 2 x 105 Zellen pro ml resuspendieren. HINWEIS: Es wird empfohlen, die Lebensfähigkeit der Zellen in diesem Schritt zu beurteilen, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Anzahl lebensfähiger Zellen vorhanden ist. Eine Lebensfähigkeit von mindestens 90 % wird empfohlen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie 10 μl der Zellsuspension in 100 μl aliquotierter Agarose, mischen Sie die Mischung vorsichtig mit derselben Pipettenspitze und verteilen Sie sie gleichmäßig in einer Vertiefung des Objektträgers. Wiederholen Sie diesen Schritt bei Bedarf für alle Proben. HINWEIS: Vermeiden Sie es, alle Aliquote auf einmal aus dem 42 °C Wasserbad zu entfernen, um ein Festigen der Agarose zu verhindern. Dieser Schritt sollte vorzugsweise durch das Wasserbad durchgeführt werden, und jede Probe wird resuspendiert und gestaffelt verteilt. Vermeiden Sie das Einbringen von Blasen beim Verteilen der Agarose auf dem Objektträger, da die Lufteinschlüsse die Wanderung der Kometenschweife während der Elektrophorese beeinflussen (Schritt 4.5) und Risse im Trocknungsschritt (Schritt 5.3) verursachen</li>
	<li>Lagern Sie die Objektträger bei 4 °C im Dunkeln für 15-20 Minuten, um sicherzustellen, dass die Agarose vollständig erstarrt ist (Abbildung 2A).</li>
	<li>Legen Sie die Objektträger in Coplin-Gläser und tauchen Sie die Objektträger 1 h lang bei Raumtemperatur in Lysepuffer.</li>
	<li>Spülen Sie die Objektträger einmal mit kaltem TAE-Puffer ab und tauchen Sie die Objektträger für 30 min bei 4 °C in kalten TAE-Puffer.</li>
</ol>4. Elektrophorese
<ol><li>Stellen Sie die elektrophoretische Kammer auf eine ebene Fläche und nivellieren Sie das System mit den vier Nivellierknöpfen an den Rändern des Geräts. Legen Sie Kühlakkus in die untere Kammer, um die Lösung während der Elektrophorese kalt zu halten.</li>
	<li>Gießen Sie ca. ~850 mL kalten 1x TAE-Puffer in das Gerät.</li>
	<li>Nehmen Sie die Objektträger bei 4 °C heraus und legen Sie sie in der richtigen Ausrichtung auf die Elektrophoreseschale, um die Migration der zerbrochenen DNA zu ermöglichen. HINWEIS: Das Tablett fasst zehn 2-Well-Objektträger. Platzieren Sie die Objektträger in der Mitte des Tabletts, wenn Sie mit weniger Proben arbeiten. Wenn Sie mit einer ungeraden Anzahl von Folien arbeiten, fügen Sie eine leere Folie so ein, dass jede Vertiefung 2 Folien aufnehmen kann.</li>
	<li>Legen Sie die mitgelieferte Folienablage vorsichtig auf die Ablage, um die Objektträger abzudecken. HINWEIS: Für einen ordnungsgemäßen Betrieb des Geräts sollte das Volumen des TAE-Puffers nicht niedriger sein als die Unterseite des Overlays und nicht größer als die Oberseite des Overlays.</li>
	<li>Stellen Sie nach dem Anschließen der Kabel die Stromversorgung auf 21 V ein und führen Sie eine Elektrophorese (1 V/cm) für 40 Minuten durch. HINWEIS: Die Elektrophoresezeit muss je nach dem für die Analysen verwendeten Zelltyp möglicherweise angepasst werden. Lange Schwänze in unbehandelten Proben deuten auf eine übermäßige Laufzeit hin. Umgekehrt können kurze Schwänze in Positivkontrollproben eine unzureichende Laufzeit widerspiegeln.</li>
</ol>5. Färben
<ol><li>Nach Abschluss der Elektrophorese werden die Objektträger aus dem Gerät genommen und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in DNA-Fällungslösung getaucht.</li>
	<li>Entsorgen Sie die DNA-Fällungslösung und tauchen Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in 70%ige Ethanollösung.</li>
	<li>Die 70%ige Ethanollösung verwerfen. Die Objektträger werden entnommen und in einem Hybridisierungsofen bei 45 °C für 30 min im Dunkeln getrocknet (Abbildung 2B). HINWEIS: Die Objektträger können für den Trocknungsschritt über Nacht an einem dunklen, trockenen Ort aufbewahrt werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Vertiefungen mit 100 μl 1x SYBR Green Lösung für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.</li>
	<li>Dekantieren Sie die SYBR Green-Lösung, indem Sie die Objektträger kippen und den Überschuss entfernen, indem Sie den Rand der Vertiefung vorsichtig mit einem fusselfreien Tuch abtupfen.</li>
	<li>Legen Sie die Dias in eine Schublade und lassen Sie sie 30 Minuten trocknen.</li>
	<li>Fahren Sie mit der Bildgebung der Objektträger fort.</li>
</ol>6. Bildgebung und Analysen
<ol><li>Richten Sie das Mikroskop für bildgebende Zwecke ein. HINWEIS: Alle Bilder wurden mit einem Epifluoreszenzmikroskop aufgenommen. Es wurde eine 10-fache Vergrößerung mit 0,45 numerischer Apertur mit einer Belichtungszeit von 1/40s und einer Verstärkung von +6dB verwendet. Der Capture-Modus von monochromem 8bit wurde mit 2 x 2 Binning und Schwarzabgleichskorrektur verwendet.</li>
	<li>Legen Sie die Objektträger auf den Mikroskoptisch und beginnen Sie mit der Bildgebung mit dem FITC-Filter. HINWEIS: Verwenden Sie zuerst die unbehandelte Probe, um die Expositionszeit zu testen. Die meisten Zellen weisen keine Kometenschweife auf, da die DNA kompakter ist. Wechseln Sie zur Vertiefung mit CPT-behandelten Zellen und bilden Sie bei gleicher Belichtungszeit ab. Kometenschweife mit zunehmender Länge werden in dieser Probe aufgrund der Migration von gebrochenen DNA-Enden beobachtet.</li>
	<li>Erfassen Sie Bilder von mindestens 100 Kometen pro Probe mit der gleichen Belichtungszeit für drei technische Replikate. HINWEIS: Kometenschwänze am Ende von Deckgläsern neigen dazu, ungleichmäßig zu wandern und wirken als Ausreißer in der Probenverteilung. Die meisten Kometen, die für die Analyse aufgenommen wurden, befinden sich in der Nähe der Mitte des Deckglases (Abbildung 3).</li>
	<li>Exportieren Sie Bilder und bewerten Sie die Kometen entweder manuell (mit Image J) oder mit Hilfe einer frei verfügbaren Kometenbewertungssoftware. Kometen, die individuell unterscheidbar sind und vollständig im Sichtfeld enthalten sind, werden für die Bewertung ausgewählt. Überlappende oder teilweise sichtbare Kometen werden für weitere Analysen nicht berücksichtigt (Abbildung 4). HINWEIS: Benutzer können Kometen auf Bild J mit dem folgenden Plugin bewerten: https://cometbio.org/index.html. Details zur Bewertung von Kometen mit der CometScore-Software sind in Abbildung 5 enthalten.</li>
	<li>Plot Tail Momente, die aus den Analysen als Box- und Whisker-Plots gewonnen wurden, die 10-90 Perzentilwerte darstellen. Führen Sie Normalitätstests durch, um zu bestimmen, ob parametrische oder nicht-parametrische Tests für statistische Analysen verwendet werden sollten. HINWEIS: In den meisten Fällen werden nichtparametrische Tests mit dem Mann-Whitney-Test angewendet, wenn nur zwei Stichproben verglichen werden, oder mit dem Kruskal-Wallis-Test mit den Mehrfachvergleichen von Dunn, wenn drei oder mehr Stichproben verglichen werden.</li>
</ol>

Untersuchung des Ausmaßes von DNA-Brüchen während der DNA-Replikation 

<ol><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+as+a+requirement+for+development+of+the+contact+effect+in+Chinese+hamster+v79+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation as a requirement for development of the contact effect in Chinese hamster v79 spheroids.</a> Radiat Res. 117 (1), 79-92 (1989).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+radiation-induced+DNA+damage+and+repair+in+tumor+and+normal+cells+measured+using+the+%26%2334%3Bcomet%26%2334%3B+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the &#34;comet&#34; assay.</a> Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).</li>
<li>Singh, N. P., Mccoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+A+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat Protoc. 1 (1), 23-29 (2006).</li>
<li>De Lapuente, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+and+its+applications+in+the+field+of+ecotoxicology%3A+A+mature+tool+that+continues+to+expand+its+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">The comet assay and its applications in the field of ecotoxicology: A mature tool that continues to expand its perspectives.</a> Front Genet. 6, 180(2015).</li>
<li>Azqueta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+comet+assay+in+human+biomonitoring%3A+An+hcomet+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res+Rev+Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Application of the comet assay in human biomonitoring: An hcomet perspective.</a> Mutat Res Rev Mutat Res. 783, 108288(2020).</li>
<li>Speit, G., Hartmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+A+sensitive+genotoxicity+test+for+the+detection+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The comet assay: A sensitive genotoxicity test for the detection of DNA damage.</a> Methods Mol Biol. 291, 85-95 (2005).</li>
<li>Collins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+DNA+modifications+with+the+comet+assay%3A+A+compendium+of+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring DNA modifications with the comet assay: A compendium of protocols.</a> Nat Protoc. 18 (3), 929-989 (2023).</li>
<li>Rapp, A., Hausmann, M., Greulich, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet-fish+technique%3A+A+tool+for+detection+of+specific+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The comet-fish technique: A tool for detection of specific DNA damage and repair.</a> Methods Mol Biol. 291, 107-119 (2005).</li>
<li>Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+kinase+atr%3A+Ensuring+faithful+duplication+of+a+challenging+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The essential kinase atr: Ensuring faithful duplication of a challenging genome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (10), 622-636 (2017).</li>
<li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atr%3A+An+essential+regulator+of+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Atr: An essential regulator of genome integrity.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li>
<li>Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-coupled+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Replication-coupled DNA repair.</a> Mol Cell. 74 (5), 866-876 (2019).</li>
<li>Strumberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+topoisomerase+I+cleavage+complexes+on+the+leading+strand+of+ribosomal+DNA+into+5%27-phosphorylated+DNA+double-strand+breaks+by+replication+runoff%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Conversion of topoisomerase I cleavage complexes on the leading strand of ribosomal DNA into 5'-phosphorylated DNA double-strand breaks by replication runoff.</a> Mol Cell Biol. 20 (11), 3977-3987 (2000).</li>
<li>Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+I+inhibitors%3A+Camptothecins+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase I inhibitors: Camptothecins and beyond.</a> Nat Rev Cancer. 6 (10), 789-802 (2006).</li>
<li>Hsiang, Y. H., Hertzberg, R., Hecht, S., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Camptothecin+induces+protein-linked+DNA+breaks+via+mammalian+DNA+topoisomerase+i%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Camptothecin induces protein-linked DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase i.</a> J Biol Chem. 260 (27), 14873-14878 (1985).</li>
<li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+killing+of+brca2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly%28adp-ribose%29+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific killing of brca2-deficient tumours with inhibitors of poly(adp-ribose) polymerase.</a> Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).</li>
<li>Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+underlying+mechanism+for+the+parp+and+BRCA+synthetic+lethality%3A+Clearing+up+the+misunderstandings%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The underlying mechanism for the parp and BRCA synthetic lethality: Clearing up the misunderstandings.</a> Mol Oncol. 5 (4), 387-393 (2011).</li>
<li>Mcglynn, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bromodeoxyuridine+comet+assay%3A+Detection+of+maturation+of+recently+replicated+DNA+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The bromodeoxyuridine comet assay: Detection of maturation of recently replicated DNA in individual cells.</a> Cancer Res. 59 (23), 5912-5916 (1999).</li>
<li>Morocz, M., Gali, H., Rasko, I., Downes, C. S., Haracska, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+human+rad18-dependent+DNA+post-replication+repair+by+alkaline+bromodeoxyuridine+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of human rad18-dependent DNA post-replication repair by alkaline bromodeoxyuridine comet assay.</a> PLoS One. 8 (8), e70391(2013).</li>
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<li>Vaitsiankova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parp+inhibition+impedes+the+maturation+of+nascent+DNA+strands+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Parp inhibition impedes the maturation of nascent DNA strands during DNA replication.</a> Nat Struct Mol Biol. 29 (4), 329-338 (2022).</li>
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<li>Leung, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atr+protects+ongoing+and+newly+assembled+DNA+replication+forks+through+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Atr protects ongoing and newly assembled DNA replication forks through distinct mechanisms.</a> Cell Rep. 42 (7), 112792(2023).</li>
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<li>Sestili, P., Cantoni, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotically+driven+radial+diffusion+of+single-stranded+DNA+fragments+on+an+agarose+bed+as+a+convenient+measure+of+DNA+strand+scission%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Osmotically driven radial diffusion of single-stranded DNA fragments on an agarose bed as a convenient measure of DNA strand scission.</a> Free Radic Biol Med. 26 (7-8), 1019-1026 (1999).</li>
<li>Sestili, P., Martinelli, C., Stocchi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fast+halo+assay%3A+An+improved+method+to+quantify+genomic+DNA+strand+breakage+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">The fast halo assay: An improved method to quantify genomic DNA strand breakage at the single-cell level.</a> Mutat Res. 607 (2), 205-214 (2006).</li>
<li>Gorczyca, W., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+strand+breaks+in+individual+apoptotic+cells+by+the+in+situ+terminal+deoxynucleotidyl+transferase+and+nick+translation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays.</a> Cancer Res. 53 (8), 1945-1951 (1993).</li>
<li>Hanada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure-specific+endonuclease+mus81+contributes+to+replication+restart+by+generating+double-strand+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The structure-specific endonuclease mus81 contributes to replication restart by generating double-strand DNA breaks.</a> Nat Struct Mol Biol. 14 (11), 1096-1104 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Dieses Protokoll beschreibt einen NC-Assay zur Beurteilung von DNA-Brüchen in menschlichen Zellen, die sich einer aktiven Replikation unterziehen. Das Protokoll ist relativ einfach durchzuführen und kann von den Forschern problemlos an Bedingungen mit hohem pH-Wert für alkalische Analysen angepasstwerden 8. Es umfasst zwei kritische Schritte, wie in den Schritten 3.7 und 4.5 beschrieben. In Schritt 3.7 ist es wichtig, die geschmolzene Agarose mit den Zellen gleichmäßig über die Vertiefung zu verteilen, um eine Überlappung der Kometen während der Analyse zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass zelluläre Aggregate aufgelöst werden, bevor die Zellen in Agarose resuspendiert werden. Das Verhindern des Lösens der Pipettenspitze beim Verteilen der Agarose hilft, das Einbringen von Blasen zu minimieren. Die Bedingungen für die Elektrophorese sind entscheidend, um eine angemessene Kometenschweifmigration für die Bildgebung und Analyse zu erreichen. Forscher sollten die Art der für die Analyse verwendeten Zelllinien berücksichtigen, da das Ausmaß der Schwanzmigration und der Prozentsatz der Zellen mit Kometenschweifen je nach Zelltyp variieren (Abbildung 9). Daher wird empfohlen, die Laufzeit der Elektrophorese vor dem Experimentieren empirisch zu bestimmen.
Wenn in Positivkontrollproben (CPT-behandelte Zellen) keine Kometenschweife beobachtet werden, sollte die Wirksamkeit des Arzneimittels parallel mit alternativen Ansätzen, wie z. B. Immunfärbung für den DNA-Schadensmarker γH2AX, bestätigt werden. Eine ausgedehnte Schwanzmigration kann die Analyse der Bruchinduktion ausschließen. Die Minimierung der Elektrophoresezeit und die Beurteilung der Zellmorphologie vor der Analyse können verhindern, dass zu lange Kometenschweife erhalten werden. Eine unzureichende Trocknung der Objektträger kann zu verschwommenen und verschwommenen Kometenbildern führen. Stellen Sie sicher, dass die Agarose auf dem Kometenobjektträger gleichmäßig getrocknet und abgeflacht ist, bevor Sie sie mit 1x SYBR-Lösung färben. Wenn der Bereich der Falteninduktion eng ist, kann die Durchführung einer Dosis-Wirkungs-Kurve mit CPT helfen, einen optimalen Arbeitsbereich für experimentelle Zwecke zu bestimmen. Die Anwendung dieser Tipps zur Fehlerbehebung trägt dazu bei, die Ergebnisse dieser Assays zu maximieren.
Diese Assay-Methode ist kostengünstig und hochempfindlich im Vergleich zu anderen Techniken, die zur Untersuchung der DNA-Bruchinduktion verwendet werden, wie z. B. dem Halo-Assay29,30, dem TUNEL-Assay31 und der Pulsfeld-Gelelektrophorese32. Die derzeitige Untersuchungstechnik weist jedoch gewisse Einschränkungen auf. Es liefert keine genaue Anzahl von DNA-Läsionen, sondern bietet eine relative Schätzung der Bruchakkumulation im Vergleich zu unbeschädigten Zellen. Darüber hinaus kann es die Bruchinduktion, die zellzyklusabhängig erfolgt, nicht beurteilen. Um Veränderungen der Bruchinduktion aufgrund von Unterschieden in der Zellzyklusprogression auszuschließen, sollten Zellzyklusanalysen mittels Durchflusszytometrie parallel durchgeführt werden.

Der Comet-Assay ist eine Gelelektrophorese-Methode, die zum Nachweis von DNA-Brüchen auf Einzelzellebene verwendet wird. Es beruht auf dem Prinzip, dass offene DNA-Brüche unter elektrophoretischen Bedingungen wandern, während intakte DNA weitgehend statisch bleibt. Gebrochene DNA wandert, weil Brüche zu einer Entspannung der supercoiled DNA führen, was zu einer allmählichen räumlichen Verlagerung in Richtung der Anode in der elektrophoretischen Kammer führt, was zu einem kometenähnlichen Aussehen führt, das durch Immunfluoreszenz beobachtet wird 1,2. Das Ausmaß der DNA-Schädigung wird dann gemessen, indem die Menge an gebrochener DNA, die im Verhältnis zur kompakten DNA migriert ist, quantifiziert wird.
Die beiden am häufigsten verwendeten Kometen-Assay-Methoden sind der alkalische Kometen-Assay (AC) und der neutrale Kometen-Assay (NC). Der AC-Assay wird unter denaturierenden Bedingungen mit einer Lösung mit hohem alkalischen pH-Wert durchgeführt, während der NC-Assay in einer Lösung mit neutralem pH-Wert durchgeführt wird. Sowohl NC- als auch AC-Assays können DNA-Brüche, die im Zellkern auftreten, zuverlässig nachweisen. Die alkalische Variante ist aber auch vorteilhaft für die Detektion alkali-labiler Stellen3. Beide Formate des Assays erfordern die Verwendung von Lysebedingungen, um sicherzustellen, dass die DNA vor der Elektrophorese frei von Proteinen ist.
Dieser Assay ist eine einfache Methode zum Nachweis von DNA-Brüchen und bietet mehrere einzigartige Vorteile bei der Bestimmung von zellulären DNA-Schäden. Die Methode ist relativ einfach einzurichten und erfordert Reagenzien, die entweder im Labor hergestellt oder von kommerziellen Anbietern gekauft werden können. Da es sich um eine Einzelzellauflösungstechnik handelt, benötigt der Assay nur sehr wenig Ausgangsmaterial. Insbesondere kann der NC-Assay Brüche mit hoher Empfindlichkeit messen, die Berichten zufolge zwischen 50 und 10.000 Brüche pro Zelle erkennensoll 4. Die Vielseitigkeit dieser Technik zeigt sich in ihrem breiten Anwendungsspektrum, darunter Ökotoxikologie5, Human-Biomonitoring6 und Genotoxizitätsstudien7. Der Assay kann auch zuverlässig über verschiedene Zelltypen hinweg eingesetzt und für Hochdurchsatz-Assays8 und für die Beurteilung von Brüchen in bestimmten genomischen Regionenangepasst werden 9. Somit dient dieser Assay als schnelle und zuverlässige Technik zur Untersuchung der Bruchbildung auf Einzelzellebene.
Der Prozess der DNA-Replikation wird ständig durch mehrere endogene und exogene Stressoren herausgefordert 10,11. Ein Stillstand der Replisomen aufgrund solcher Läsionen kann zu DNA-Brüchen führen und zu einer erhöhten Instabilität des Genoms führen. DNA-Brüche entstehen auch häufig als Replikationszwischenprodukte, um die DNA-Reparatur zu erleichtern12. Darüber hinaus induzieren mehrere Chemotherapeutika replikationsabhängige Doppelstrangbrüche (DSBs), wie z. B. Camptothecin (CPT)13,14,15 und PARP-Inhibitoren 16,17. Daher dient dieser Assay als leistungsfähige Methodik, um die Art von DNA-Läsionen zu untersuchen, die Prozessierung von Replikationsgabeln zu beurteilen und das therapeutische Potenzial von DNA-schädigenden Wirkstoffen zu untersuchen. Anpassungen des Assays, die die Markierung neu synthetisierter DNA mit BrdU beinhalten, waren nützlich für die Untersuchung der replikationsassoziierten Stressphänotypen 18,19,20,21. Insbesondere ist der NC-Assay eine zuverlässige Methode zur Untersuchung der DNA-Bruchinduktion im Rahmen der Replikation, wie Studien zur Charakterisierung von Gabelproteinen22,23, zur Analyse von Replikationszwischenprodukten24,25 und zur Untersuchung von Transkriptions-Replikationskonflikten bei der Genomerhaltunggezeigt haben 26,27. Darin skizzieren wir ein NC-Assay-Protokoll mit dem Ziel, DNA-Brüche während der Replikation in menschlichen Zellen zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann von Forschern, die daran interessiert sind, Replikationsstress-assoziierte Schäden in einer Vielzahl von sich teilenden menschlichen Zellen zu bewerten, leicht implementiert werden.

<table><tbody><tr><td>1x DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Camptothecin</td><td>Selleckchem</td><td>S1288</td><td></td></tr><tr><td>Comet LMAgarose (LMA)</td><td>R& D systems</td><td>4250-050-02</td><td></td></tr><tr><td>CometAssay Elektrophorese-System II</td><td>R& D systems</td><td>4250-050-ES</td><td>Inklusive Elektrophoresetank, Sicherheitsdeckel, Kabeln, 2/20-Wells-Objektträgerschalen und Objektträger-Tablett-Overlay</td></tr><tr><td>CometScore-Software</td><td>TriTek</td><td></td><td>Open-Source-CometSlide</td></tr><tr><td></td><td>R& D systems</td><td>4250-050-03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM,</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>FisherSci</td><td>D128-4</td><td></td></tr><tr><td>Epifluoreszenzmikroskop</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum - Premium</td><td>Bio-Techne</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Trypsin-EDTA (0,05%), phenolrot</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 10.0</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>hTERT-RPE-1-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyharnstoff</td><td>Millipore Sigma</td><td>H8627</td><td></td></tr><tr><td>PARP-Inhibitor Olaparib</td><td>Selleckchem</td><td>S8096</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac&nbsp;</td><td>FisherSci</td><td>FB300Q</td><td></td></tr><tr><td>Oberflächenbehandelte sterile Gewebekulturplatte</td><td>FisherSci</td><td>FB012927</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Nukleinsäure-Gel-Färbung (10.000x)</td><td>FisherSci</td><td>S7567</td><td></td></tr><tr><td>U2OS-Zellen</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>UVP&nbsp; HB-1000 Hybridisierungs-Inkubator</td><td>FisherSci</td><td>UVP95003001</td><td></td></tr></tbody></table>

nachweis von dna-brüchen in sich teilenden menschlichen zellen durch neutralen kometen-assay

Detection of DNA Breaks in Dividing Human Cells by Neutral Comet Assay

Die DNA-Replikation wird ständig durch eine Vielzahl von endogenen und exogenen Stressoren herausgefordert, die die DNA schädigen können. Solche Läsionen, die während der Genomduplikation auftreten, können Replisomen blockieren und Replikationsgabeln in Doppelstrangbrüche umwandeln. Wenn diese toxischen DNA-Brüche nicht repariert werden, können sie chromosomale Umlagerungen auslösen, was zu einer erhöhten Instabilität des Genoms und einer erhöhten Wahrscheinlichkeit einer zellulären Transformation führt. Darüber hinaus weisen Krebszellen einen anhaltenden Replikationsstress auf, was die Anfälligkeit der Replikationsgabel in Tumorzellen zu einer attraktiven Strategie für die Chemotherapie macht. Eine äußerst vielseitige und leistungsstarke Technik zur Untersuchung von DNA-Brüchen während der Replikation ist der Comet-Assay. Diese Gelelektrophorese-Technik detektiert zuverlässig die Induktion und Reparatur von DNA-Brüchen auf Einzelzellebene. Darin wird ein Protokoll skizziert, das es den Forschern ermöglicht, das Ausmaß der DNA-Schädigung bei der mitotischen Teilung menschlicher Zellen mit Hilfe von Gabel-Stalling-Mitteln über mehrere Zelltypen hinweg zu messen. Die Kopplung mit der automatisierten Kometenbewertung ermöglicht eine schnelle Analyse und erhöht die Zuverlässigkeit bei der Untersuchung der Induktion von DNA-Brüchen.

Analyse der Bruchinduktion durch Replikationsstressreagenzien U2OS-Zellen wurden 4 h lang mit DMSO, 4 mM Hydroxyharnstoff (HU) oder 100 nM CPT behandelt und mit dem NC-Assay auf Bruchakkumulation analysiert (Abbildung 6A). Während CPT während der S-Phase Brüche induziert, indem es die Topoisomerase-1blockiert 13, blockiert die HU-induzierte Depletion von Nukleotidpools die Replikationsgabeln, die progressiv in DSBs umgewandelt werden28. Die Daten deuten darauf hin, dass die Exposition gegenüber HU oder CPT die Bruchinduktion in der S-Phase auslöst, die mit dem NC-Assay nachweisbar ist.
Analyse der Bruchinduktion im Vergleich der Lyse bei verschiedenen Temperaturen Unbehandelte U2OS-Zellen wurden in Lysepuffer entweder bei Raumtemperatur (RT) oder 4 °C inkubiert, bevor die Analyse der Bruchinduktion durchgeführt wurde (Abbildung 6B). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Temperatur, bei der die Lyse durchgeführt wird, nur einen minimalen Einfluss auf die Migration der Schwänze im Assay hat.
Zeitliche Analyse von Brüchen durch Hydroxyharnstoff (HU) U2OS-Zellen wurden entweder unbehandelt oder mit 4 mM HU für 4 h und 8 h behandelt, bevor die Bruchinduktion mit dem NC-Assay analysiert wurde (Abbildung 7). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein längeres Blockieren von Replikationsgabeln mit HU zu einem Kollaps der Replikationsgabel in DSBs führt.
Dosisabhängige Analyse von Pausen durch Camptothecin U2OS-Zellen wurden 1 h lang mit erhöhten CPT-Dosen behandelt und für Bruchanalysen mit dem NC-Assay geerntet (Abbildung 8). Während die Bruchakkumulation in Zellen, die nicht mit CPT behandelt wurden, minimal ist, nimmt der Grad der Bruchinduktion mit zunehmender Dosierung von CPT allmählich zu, was den Nutzen des Assays bei der Untersuchung dosisabhängiger Effekte auf die Bruchakkumulation während der DNA-Replikation demonstriert.
Vergleichende Analyse von Brüchen über mehrere Zelltypen hinweg Die basalen Konzentrationen von DNA-Brüchen wurden bei drei divergenten mitotischen Zelltypen untersucht: hTERT, immortalisierte retinale Pigmentepithelzellen (hTERT-RPE-1), Affenvirus 40 (SV40), große T-Antigene, die humane embryonale Nierenzellen exprimieren (HEK293T) und Knochenosteosarkomzellen (U2OS) (Abbildung 9). Jede Zelllinie zeigte eine unterschiedliche Migration der Schwanzmomente in Abwesenheit von zusätzlichem Replikationsstress, was auf Unterschiede in der Zellzyklusverteilung, der Chromatinorganisation oder der Anzahl der aktiven Replikationsgabeln zurückzuführen sein kann. Jeder Zelltyp wurde außerdem 1 h lang 1 μM CPT ausgesetzt, um eine Zunahme replikationsabhängiger DNA-Brüche zu validieren.
Analysen der Bruchinduktion mittels AC-Assay U2OS-Zellen wurden mit DMSO, 4 mM HU, 1 μM CPT oder 10 μM PARP-Inhibitor (PARPi) Olaparib behandelt und auf Bruchinduktion analysiert (Abbildung 10). Die Zellen wurden 2 Stunden lang mit DMSO, HU und PARPi behandelt, während die CPT-Behandlung 1 Stunde dauerte. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Exposition gegenüber Replikationsstress eine Bruchakkumulation verursacht, die durch den AC-Assay beobachtbar ist.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des NC-Assays. (A) Die erforderliche Anzahl von Zellen wird am Vortag in eine 6-Well-Schale ausgesät. (B) Nach medikamentösen Behandlungen werden die Zellen trypsinisiert und in kaltem PBS geerntet. (C) Die Zellen werden mit einer Pipettenspitze schonend in geschmolzener Agarose im Verhältnis 10:1 (10 μl Agarose für 1 μl Zellsuspension) resuspendiert. (D) Die Zellsuspension wird mit einer Pipettenspitze auf eine Slide Well übertragen und gleichmäßig verteilt, um die Well-Oberfläche vollständig mit Agarose zu bedecken. (E) Nach der Inkubation bei 4 °C werden die Objektträger in Lysepuffer getaucht, gefolgt von kaltem 1x TAE-Puffer. (F) Die Proben werden mit dem entsprechenden Gerät einer Elektrophorese unterzogen. (G) Die Objektträger werden dann in die DNA-Fällungslösung getaucht, gefolgt von einer 70%igen Ethanollösung. (H) Nach dem Trocknen werden die Vertiefungen mit 1x SYBR Green Lösung gebeizt. (I) Die Objektträger werden mit einem Epifluoreszenzmikroskop abgebildet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig02.jpg"> Abbildung 2: Seitenansicht von Agarose auf Kometenrutschbrunnen. (A) Nach der Inkubation bei 4 °C (Schritt 3.8) erscheint die erstarrte Agarose als "Blase" mit konvexer Form. (B) Nach dem Trocknen bei 45 °C (Schritt 5.3) erscheint die Agarose auf der Vertiefung abgeflacht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig03.jpg"> Abbildung 3: Bildgebung und Analyse von Kometen. (A) Kometen innerhalb des inneren Kreises des Bohrlochs (blau hervorgehoben) werden für die Analyse ausgewählt. Kometen am äußeren Rand des Bohrlochs werden aufgrund untypisch längerer Schweifmomente ausgeschlossen, was sie als Ausreißer markiert. (B) Mindestens 100 repräsentative Kometen werden nach dem Zufallsprinzip aus der blauen Region ausgewählt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig04.jpg"> Abbildung 4: Repräsentatives Bild von Kometen, das mit dem NC-Assay aufgenommen wurde. Das rechte Feld zeigt ein repräsentatives Sichtfeld für SYBR-grün gefärbte Kerne, während das linke Feld den Bereich (grüner Umriss) hervorhebt, der für die Bewertung von Kometen verwendet wird. Zellkerne, die teilweise sichtbar sind oder dicht beieinander gestapelt sind (rote Umrandung, rechtes Bild), werden nicht in die Analyse einbezogen. Kometen, die für die Bewertung ausgewählt werden, sollten individuell unterscheidbar sein, vollständig im Sichtfeld eingeschlossen sein und eine gleichmäßige Färbeintensität aufweisen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig05.jpg"> Abbildung 5: Repräsentatives Scoring von Kometen, das aus dem NC-Assay gewonnen wurde. (A) Einzelne Kerne werden mit der CometScore-Software skizziert. (B) Die Vollspektrumansicht (linkes Bild) ist aktiviert und der Schwellenwert (Cutoff-Balken) wird angepasst, um eine optimale Signalintensität mit minimalem Hintergrund zu erzielen. Das "Full Spectrum"-Signal sollte dem "Single Hue"-Bild entsprechen (oberes Bild, rechtes Bild) und den Umriss (unteres Bild, rechtes Bild) nicht überschreiten. (C) Die vertikale gelbe Linie in der Box ist an der Mitte des Kometenkopfes ausgerichtet, wobei der breiteste Teil des Kometenkopfes als Referenz für die Konsistenz verwendet wird. (D) Die Punktzahl für jeden analysierten Kometen wird in der oberen rechten Ecke angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig06.jpg"> Abbildung 6: Analyse der Bruchinduktion durch Replikationsstressreagenzien. (A) U2OS-Zellen wurden vor der Bruchinduktionsanalyse mit DMSO, 100 nM Camptothecin (CPT) oder 4 mM Hydroxyharnstoff (HU) behandelt. Das repräsentative Diagramm zeigt eine erhöhte Bruchakkumulation in Zellen, die mit CPT oder HU behandelt wurden. (B) Unbehandelte U2OS-Zellen wurden auf Kometenobjektträger ausgesät und für die Lyse (Schritt 3.9) entweder bei Raumtemperatur (RT) oder 4 °C inkubiert, um den Effekt der Lysetemperatur zu vergleichen. Die Endmomente aus den Analysen werden als Box-and-Whisker-Diagramme dargestellt, die Perzentilwerte von 10 bis 90 darstellen, wobei die Medianwerte durch horizontale Linien innerhalb der Felder dargestellt werden. Die p-Werte wurden unter Verwendung des Kruskal-Wallis-Tests mit den Mehrfachvergleichen von Dunn berechnet (Cutoff-p-Wert von 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig07.jpg"> Abbildung 7: Zeitliche Analyse von durch Hydroxyharnstoff induzierten Brüchen. U2OS-Zellen wurden entweder unbehandelt oder mit 4 mM HU für 4 h oder 8 h vor der Bruchinduktionsanalyse behandelt. Die repräsentative Grafik zeigt einen allmählichen Anstieg der Bruchakkumulation in Zellen, die mit HU behandelt wurden. Die Endmomente aus den Analysen werden als Box-and-Whisker-Diagramme dargestellt, die Perzentilwerte von 10 bis 90 darstellen, wobei die Medianwerte durch horizontale Linien innerhalb der Felder dargestellt werden. Die p-Werte wurden unter Verwendung des Kruskal-Wallis-Tests mit den Mehrfachvergleichen von Dunn berechnet (Cutoff-p-Wert von 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig08.jpg"> Abbildung 8: Dosisabhängige Analyse von durch Camptothecin induzierten Pausen. U2OS-Zellen wurden vor der Break-Analyse 1 h lang entweder mit DMSO oder steigenden CPT-Konzentrationen (25 nM, 100 nM, 500 nM und 1 μM) behandelt. Die Endmomente aus den Analysen werden als Box-and-Whisker-Diagramme dargestellt, die Perzentilwerte von 10 bis 90 darstellen, wobei die Medianwerte durch horizontale Linien innerhalb der Felder dargestellt werden. Die repräsentative Grafik zeigt eine dosisabhängige Zunahme der durch CPT induzierten Pausen. Die p-Werte wurden unter Verwendung des Kruskal-Wallis-Tests mit den Mehrfachvergleichen von Dunn berechnet (Cutoff-p-Wert von 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig08large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig09.jpg"> Abbildung 9: Vergleichende Analyse von Brüchen über mehrere Zelltypen hinweg. hTERT-RPE-1-, HEK293T- und U2OS-Zellen wurden entweder mit DMSO oder 1 μM CPT für 1 h behandelt. Das repräsentative Diagramm zeigt das relative Ausmaß der DNA-Schäden über die drei Zelltypen hinweg in Gegenwart oder Abwesenheit von CPT. Die Tail-Momente aus den Analysen werden als Box-and-Whisker-Diagramme dargestellt, die 10-90 Perzentilwerte darstellen, wobei die Medianwerte durch horizontale Linien innerhalb der Felder dargestellt werden. Die p-Werte wurden unter Verwendung des Kruskal-Wallis-Tests mit den Mehrfachvergleichen von Dunn berechnet (Cutoff-p-Wert von 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig09large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig10.jpg"> Abbildung 10: Analyse der Bruchinduktion durch den AC-Assay. U2OS-Zellen wurden vor der Bruchinduktionsanalyse mit DMSO, 4 mM HU, 1 μM CPT oder 10 μM PARP-Inhibitor Olaparib behandelt. Die Zellen wurden 2 h lang mit DMSO-, HU- und PARP-Inhibitoren behandelt, während die CPT-Behandlung 1 h lang behandelt wurde. Das repräsentative Diagramm zeigt eine erhöhte Bruchakkumulation in Zellen, die mit CPT-, HU- oder PARP-Inhibitoren behandelt wurden. Die Endmomente aus den Analysen werden als Box-and-Whisker-Diagramme dargestellt, die Perzentilwerte von 10 bis 90 darstellen, wobei die Medianwerte durch horizontale Linien innerhalb der Felder dargestellt werden. Die p-Werte wurden unter Verwendung des Kruskal-Wallis-Tests mit den Mehrfachvergleichen von Dunn berechnet (Cutoff-p-Wert von 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig10large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagenz</td>
			<td>Funktionierende Lösung</td>
		</tr><tr><td>Lyse-Puffer</td>
			<td>0,5 % SDS, 200 mM Tris-Cl (pH 7,4), 50 mM EDTA</td>
		</tr><tr><td>1x TAE-Puffer</td>
			<td>40 mM Trisbase, 20 mM Essigsäure, 1 mM EDTA bei pH 8,45</td>
		</tr><tr><td>DNA-Fällungslösung</td>
			<td>1 M Ammoniumacetat, 87% Ethanol</td>
		</tr><tr><td>70%ige Ethanollösung</td>
			<td>70% Ethanol in destilliertem Wasser</td>
		</tr><tr><td>1x SYBR Grüne Lösung</td>
			<td>1x SYBR Grün in 1x TAE Puffer</td>
		</tr><tr><td>DMEM-Nährmedien</td>
			<td>DMEM mit 7,5 % FBS</td>
		</tr><tr><td>DMEM/F12 Nährmedien</td>
			<td>DMEM/F12 mit 7,5 % FBS</td>
		</tr><tr><td>Alkalische Abwickellösung (zur Verwendung im alkalischen Kometen-Assay)</td>
			<td>200 mM NaOH, 1 mM EDTA in pH&gt;13</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Liste der Puffer und Lösungen.

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um das Ausmaß der DNA-Schäden zu untersuchen, die während der DNA-Replikation auftreten. Unter neutralen Bedingungen kann die Induktion von DNA-Brüchen innerhalb eines kurzen Zeitrahmens gut beurteilt werden. Darüber hinaus ist das Protokoll an andere Zelltypen und verschiedene Replikationsstressreagenzien anpassbar.

Nachweis von DNA-Brüchen in sich teilenden menschlichen Zellen durch neutralen Kometen-Assay

DNA replication is constantly challenged by a wide variety of endogenous and exogenous stressors that can damage DNA. Such lesions encountered during ...

detection-of-dna-breaks-in-dividing-human-cells-by-neutral-comet-assay

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Das Video zeigt den Kometen-Assay zum Nachweis von DNA-Schäden nach Exposition gegenüber schädlichen Stoffen. Unter alkalischen Bedingungen wickelt sich die DNA ab und denaturiert, und bei der Elektrophorese wandern die unbeschädigte und die beschädigte DNA unterschiedlich im Agarosegel und bilden eine kometenförmige Struktur. Die langsam wandernde unbeschädigte DNA bildet den kreisförmigen Kometenkopf, während die schnell wandernden beschädigten DNA-Fragmente den länglichen Kometenschweif...

Comet Assay zur Detektion von DNA-Schäden in Zellen

Der Comet Assay ist ein effizientes Mittel zur Feststellung von Einzel-und Doppelstrang-Brüche, einschließlich Alkali-labile Websites und DNA-DNA/DNA-protein Cross-Links auf der DNA in allen Zellen, einschließlich Neuronen im Hippocampus. Die Methode nimmt den Vorteil dieser differentielle Migration von DNA in einem elektrischen Feld aufgrund von Unterschieden in Menge an DNA-Schäden.

Testen DNA Damage in Hippocampus-Neuronen mit dem Comet Assay

Wir beschreiben hier eine Plattform, die Comet-Assay Nachweis von DNA-Schäden mit beispielloser Durchsatz ermöglicht. Die Gerätemuster Säugerzellen in einem Microarray und ermöglicht die parallele Verarbeitung von 96 Proben. Der Ansatz erleichtert Analyse der Ausgangsniveau von DNA-Schäden, die Exposition induzierten DNA-Schäden und DNA-Reparatur-Kinetik.

CometChip: Eine Hochdurchsatz-96-Well-Plattform für Mess DNA-Schäden in menschlichen Zellen Microarray

Die Comet-Assay ist eine effiziente Methode um zu erkennen, dass DNA-Schäden einschließlich Einzel- und Doppelstrang-DNA bricht. Wir beschreiben basische und neutrale Comet Assays zur Messung der DNA-Schäden in den Krebszellen, die therapeutische Wirkung der Chemotherapie zu bewerten.

Bewertung von In-vitro- DNA-Schäden mit Comet-Assay

Dieses Protokoll beschreibt mehrere Verfahren zur Herstellung hochwertiger gefrorener Gewebeproben zum Zeitpunkt der Nekropsie zur Verwendung im Kometentest zur Beurteilung von DNA-Schäden: 1) Hackfleisch, 2) abgekratzte Epithelzellen aus dem Magen-Darm-Trakt und 3) gewürfeltes Gewebe Eine Homogenisierung mit einem Gewebeminincing-Gerät erforderlich.

Verwendung von gefrorenem Gewebe im Kometentest zur Bewertung von DNA-Schäden

Hier beschreiben wir zwei Modifikationen des DNA-Faserassays zur Untersuchung einzelsträngiger DNA-Lücken bei der Replikation von DNA nach Läsionsinduktion. Der S1-Faserassay ermöglicht die Detektion von postreplizierenden Lücken mit der ssDNA-spezifischen S1-Endonuklease, während der lückenfüllende Assay die Visualisierung und Quantifizierung der Spaltreparatur ermöglicht.

Nachweis der postreplizierenden Lückenakkumulation und -reparatur in menschlichen Zellen mit dem DNA-Faser-Assay

Der Kometentest ist ein beliebtes Mittel zum Nachweis von DNA-Schäden. Diese Studie beschreibt einen Ansatz zum Ausführen von Objektträgern in repräsentativen Varianten des Kometenassays. Dieser Ansatz erhöhte die Anzahl der Proben signifikant und verringerte gleichzeitig die Assay-Laufzeit, die Anzahl der Objektträgermanipulationen und das Risiko einer Beschädigung von Gelen.

Ein Hochdurchsatz-Comet-Assay-Ansatz zur Beurteilung zellulärer DNA-Schäden

Dieses Protokoll beschreibt eine effektive Methode zur Quantifizierung des Unterschieds in der DNA-Schädigung, die durch Typ-I- und Typ-II-Inhibitoren in FLT3-mutierten Zellen durch Anwendung des Comet-Assays induziert wird.

Comet-Assay zur Quantifizierung von DNA-Schäden in FLT3-Mutanten-exprimierenden 32D-Zellen nach Exposition gegenüber Typ-I- und Typ-II-FLT3-Inhibitoren

"E-DNA"-Sensoren, Reagenzienfreier haben elektrochemische Biosensoren, die gute Leistungen, auch wenn direkt in Blut und anderen komplexen Matrices in Frage gestellt, um den Nachweis einer Vielzahl von Nukleinsäure-, Protein-und Small Molecule Analyten angepasst. Hier präsentieren wir ein allgemeines Verfahren für die Herstellung und Verwendung solcher Sensoren.

Herstellung von elektrochemischen DNA Biosensoren für die Reagenzienfreier Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen und kleinen Molekülen

Wir zeigen die Montage und Anwendung eines molekularen Maßstab Gerät durch eine Topoisomerase Protein versorgt. Das Konstrukt ist ein bio-molekularen Sensor, der im Wesentlichen zwei Arten von DNA-Brüchen in Gewebeschnitten Etiketten durch Anbringen von zwei unterschiedlichen Fluorophoren an ihren Enden.

In-vitro-Assembly von Semi-künstliche molekulare Maschine und ihre Verwendung zum Nachweis von DNA-Schäden

Erfahren Sie, wie der neutrale Kometen-Assay DNA-Brüche in sich teilenden menschlichen Zellen erfasst. Diese Methode untersucht Replikationsstress und die Rolle von SNF2L bei der DNA-Synthese.

Nachweis von DNA-Brüchen in sich teilenden menschlichen Zellen durch neutralen Kometen-Assay

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