Name: Visualisierung der DNA-Schadensantwort in Purkinje-Zellen mit Hilfe von zerebellären organotypischen Kulturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Erfahren Sie die DNA-Schadensantwort in Purkinje-Zellen mit zerebellären organotypischen Kulturen aus Mausmodellen. Diese Methode erklärt die zellulären Mechanismen der zerebellären Degeneration bei Ataxia-Telangiectasia.

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<meta charset="utf8"></head><body>Kleinhirn-Purkinje-Zellen: DNA-Schadensreaktion in organotypischen Kulturen

<table><tbody><tr><td>Reagenz und Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>150 x 30 cm Petrischale</td><td>Corning Inc.</td><td>3261</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm Petrischale</td><td>Corning Inc.</td><td>3294</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270725-1L</td><td></td></tr><tr><td>Selbstklebende Objektträger</td><td>Marienfeld</td><td>48187</td><td>76 x 26 x 1 mm</td></tr><tr><td>Klingen für Chopper</td><td>TED PELLA</td><td>Modell TC752-1</td><td>&nbsp; Style Rasierklingen</td></tr><tr><td>BME</td><td>GIBCO</td><td>41010-026 500ml.&nbsp;</td><td>Keine L-Schwemme</td></tr><tr><td>Zellkultur-Inserts</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Biological Indo.</td><td>02-015-1A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS ohne Phenolrot</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-1138-500L</td><td>Kein Ca+,Kein Mg+</td></tr><tr><td>HBSS mit Phenolrot</td><td>Sartorius</td><td>02-015-1A</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>GIBCO</td><td>26050088</td><td>hitzeinaktivierte</td></tr><tr><td>Iriszange</td><td>CellPath</td><td>GZX-0100-00A</td><td>130mm stumpf gezackter Irisspatel</td></tr><tr><td></td><td>F.S.T</td><td>10092-12</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>41010026</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322412-1L</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eindeckmedium ohne</td><td>GRIGENE. Ltd, Israel</td><td>K239320A</td><td></td></tr><tr><td>Paraquat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>856177-250MG</td><td>Paraquat-Dichlorid (Methylviologen)</td></tr><tr><td>PARG-Poly(ADP-Ribose)-Glykohydrolase-Inhibitor</td><td>Tocris Bioscience, Vereinigtes Königreich</td><td>PDD 00017273</td><td>lichtempfindlich&nbsp;</td></tr><tr><td>Phosphatpuffer</td><td>Biologisch Indo.</td><td>02-018-1A</td><td></td></tr><tr><td>Schere, Haut-Gewebe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sechs-Well-Platten</td><td>Corning integriert</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>Ersatz-Hackscheiben&nbsp;</td><td>TED PELLA</td><td>Modell 10180-01</td><td></td></tr><tr><td>Gewebehacker</td><td>McIlwain</td><td>Modell TC752</td><td>10180-220</td></tr><tr><td>Pinzette, spitze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Harnbecher<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>stark>Antikörper</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr>Alexa <tr><td>Fluor 488 Esel Anti Kaninchen IgG</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>A21206</td><td>1:500; sekundär ab; Sekundärer Verdünnungspuffer; &nbsp; Inkubation für 2 h bei Raumtemperatur</td></tr><tr><td>Antigliafibrilläres saures Protien</td><td>Milliphore</td><td>MAB3402</td><td>1:1500; primär ab; blockierend; Host:Maus</td></tr><tr><td>Anti-calbindin-D-28K</td><td>Swant&nbsp;</td><td>CB300</td><td>1:2000; primärer ab; blockierend; Wirt: Kaninchen&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Calbindin-D-28K</td><td>Swant</td><td>CB-38a</td><td>1:2000; primär ab; blockierend&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Pan-ADP-Ribose-Reagenz</td><td>Milliphore</td><td>MABE1016</td><td>1:800; primär ab; Blockierung; Inkubation für 2 h bei Raumtemperatur</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidin-2'-phenylindoldihydrochlorid)</td><td>Zellsignalisierung</td><td>4084</td><td>1:1000; sekundärer Verdünnungspuffer; Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur</td></tr></tbody></table>

visualisierung der dna-schadensantwort in purkinje-zellen mit hilfe von zerebellären organotypischen kulturen

Visualizing the DNA Damage Response in Purkinje Cells Using Cerebellar Organotypic Cultures

Abbildung 1 veranschaulicht das allgemeine Erscheinungsbild der kleinhirnorganischen Kulturen. Die obere Reihe in Abbildung 1A zeigt die Kleinhirnfoliation, die in Kultur erhalten bleibt, während die untere Reihe die für Calbindin D-28k gefärbten PCs (grün) und die für NeuN gefärbten neuronalen Kerne (rot) zeigt. In Abbildung 1B sind die Astrozyten in den PCs (rot) mit GFAP (grün) gefärbt, einem intermediären Filament-Typ-III-Protein. Abbildung 2 und Abbildung 3 zeigen die PAR-Färbung, die nach der Behandlung dieser Kulturen mit zwei DNA-schädigenden Wirkstoffen beobachtet wurde, die beide starke Oxidationsmittel sind: Kaliumbromat (eine Endkonzentration von 10 mM für 12 h) und Paraquat. Die PAR-Antwort war bei den behandelten PCs im Kleinhirnfolium im Vergleich zur Kontrolle ausgeprägt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67167/67167fig01.jpg"> Abbildung 1: Überblick über die zerebellären organotypischen Kulturen der Maus. (A) Die obere Reihe zeigt die Kleinhirnfoliation, die in Kultur erhalten bleibt. Die untere Reihe konzentriert sich auf die PC-Ebene. PCs sind durch Calbindin D-28k (grün) gekennzeichnet. Die NeuN-Färbung (rot) identifiziert neuronale Kerne über die Schichten hinweg. (B) Ein genauerer Blick auf PCs (rot). GFAP (grün), ein intermediäres Filament-Typ-III-Protein, das Astrozyten hervorhebt. Maßstabsbalken = 968,8 μm (A, obere Reihe), 42,1 μm (A, zweite Reihe), 72,7 μm (B, obere Reihe), 18,2 μm (B, zweite Reihe). Abkürzungen: PC = Purkinje-Zellen; GFAP = saures Protein der Gliafaser; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67167/67167fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67167/67167fig02.jpg"> Abbildung 2: PAR-Färbung in einer Kleinhirnscheibe, die mit Kaliumbromat behandelt wurde. Die Kleinhirnscheibe wurde mit Kaliumbromat (KBrO3), einem starken Oxidationsmittel, in einer Endkonzentration von 10 mM für 12 h behandelt. Maßstabsleisten = 775 μm. Abkürzungen: PAR = poly(ADP-ribose); DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67167/67167fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67167/67167fig03.jpg"> Abbildung 3: PAR-Reaktion in Kleinhirnschnitten, die Paraquat ausgesetzt waren, einem starken Produzenten von Superoxid-Anionen. (A) Eine allgemeine Ansicht eines Kleinhirnblattes. Beachten Sie die robuste PAR-Reaktion, insbesondere bei PCs, im Vergleich zur Steuerung. (B) Eine genauere Untersuchung zeigt die PAR-Reaktion bei PCs und anderen Zelltypen. Maßstabsleisten = 193,8 μm (A), 18,2 μm (B). Abkürzungen: PAR = poly(ADP-ribose); DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67167/67167fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:border="1.5pt solid">Lösungen und Puffer</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid"></td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Lösung  </td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Zutaten</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Medium zum Sezieren</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Hank's ausgewogene Salzlösung (HBSS) mit 0,5 % D-Glukose. Fügen Sie 0,5 ml 50%ige D-Glukoselösung zu 50 ml HBSS ohne Mg2+ und Ca2+ hinzu.</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">BME-Nährmedium</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Mischen Sie 100 ml Basal Medium Eagle (BME), das Phenolrot, aber kein L-Glutamin oder HEPES enthält, mit 50 ml HBSS mit Phenolrot, 50 ml hitzeinaktiviertem Pferdeserum, 2 ml 50% D-Glucose und 1 ml 200 mM L-Glutamin. Mischen und filtrieren Sie durch einen 0,22-μm-Filter in einer sterilen Umgebung. Bei 4 °C lagern</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Blockierungslösung für die Immunfärbung</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">in 0,1 M Phosphatpuffer: 0,5% Triton X-100, 10% Ziegenserum hinzufügen</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Puffer zur Verdünnung von Sekundärantikörpern</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">0,1 M Phosphatpuffer, 0,2 %Triton X-100</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Puffer waschen</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">0,1 M Phosphatpuffer, 0,2 %Triton X-100</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Fixative Lösung</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Actenoe:Methanol (1:1 v:v)</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Lösung für die Permeabilisierung</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">0,1 M Phosphatpuffer, 1%Triton X-100</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">DAPI-Lösung</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Stammlösung (2 mg/ml) verdünnt auf 1 μg/mL in 1x PBS</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Phosphat-Puffer</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Bereiten Sie zwei Lösungen A und B vor (siehe unten). Mischen Sie die Lösungen gemäß den unten angegebenen Verhältnissen, um 0,2 M Phosphatpuffer herzustellen. Verdünnen Sie dann die 0,2-M-Lösung mit DDW (1:1), um 0,1 M-Phosphatpuffer (Arbeitslösung) herzustellen.</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Lösung A (für 0,2 M)</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">12 g Natriumphosphat, einbasisch, wasserfrei (Na2HPO4 FW 141.96) 500 mL DDW</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Lösung B (für 0,2 m)</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">14,2 g Natriumphosphat diabasisch wasserfrei (Na2HPO4 FW 141,96) 500 mL DDW</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Gemischte Lösungen zur Herstellung von 0,2 M</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Bereiten Sie 1 l vor: 230 mL Lösung A und 770 mL Lösung B</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">0,1 M Phosphatpuffer</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Verdünnen Sie die gemischte Lösung mit DDW (1:1)</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Lösungen und ihre Zusammensetzung.

Visualisierung der DNA-Schadensantwort in Purkinje-Zellen mit Hilfe von zerebellären organotypischen Kulturen

Cerebellar Purkinje cells (PCs) exhibit a unique interplay of high metabolic rates, specific chromatin architecture, and extensive transcriptional ...

visualizing-dna-damage-response-purkinje-cells-using-cerebellar

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Diese Methode beschreibt die Erzeugung von organotypischen Kleinhirn Kulturen und die Wirkung bestimmter apoptotischen Stimuli auf die Lebensfähigkeit der verschiedenen Zelltypen des Kleinhirns.

Organotypische Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Wir präsentieren ein Protokoll, das zu sehen und zur quantitativen Beurteilung der Morphologie der dendritischen Baumes der einzelnen Purkinje-Zellen im Kleinhirn organotypischen Slice-Kulturen angebaut erlaubt. Dieses Protokoll soll Studien zu den Mechanismen der Purkinje-Zellen dendritische Entwicklung zu fördern.

Die Analyse von Purkinje Zelle Dendritische Morphologie in organotypischen Kulturen

Dieses Video zeigt eine Technik zur Gewinnung von zerebellären organotypischen Schnitten aus dem Gehirn eines Mäusewelpen und zur Kultivierung der Schnitte in Medien, die mit Nährstoffen und Wachstumsfaktoren ergänzt sind, um die Kleinhirnentwicklung in vitro  nachzuahmen.Zusätzlich werden bestimmte Kleinhirnschnitte mit einer Testverbindung behandelt und die neuroprotektive Fähigkeit der Verbindung mit einer Immunfluoreszenz-Färbetechnik analysiert.

Analyse des Überlebens von Purkinje-Zellen in organotypischen Kleinhirnschnittkulturen

Die Kleinhirn externen Körnerschicht ist der Ort der größten Transit Verstärkung im sich entwickelnden Gehirn. Hier stellen wir ein Protokoll zur genetischen Veränderung, die diese Schicht an der Spitze der Proliferation unter Verwendung ex vivo Elektroporation und Kultur zerebelläre Scheiben aus embryonalen Tag 14 Hühnerembryonen zu zielen.

Ex-vivo-Kultur von Chick Kleinhirn-Slices und räumlich gezielte Elektroporation von Körnerzellvorstufen

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Isolierung und Kultivierung primäre Maustaste zerebralen Granulat Neuronen (CGNs) von 6-7 Tage alten Welpen, effizienten Transduktion von CGNs für Verlust und Gewinn von Funktionsstudien, und Modellierung NMDA-induzierten neuronalen Excitotoxizität, niedrig-Kalium-induzierte Zelltod, DNA-Schäden und oxidativen Stress mit der gleichen Kultur-Modell.

Modellierung von neuronalen Tod und Degeneration in Maus primären zerebelläre Granulat Neuronen

Hier präsentieren wir eine Methode um organotypischen Slice Kulturen aus Maus Kleinhirn und Myelinscheide Färbung von Immunohistochemistry geeignet für die Untersuchung von Mechanismen der Myelinisierung und Remyelinisierung in das zentrale Nervensystem vorzubereiten.

Vorbereitung und Immunostaining Myelinating organotypischen zerebelläre Slice Kulturen

Organotypische Scheibenkulturen sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um neuroentwicklungsfördernde oder degenerative/regenerative Prozesse zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das den neuroentwicklungsbedingten Tod von Purkinje-Zellen in Maus-Kleinhirn-Scheibenkulturen modelliert. Diese Methode kann die Forschung in neuroprotektive Arzneimittel Entdeckung profitieren.

Purkinje Zell Überleben in organotypischen Zerebellar Slice Kulturen

Technik für die Visualisierung des schlagenden Herzens in Larven und erwachsene...

Visualisierung des schlagenden Herzens in Drosophila</em

Dieses Protokoll zeigt eine einfache Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie-Technik zur Visualisierung der DNA-Replikation von einzelnen replisomes in Echtzeit.

Visualizing Einzel-Molekül-DNA-Replikation mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Ein detailliertes Protokoll ist für die Darstellung der Echtzeit Bildung von DNA-Reparatur-Komplexe...

Imaging Mismatch Reparatur und zellulären Reaktionen auf DNA-Schäden in Bacillus subtilis</em

Erfahren Sie die DNA-Schadensantwort in Purkinje-Zellen mit zerebellären organotypischen Kulturen aus Mausmodellen. Diese Methode erklärt die zellulären Mechanismen der zerebellären Degeneration bei Ataxia-Telangiectasia.

Visualisierung der DNA-Schadensantwort in Purkinje-Zellen mit Hilfe von zerebellären organotypischen Kulturen

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