Name: Beurteilung der DNase-Aktivität durch ratiometrischen Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Erfahren Sie die ratiometrische FRET-Methode zur empfindlichen Detektion und quantitativen Analyse von DNase-Aktivität unter verschiedenen pH-Bedingungen. Diese Technik ermöglicht Echtzeit-Monitoring schwacher Nuklease-Aktivität.

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Der ratiometrische Fluoreszenzansatz ist eine analytische Methode, die Verhältnisse von Fluoreszenzsignalen verwendet, anstatt sich ausschließlich auf die Intensität eines einzelnen Signals zu verlassen 1,2. Der Vorteil der Verwendung der Verhältnisse besteht darin, dass sie eine interne Kalibrierung ermöglichen und viele Zufallsfaktoren ausgleichen, wie z. B. Schwankungen der Proben- und Sondenkonzentrationen, Geräteparameter usw. Dies erhöht die Genauigkeit und Empfindlichkeit von Fluoreszenzsonden.
Im speziellen Kontext der Förster-Resonanzenergietransfersonden (FRET) bezieht sich der Begriff "ratiometrisch" auf die Tatsache, dass die Messung auf dem Verhältnis von zwei Emissionssignalen aus dem Paar FRET-Donor- und Akzeptorfluorophoren basiert. Um die Aktivität des Zielanalyten zu quantifizieren, verwenden ratiometrische FRET-Sonden das Verhältnis der Emissionsintensitäten von Akzeptor zu Donor (oder in einigen Fällen das invertierte Donor/Akzeptor-Verhältnis). Das Verhältnis steht in direktem Zusammenhang mit dem FRET-Wirkungsgrad. Es bietet einen selbstnormalisierenden Mechanismus, der Hintergrundrauschen minimiert und Schwankungen der Beleuchtungsbedingungen und der Sondenkonzentration berücksichtigt3.
Zu den jüngsten interessanten Anwendungen der ratiometrischen Methode gehören ihre Verwendung in ratiometrischen elektrochemischen Biosensoren zum Nachweis zirkulierender Tumor-DNA (ctDNA)4,5, in Brownschen bewegungsbetriebenen Bio-Nanomaschinen zur FRET-Detektion der phagozytären Phase der Apoptose6 und zur Express-FRET-Markierung und Analyse der phagozytären Clearance7. Der in dieser Arbeit beschriebene ratiometrische FRET-Ansatz ist nützlich für die quantitative Bewertung der DNase-Aktivität. Die Messungen basieren auf den Verhältnissen der FRET-Paaremissionen. Aufgrund seiner Fähigkeit, selbst geringfügige und langsame DNA-Spaltungen zu detektieren, eignet sich der Assay besonders gut für die Untersuchung schwacher nukleolytischer Aktivität, die längere Beobachtungszeiträume erfordert, und für Experimente bei unterschiedlichen pH-Werten.
Hier werden einige spezifische Vorteile des ratiometrischen FRET-Assays anhand seiner Anwendung zur Untersuchung der DNase-Aktivität eines schwachen Nuklease-Leukozyten-Elastase-Inhibitors (LEI) veranschaulicht. Der Bericht enthält ein detailliertes Protokoll mit einer Schritt-für-Schritt-Anleitung und einer Beschreibung der ratiometrischen Datenanalyse.
Beschreibung der ratiometrischen FRET-Sonde
Die ratiometrische FRET-Sonde ist ein selbstkomplementäres 38-mer-DNA-Oligo, das das Donor-Akzeptor-FRET-Paar von FAM-TAM (Fluorescein-Tetramethylrhodamin) trägt. Seine Sequenz ist 5'-AAGGGT(TAM) CCTGCTGCAGGACCCTTAACGCATTATGCGT(FAM)T-3'. Das selbsthybridisierende 38-mer nimmt eine klammernförmige Konformation an, die aus zwei miteinander verbundenen Haarnadeln aus 23 und 15 Nukleotiden besteht, die ihre beiden Fluorophore 23,8 Å voneinander entfernt positionieren. Dies ist deutlich näher als der Förster-Radius für dieses Paar, R0 = 55 Å8. Eine solche Positionierung entspricht einem sehr hohen Wirkungsgrad der Energieübertragung vom Donor zum Akzeptor7: EFRET = 0,993477. Dies hat zur Folge, dass die FRET-Sonde bei Beleuchtung bei der FAM-Anregungswellenlänge (488 nm) Fluoreszenz bei der Emissionswellenlänge des Akzeptors TAM (580 nm) emittiert, während die FAM-Emission (525 nm) unterdrückt wird.
Abbildung 1A zeigt die von UNAFold vorhergesagte Sekundärstruktur der Sonde mit kleinen Schleifen an beiden Haarnadelspitzen aufgrund sterischer Behinderung durch enge Krümmung. Das Schema der DNA-Brucherkennung durch die FRET-Sonde ist in Abbildung 1B dargestellt. Es zeigt sich, dass der Bruch der Oligosonde durch eine DNase ihr FRET-Paar trennt. Diese Trennung führt zu drastischen Veränderungen in den Emissionsspektren beider Fluorophore in der Sonde. Abbildung 1C zeigt die Sondenemissionsspektren vor und nach der Spaltung und zeigt, dass die Spaltung des FRET-Paares nach der Spaltung der DNase II-Sonde die Donoremission bei 525 nm (ID 525 nm) erhöht und gleichzeitig die Akzeptoremission bei 580 nm (IA 580 nm) verringert. Abbildung 1D zeigt die PAGE-Gel- und FRET-Verhältnisse, die den Emissionsspektren entsprechen. Die Spaltung der DNase-II-Sonde erzeugte zwei breite Banden, die 12-16-mer FAM (grün) und 20-24-mer TAM (rot) Fragmenten entsprechen, was auf zufällige Schnitte des 38-mer auf beiden Seiten von T23 in der Nähe des Verbindungsbereichs zwischen den Haarnadeln hinweist.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67134/67134fig1v5.jpg"> 
Abbildung 1: Aufbau und Funktionsweise der ratiometrischen FRET-Sonde. (A) Vorhergesagte Sekundärstruktur der FRET-Sonde, die von UNAFold erzeugt wurde. (B) Schematische Darstellung der funktionierenden FRET-Sonde. Die ratiometrische FRET-Sonde ist ein klammernförmiges 38-mer-Oligonukleotid, das mit einem FRET-Donor (FAM) und -Akzeptor (TAM) bei einem effektiven FRET-Abstand von 23,8 Å markiert ist und einen FRET-Wirkungsgrad von &gt;99 % gewährleistet. Durch die Spaltung der Oligosonde durch eine DNase wird das FRET-Paar abgetrennt, wodurch FRET aufgehoben wird. (C) Emissionsspektren der FRET-Sonde vor und nach der DNase II-vermittelten Spaltung. Vor der Spaltung wird die FAM-Emission unterdrückt und die TAM-Emission ist prominent. Die DNase-vermittelte Spaltung trennt FAM und TAM, wodurch die FAM-Emission (525 nm Peak) wiederhergestellt und die TAM-Emission (580 nm Abfall) aufgehoben wird. λAnregung = 488 nm. (D) Ratiometrische und elektrophoretische Beurteilung der FRET-Sonde vor und nach der DNase II-Spaltung. Oberes Bild: FRET-Verhältnisse (RD/A = ID 525 nm / IA 580 nm), die ein quantitatives Maß für den Sondenzustand darstellen. Rot: ungespalten; grün: DNase II-gespalten. Unteres Bild: Denaturierendes PAGE-Gel entsprechend den fluorometrischen Daten. Die Spaltung von DNase II ergibt FAM-markierte Fragmente (12-16 nt, grün) und TAM-markierte Fragmente (20-24 nt, rot), was auf eine Spaltung in der Nähe der Verbindung zwischen den Haarnadeln hinweist, die T23 flankieren. Die ungespaltene Kontrolle zeigt gelbe Fluoreszenz. Leiter: FAM- und TAM-markierte Oligonukleotide, die den 5'- und 3'-Segmenten der 38-mer-Sonde entsprechen, mit fluoreszierenden Markierungen in ihren ursprünglichen Positionen. Reaktionsbedingungen: 10 mM Natriumacetatpuffer (pH 5,2), 1 pmol/μl FRET-Sonde, 0,0033 U/μl DNase II, 24 h bei 37 °C. RD/A = ID 525 nm/IA 580 nm; λAnregung = 488 nm. UNAFalte Bedingungen: 1 μM FRET-Sonde, 10 mM Na+, 0 mM Mg2+, 37 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67134/67134fig1v5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Während die Änderungen in den einzelnen Emissionsspektren der Prüfung offensichtlich sind, erfordern quantitative Vergleiche zwischen einer großen Anzahl von Emissionsspektren einen benutzerfreundlicheren und kompakteren quantitativen Parameter. Diese Rolle spielt das FRET-Verhältnis. Die vorgestellte Fluoreszenzmethode gehört zu einer Gruppe von ratiometrischen Ansätzen, die sich für ihre quantitative Bewertung auf die direkten (zweikanaligen) Verhältnisse der Fluoreszenzemissionen von FRET-Paarmitgliedern stützen 2,9.
Der Ansatz verwendet das Verhältnis der Donor/Akzeptor-Emissionen (RD/A = ID 525 nm / IA 580 nm), das mit der FRET-Effizienz zusammenhängt und den Zustand des 38-mers (gebrochen oder intakt) quantitativ charakterisiert. Das ID / IA-Verhältnis bietet einen selbstnormalisierenden Mechanismus, der von Natur aus Schwankungen in Faktoren wie Sondenkonzentration, Anregungsintensität und Photobleichung berücksichtigt3. Der Ansatz ist nur für FRET-Sonden geeignet, bei denen Donor und Akzeptor innerhalb derselben Sonde verknüpft sind, wenn ihr Verhältnis bekannt und konstant ist. Aus diesem Grund muss der Ansatz weder die direkte Anregung des Akzeptors noch das Donor-Übersprechen2 berücksichtigen. Die feste Donor-Akzeptor-Stöchiometrie der Sonde stellt sicher, dass die Donor/Akzeptor-Emissionsverhältnisse durch diese Schwankungen nicht beeinflusst werden und den Zustand der Sonde direkt widerspiegeln. Als Ergebnis liefert das Verhältnis der Donor-Akzeptor-Emissionen einen quantitativen DNA-Spaltungsparameter mit eingebauter Signalnormalisierung 2,3.
Der Assay verwendet das ID / IA-Verhältnis (und nicht das entgegengesetzte IA / ID-Verhältnis ), da dieses Verhältnis die FRET-Beendigung nach der Sondenspaltung beschreibt und sich daher in die gleiche Richtung ändert wie die DNase-Aktivität - mit zunehmender Spaltung. Dies wird durch Abbildung 1D veranschaulicht, die das FRET-Verhältnis der ratiometrischen Sonde und ihre PAGE-Elektrophorese vor und nach ihrer Spaltung durch DNase II zeigt, die beide den Spektren in Abbildung 1C entsprechen. Um die Bequemlichkeit, Zeitökonomie und Benutzerfreundlichkeit des ratiometrischen FRET-Assays zu demonstrieren, wurde er eingesetzt, um die DNase-Aktivität eines schwachen Nuklease-Leukozyten-Elastase-Inhibitors (LEI) aufzudecken und zu untersuchen.
Schwacher Nuklease-LEI
Der Proteasehemmer LEI ist von Natur aus metastabil, d.h. topologisch unausgeglichen. Diese Eigenschaft ist essentiell für seinen hemmenden Mechanismus. Wenn seine Zielprotease die LEI-Schleife (RSL) spaltet, erfährt das Proteaseinhibitormolekül eine drastische Konformationsänderung, wodurch die Protease mechanisch in eine inaktive Form gedehntwird 10,11. Bemerkenswert ist, dass dadurch auch das LEI-Molekül selbst aufgebrochen und aufgebläht wird und eine kryptische DNase-Stelle entlarvt wird, die von ihrer nativen Faltung bedeckt ist, wodurch der LEI in eine aktive Endonuklease L-DNase II umgewandelt wird (LEI-abgeleitete DNase II)11,12. Die kryptische DNase-Stelle kann auch durch die Denaturierung und den Bruch des LEIs freigelegt werden, die durch seine nächtliche Inkubation bei pH 2 in Schwefelsäure10,13 verursacht werden. Die Verwendung dieses FRET-Assays zur Untersuchung des LEI zeigte, dass harte chemische Denaturierungsbehandlungen und gezielte enzymatische Spaltung nicht unbedingt erforderlich sind, um die latente nukleolytische Aktivität des LEI zu entlarven.
Die vorgestellte Anwendung und das Protokoll des ratiometrischen FRET-Ansatzes beschreiben die Aufdeckung einer schwachen DNase-Aktivität, die inhärent in normalen, nicht denaturierten LEIs vorhanden ist. Die Entdeckung der intrinsischen nukleolytischen Fähigkeit von ungespaltenen LEI und deren Analyse war möglich, da der Assay für längere Beobachtungszeiträume bei unterschiedlichen sauren pH-Werten geeignet war.

<table><tbody><tr><td>96-Well-Platte</td><td>Falke</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>DNA-FRET-Sonde</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>5'-AAG GGT(TAM)CCT GCT GCA GGA CCC TTA ACG CAT TAT GCG T(FAM)T- 3'; FAM &ndash; Fluorescein-dT; &nbsp; TAM &ndash; Tetramethylrhodamin-dT.&nbsp;</td></tr><tr><td>DNase II</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Nr. D8764</td><td></td></tr><tr><td>EVOLT digitale SLR-Kamera</td><td>Olymp</td><td>E500</td><td></td></tr><tr><td>Gelelektrophorese-Gerät mit Stromversorgung</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LEI</td><td>Novoprotein (Englisch)</td><td>CJ01</td><td></td></tr><tr><td>LiCOR Gel-Bildgebungssystem</td><td>LiCOR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Vorgegossenes PAGE Gel</td><td>Invitrogen</td><td>EC68852</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat-Pufferlösung pH 5,2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Artikel-Nr.: S2899-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofluorometer</td><td>Tecan</td><td></td><td>Saffire 2</td></tr></tbody></table>

beurteilung der dnase-aktivität durch ratiometrischen fluoreszenz-resonanz-energietransfer

Assessment of DNase Activity by Ratiometric Fluorescence Resonance Energy Transfer

Diese repräsentative Studie unterstreicht die spezifischen Vorteile des ratiometrischen FRET-Ansatzes für die Untersuchung langsamer enzymatischer Reaktionen, die längere Beobachtungszeiträume erfordern. Insbesondere demonstriert die Anwendung die Detektion und Analyse der inhärenten DNase-Aktivität von LEI unter Verwendung eines ratiometrischen FRET-Systems. Die Ergebnisse dieser Studie sind in Abbildung 2 dargestellt.
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Beurteilung der DNase-Aktivität durch ratiometrischen Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer

The present protocol describes a simple and sensitive ratiometric F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) assay for the detection and quantitative ...

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Research

Forschung

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