Herstellung von nanofibrillär strukturiertem Kollagen für das Tissue Engineering

Die übergeordnete wissenschaftliche Mission unserer Gruppe ist es, therapeutische Behandlungen für traumatische Muskel-Skelett-Verletzungen mit Hilfe von Bioengineering-Strategien zu entwickeln. Insbesondere entwickeln wir Materialien mit einstellbaren biophysikalischen Eigenschaften, um extrazelluläre Umgebungen zu modulieren und regenerative zelluläre Phänotypen zu fördern. Unser Ziel ist es, diese Materialien zu nutzen, um letztendlich die Heilung zu verbessern und die Lebensqualität zu verbessern.

Durch das Anwenden von Scherung auf Kollagen während der Fibrogenese kann die Organisation oder Anisotropie der einzelnen Kollagenfibrillen gesteuert werden, um Gerüste mit stark ausgerichteten oder zufällig gemusterten Fibrillen mit nanoskaligen Merkmalen zu erzeugen. Diese Merkmale können zelluläre Interaktionen und die Organisation des Zytoskeletts entlang der Richtung der Fibrillen steuern. Dieses Protokoll kann Biomaterialien mit nanoskaliger Fibrillärstrukturierung ohne teure Spezialgeräte oder Reagenzien herstellen.

Dies macht es zugänglicher als andere Faserherstellungstechniken und hochwirksam für inotrope Tissue-Engineering-Anwendungen. Unsere Ergebnisse ebnen die Voraussetzungen für die Adaption dieses Protokolls für andere extrazelluläre Matrixproteine. Wir untersuchen einen Biolink aus dezellularisierten Muskeln, um zu sehen, wie die Nachahmung sowohl der Gewebemuster als auch der Proteinzusammensetzung die Regeneration verbessern kann.

Diese Arbeit schafft auch die Voraussetzungen für die Verwendung unseres Biomaterials in einer Vielzahl verschiedener Gewebe. Wir nutzen diese Technologie derzeit, um künstliches Gewebe zu erzeugen, das die komplexe Heilung mehrerer Gewebetypen erleichtern kann. Parallel dazu untersuchen wir, wie wir unsere technischen Materialien mit mechanischen Stimuli synergetisch kombinieren können.

Wir hoffen, ein tieferes Verständnis dafür zu erlangen, wie nanoskalige Merkmale zelluläre Phänotypen steuern, und in Zukunft robustere technische Therapeutika zu entwickeln. Schneiden Sie zunächst den Dialyseschlauch auf etwa drei Zoll ab und rehydrieren Sie ihn in Reinstwasser. Klemmen Sie dann ein Ende des Schlauchs mit einem Dialyseschlauchclip mit einer 10-Milliliter-Spritze ab, die mit einer 18-Gauge-Nadel ausgestattet ist, und übertragen Sie fünf bis sechs Milliliter Rattenschwanzkollagen Typ 1 in den Schlauch.

Klemmen Sie danach das andere Ende des Schlauchs ab, um ihn zu schließen. Legen Sie als Nächstes eine 0,5 bis einen Zentimeter dicke Schicht Polyethylenglykol oder Stiftflocken auf den Boden einer Glasschale. Legen Sie dann den mit Kollagen gefüllten Dialyseschlauch auf die Stiftschicht.

Fügen Sie weitere Stiftflocken hinzu, um den Schlauch vollständig zu bedecken, und stellen Sie die Form in einen vier Grad Celsius Kühlschrank. Entfernen Sie alle 10 bis 15 Minuten die nassen Stiftflocken von der Oberfläche des Dialyseschlauchs. Decken Sie den Schlauch mit einer frischen Schicht Trockenstift auf und stellen Sie das Gericht wieder in den vier Grad Celsius heißen Kühlschrank.

Entfernen Sie nach 30 bis 35 Minuten die nassen Stiftflocken von der Oberfläche des Dialyseschlauchs. Spülen Sie die nassen Flocken mit Leitungswasser ab und tupfen Sie den Schlauch mit einem Taschentuch trocken. Lösen Sie dann ein Ende des Schlauchs und übertragen Sie das dialysierte Kollagen in Mikrozentrifugenröhrchen.

Schleudern Sie alle Luftblasen im Kollagen mit einer Mini-Zentrifuge bei 2.000 g für bis zu 30 Sekunden bei Raumtemperatur kurz herunter. Lagern Sie das Kollagen bei vier Grad Celsius für die spätere Verwendung. Ziehen Sie einen Tag vor der Anwendung etwa einen Milliliter dialysiertes Kollagen mit einer 16-Gauge-Nadel in eine Ein-Milliliter-Spritze.

Entfernen Sie dann die Nadel und wickeln Sie den Spritzenkopf mit Parafilm ein. Lagern Sie die Spritze aufrecht bei vier Grad Celsius über Nacht, damit kleine Luftblasen entfernt werden können. Nehmen Sie zunächst eine Spritze mit vorbereitetem dialysiertem Kollagen aus dem Kühlschrank und befestigen Sie eine stumpfe 22-Gauge-Nadel.

Legen Sie einen Objektträger in den Deckel einer Vier-Well-Platte und bedecken Sie den Objektträger mit ausreichend warmem PBS von 37 Grad Celsius, um ihn einzutauchen. Halten Sie die Spritze in einem Winkel von etwa 30 bis 45 Grad und extrudieren Sie manuell dünne Kollagenstreifen auf den Objektträger. Warten Sie ein bis zwei Minuten, bis das Kollagen die Fibrogenese abgeschlossen hat oder bis es undurchsichtig weiß wird.

Schneiden Sie dann mit einer Pinzette die Kollagenstreifen auf die gewünschte Länge ab. Legen Sie die Kollagenstreifen nacheinander vorsichtig in Längsrichtung parallel zur eingeritzten Region über einen vorbereiteten Glaschip. Stecken Sie die Ränder der Streifen unter den Chip.

Fahren Sie mit dem Platzieren von Kollagenstreifen fort, bis die gewünschten Abmessungen erreicht sind. Positionieren Sie nun das neu gebildete Kollagen-Hydrogel über zwei Vertiefungen einer Well-Platte. Lassen Sie die Hydrogele ein bis drei Stunden lang auf dem Labortisch trocknen oder bis PBS-Salzkristalle 50 % bis 90 % der Hydrogeloberfläche bedecken.

Tauchen Sie dann jedes Hydrogel etwa 30 bis 60 Sekunden lang in PBS ein oder bis sich die Salzkristalle aufgelöst haben. Tupfen Sie überschüssiges PBS vorsichtig mit einem Taschentuch von den Hydrogelen ab. Legen Sie zum Schluss die Hydrogele wieder auf die Vertiefungsplatte und lassen Sie sie über Nacht in einem Abzug trocknen.

Nehmen Sie zunächst eine Spritze mit Kollagen aus dem Kühlschrank und befestigen Sie eine stumpfe 22-Gauge-Nadel. Extrudieren Sie Kollagen mit einer Geschwindigkeit von etwa 3,2 Millilitern pro Minute auf einen trockenen Glaschip. Stellen Sie sicher, dass genügend Kollagen extrudiert wird, um Abmessungen wie die ausgerichteten Kollagen-Hyderogels zu erhalten.

Tauchen Sie nun das extrudierte Kollagen mit einer Pinzette in eine 50-Milliliter-Tube mit erwärmten 10XPBS. Warten Sie 45 bis 60 Sekunden, bis das Kollagen die Fibrogenese abgeschlossen hat oder bis es undurchsichtig weiß wird. Tupfen Sie dann überschüssiges PBS vorsichtig mit einem Taschentuch vom Kollagen ab.

Nachdem Sie die Hydrogele gespült und getrocknet haben, sterilisieren Sie sie und die umgebende Well-Platte 15 Minuten lang in 70%igem Ethanol. Heben Sie die Hydrogele nach der Hälfte der Sterilisation mit einer Pinzette kurz an, um sicherzustellen, dass sowohl die Unterseite des Glaschips als auch das Hydrogel mit Ethanol in Kontakt kommen. Entfernen Sie dann das Ethanol und lassen Sie die Hydrogele 10 Minuten an der Luft trocknen.

Waschen Sie die Hydrogele dreimal für jeweils 10 Minuten in sterilem PBS, um Ethanolreste zu entfernen und die Hydrogele zu rehydrieren. Hellfeldbilder von primären Skelettmuskelmyoblasten der Maus zeigten, dass die anisotrope nanotopographische Führung von Kollagenfibro die zelluläre Ausrichtung fördert.