Name: Herstellung von nanofibrillär strukturiertem Kollagen für das Tissue Engineering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Erfahren Sie eine scherungsbasierte Extrusionsmethode zur Herstellung von Kollagenhydrogelen mit nanofibrillärer Strukturierung für Tissue-Engineering-Anwendungen. Diese kostengünstige Technik ermöglicht präzise Kontrolle der Fibrillenorganisation.

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<meta charset="utf8"></head><body>Herstellung von künstlich hergestelltem nanofibrillärem Kollagen mit gerichteter Strukturierung

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Kollagen I, hohe Konzentration, Rattenschwanz</td><td>Corning</td><td>CB354249</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TE-2000-U Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>TE-2000-U&nbsp;</td><td>Inverses Mikroskop</td></tr><tr><td>Extra dicke Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-267-005</td><td>Eignet sich gut für Kollagenextrusionsoberflächen</td></tr><tr><td>FEI Helios G3 NanoLab DualBeam</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>Rasterelektronenmikroskop</td></tr><tr><td>Glasschneider Werkzeugsatz 2mm-20mm Pencil Style Oil Feed Hartmetallspitze</td><td>Amazon/MOARMOR B07Y1D243H</td><td></td><td>Option für einen</td></tr><tr><td>Glasschneider Hamilton Kel-F Hub Blunt Point Nadeln (Luer Lock, 22 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-815-574</td><td>Nadeln für die Kollagenextrusion</td></tr><tr><td>Nexterion Slide H 3-D</td><td>Schott</td><td>NC0782819</td><td>Hydrophobe Objektträger</td></tr><tr><td>PBS Tabletten</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 8000</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>Nahtlose Cellulose-Dialyseschläuche&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25645G</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin Dialyse-Clips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI68011</td><td></td></tr><tr><td>Synthware Glasschneider</td><td>Synthware</td><td>31-501-927</td><td>Option für einen Glasschneider</td></tr></tbody></table>

herstellung von nanofibrillär strukturiertem kollagen für das tissue engineering

Production of Nanofibrillar Patterned Collagen for Tissue Engineering

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache scherbasierte Extrusionstechnik zur Herstellung von Kollagen-Hydrogelen, die entweder aus ausgerichteten (Abbildung 2) oder zufällig (Abbildung 3) orientierten Nanofibrillen bestehen. Die Strukturierung von Nanofibrillen beruht auf der präzisen Steuerung der Scherkräfte, die durch die kombinierte Modulation der Spritzengeschwindigkeit und der Kollagenextrusionsrate erreicht wird. Optimale Werte für die Induktion der Fibrillenausrichtung wurden zuvor mit einer Spritzengeschwindigkeit von 340 mm/s und einer Kollagenextrusionsrate von 3,2 ml/min bestimmt28,29. Dieses Gleichgewicht ist nicht nur für die ausgerichtete Nanofibrillenbildung entscheidend, sondern auch für die Sicherstellung der Funktionalität der Hydrogele auf der Makroskala. Wenn dieses Verhältnis falsch ausgerichtet ist, besteht die Gefahr, dass Hydrogele hergestellt werden, die nicht wie erwartet strukturiert sind, sowie Hydrogele, die Kollagenstreifen enthalten, die für die Verwendung zu dünn (&lt;0,5 mm Durchmesser), dick (&gt;1,5 mm Durchmesser) oder gewellt sind. Zum Beispiel führt eine zu schnelle Bewegung einer Spritze in Verbindung mit einer zu langsamen Extrusionsrate zu dünnen Streifen, während das entgegengesetzte Verhältnis je nach Grad der Unwucht des Verhältnisses dicke oder wellige Streifen ergibt (Abbildung 4A-D). Diese Unterschiede in den makroskopischen Eigenschaften können zu einer ausreichenden Variabilität von Streifen zu Streifen führen, um die Zellablagerung und die lokale Adhäsion zu beeinflussen.
Nach der Kollagenextrusion und -assemblierung durchläuft die Hydrogelherstellung eine erste Trocknungsphase, oft 1 bis 3 Stunden, bevor sie einen Waschschritt in 1x PBS durchläuft (Abbildung 2 und Abbildung 3). Das Erreichen optimaler topografischer Ergebnisse hängt von einem feinen Gleichgewicht zwischen dem Timing und der Intensität des Waschschritts ab. Unzureichendes oder verzögertes Waschen führt zu einer gestörten Fasertopographie, die durch die Abdrücke von PBS-Salzkristallen auf den Fibrillen gekennzeichnet ist. Im Gegensatz dazu führt eine übermäßige oder vorzeitige Waschung von Kollagen nach der Herstellung zu einer gelösten Kollagenschicht, die die topographischen Merkmale bedeckt (Abbildung 4E,F).
Die Rasterelektronenmikroskopie (REM) bestätigt das Vorhandensein einer ausgerichteten oder zufälligen Nanofibrillenorientierung innerhalb der Kollagenhydrogele. Sowohl in den ausgerichteten als auch in den zufälligen Hydrogelen weisen die Nanofibrillen Fibrillendurchmesser zwischen 30 und 50 nmauf 29. Qualitativ ist es offensichtlich, dass ausgerichtete Hydrogele uniaxial ausgerichtete Nanofibrillen enthalten (Abbildung 5). Dieses Alignment wurde zuvor mit Hilfe der schnellen 2D-Fourier-Transformationsanalyse quantifiziert, bei der das Alignment-Diagramm zwei unterschiedliche Peaks im Abstand von 180° für ausgerichtete Hydrogele zeigt, im Gegensatz zu zufällig ausgerichteten Hydrogelen, die nur niederfrequente Peaksaufweisen 28.
Hellfeldbilder von primären Skelettmuskelmyoblasten der Maus zeigen, dass die anisotrope nanotopographische Führung der Kollagenfibrillen die zelluläre Ausrichtung fördert (Abbildung 6). Es wurde gezeigt, dass diese nanostrukturierten Kollagen-Hydrogele nicht nurin Myoblasten, sondern auch in anderen Zelltypen, wie z. B. Endothelzellen, eine zelluläre Ausrichtung induzieren23,24.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Vorbereitung von Kollagen mit ultrahoher Dichte und Schnittglasobjektträgern. (A-F) Prozess der Kollagendialyse: (A) Vorbereitung des Dialyseschlauchs in 3-Zoll-Streifen und Befestigung des ersten Clips, (B) Beladung des Schlauchs mit hohem Dichtekollagen in den Schlauch und Befestigung des zweiten Clips, (C) Ummantelung des beladenen Dialyseschlauchs mit Polyethylenglykol (PEG)-Flocken, (D) Entfernung von gesättigten PEG-Flocken, (E) Abspülen von PEG-Flocken mit Wasser und (F) Lagerung von Kollagen mit ultrahoher Dichte in Mikrozentrifugenröhrchen. (G-L) Prozess des Schneidens von Objektträgern: (G) Erwerb von Objektträgern für Studienzwecke, (H,I) Ritzen von Glasobjektträgern mit Diamantspitzen-Glasschneider, (J) Brechen des Objektträgers von der nicht geritzten Seite, (K) Spülen des geschnittenen Glases mit Wasser und (L) Trocknen des Objektträgers. Hergestellt mit BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Ausgerichteter Herstellungsprozess des Kollagen-Hydrogels. Schritt 1: Kollagenextrusion unter Scherung in den 10x PBS erwärmten Puffer und Induktion der Fibrillogenese; Schritt 2: Montage von extrudiertem Kollagen auf geschnittene Objektträger; Schritt 3: Einbetten von zusätzlichem extrudiertem Kollagen, um die Größe des Hydrogels zu erhöhen; und Schritt 4: Trocknen von Kollagen-Hydrogelen. Hergestellt mit BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Herstellungsprozess des zufälligen Kollagen-Hydrogels. Schritt 1: Kollagenextrusion auf geschnittene Glasobjektträger (einzelner Streifen); Schritt 2: Die fortgesetzte Extrusion von Kollagen erhöht die Größe (mehrere Streifen); Schritt 3: Eintauchen von extrudiertem Kollagen in einen 10-fachen PBS-Puffer, um die Fibrillogenese zu initiieren; und Schritt 4: Trocknen der Hydrogele. Hergestellt mit BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Mögliche Fehlerschritte im Herstellungsprozess des Kollagen-Hydrogels. (A-F) Beispiele für (A) optimal dicke Kollagenstreifen, (B) übermäßig dicke Kollagenstreifen, (C) unzureichend dicke Kollagenstreifen, (D) verschnörkelte Kollagenstreifen und (E,F) überwucherte Kollagenoberflächen, dargestellt mittels Rasterelektronenmikroskopie. Maßstabsbalken = 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig05.jpg"> 
Abbildung 5: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von ausgerichteten und zufälligen Kollagen-Hydrogelen. Die Bilder wurden mit einem Elektronenmikroskop aufgenommen. Die Strahlbedingungen wurden auf 2 keV eingestellt, mit einem Strombereich von 25-100 pA und einem Arbeitsabstand von 4-5 mm. Die Bilder wurden durchweg mit einer Auflösung von 6144 x 4096 Pixeln und einer Verweilzeit von 1 μs gespeichert. Maßstabsbalken = 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig06.jpg"> 
Abbildung 6: Primäre Maus-Myoblasten, kultiviert auf ausgerichteten und zufälligen Kollagen-Hydrogelen. Die Myoblasten wurden vor der Bildgebung 3 Tage lang auf den Hydrogelen kultiviert. Hellfeldbilder wurden bei 10-facher Vergrößerung mit einem inversen Mikroskop aufgenommen. Der Pfeil zeigt die Ausrichtung der Nanofibrillen an. Maßstabsleiste = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Herstellung von nanofibrillär strukturiertem Kollagen für das Tissue Engineering

Regenerative biomaterials are designed to facilitate cell-material interactions to guide the repair of damaged tissues and organs. These materials are ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Die Erzeugung von funktionellen Mikrogeweben in mikrofluidischen Geräten erfordert die Stabilisierung von Zellphänotypen durch Anpassung traditioneller Zellkulturtechniken an die begrenzten räumlichen Dimensionen in Mikrogeräten. Die Modifikation von Kollagen ermöglicht die schichtweise Abscheidung ultradünner Kollagenanordnungen, die Primärzellen wie Hepatozyten als mikrofluidische Gewebemodelle stabilisieren können.

Schicht-für-Schicht der Kollagenabscheidung in Mikrofluidik-Vorrichtungen zum Microtissue Stabilization

Eine innovative Biofabrikationstechnik wurde entwickelt, um dreidimensionale Konstrukte zu entwickeln, die den architektonischen Merkmalen, Komponenten und mechanischen Eigenschaften von in vivo Gewebe ähneln. Bei dieser Technik wird ein neu entwickeltes Opfermaterial, BSA-Kautschuk, verwendet, das detaillierte räumliche Merkmale überträgt und die In-vivo-Architekturen einer Vielzahl von Geweben reproduziert.

Dreidimensionale Biomimetic Technologie: Neuartige Biorubber Erzeugt definierte Mikro- und Makro-Skala Architekturen in Collagen Hydrogele

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung von künstlichem Bindegewebe für eine Parallelkultur von 48 Geweben in einer Multi-Well-Platte mit Doppelpolen vorgestellt, die für mechanistische Studien, Krankheitsmodellierung und Screening-Anwendungen geeignet ist. Das Protokoll ist kompatibel mit Fibroblasten aus verschiedenen Organen und Spezies und wird hier mit menschlichen primären kardialen Fibroblasten veranschaulicht.

Fibroblasten-abgeleitetes Human Engineered Connective Tissue für Screening-Anwendungen

Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung eines mikrofluidischen Kanals mit sich ändernder Geometrie entlang der Strömungsrichtung des Fluids, um eine Dehndehnung (Dehnung) zu erzeugen, um Fasern in einem 3D-Kollagenhydrogel (&lt;250 μm Dicke) auszurichten. Die resultierende Ausrichtung erstreckt sich über mehrere Millimeter und wird durch die Dehndehnungsrate beeinflusst.

Mikrotechnische 3D-Kollagen-Hydrogele mit Faserausrichtung mit großer Reichweite

Gewebekultureinsätze mit Kunststoffmembranen sind der goldene Standard in Zellkulturlaboren als durchlässige Stützen zur Etablierung von Zellschichten und Modellen von Barrieregeweben. Hier stellen wir eine einfache Methode vor, um die Kunststoffmembran durch eine biologisch relevantere Membran zu ersetzen, die aus einem rekombinanten funktionalisierten Spinnenseidenprotein besteht.

Nanofibrilläre Basalmembran-Imitation aus rekombinant funktionalisierter Spinnenseide in maßgefertigten Gewebekultureinsätzen

Erfahren Sie eine scherungsbasierte Extrusionsmethode zur Herstellung von Kollagenhydrogelen mit nanofibrillärer Strukturierung für Tissue-Engineering-Anwendungen. Diese kostengünstige Technik ermöglicht präzise Kontrolle der Fibrillenorganisation.

Herstellung von nanofibrillär strukturiertem Kollagen für das Tissue Engineering

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