Name: Metabolomische Analyse von Gerste mittels Gaschromatographie/Massenspektrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Erfahren Sie die metabolomische Analyse von Gerste mittels GC/MS zur Untersuchung von Trockenstress in der Landwirtschaft. Diese Methode verbessert die Effizienz der Metabolitenidentifizierung und liefert Einblicke in pflanzliche Stressantworten.

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Die Finanzierung wurde von der USDA ARS Pulse Crop Health Initiative und der Idaho Barley Commission bereitgestellt.

1. Herstellung der Standards (Abbildung 2)
<img alt="chemische Strukturformel von Heptacosan, 5α-Cholestan-3β-ol, Phenyl-β-D-glucopyranosid, 4-Chloro-L-phenylalanin" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67175/67175fig02.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Abbildung 2"> 
Abbildung 2: Chemische Strukturen der vier internen Standards, die in dieser Methode verwendet werden. Diese vier Standards dienen der semiquantitativen Bestimmung von Metaboliten in den verschiedenen Gerstenfraktionen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67175/67175fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<ol>
	<li>Standard 1 herstellen, indem n-Heptacosan (50 mg, ≥97 % Reinheit) in n-Hexan (100 mL, ≥95 % Reinheit) gelöst wird.</li>
	<li>Standard 2 herstellen, indem 5α-Cholestan-3β-ol (60 mg, ≥95 % Reinheit) in Dichlormethan (CH2Cl2, 100 mL, ≥99 % Reinheit) gelöst wird.</li>
	<li>Standard 3 herstellen, indem Phenyl-β-D-glucopyranosid (80 mg, ≥95 % Reinheit) in entionisiertem Wasser (DI H2O, 100 mL) gelöst wird.</li>
	<li>Standard 4 herstellen, indem 4-Chloro-L-phenylalanin (40 mg, ≥97 % Reinheit) in DI H2O (100 mL) gelöst wird.</li>
</ol>
2. Erste Fraktionierung
<ol>
	<li>Barleymehl (200 mg) in ein Festphasen-Extraktions-Säulengefäß (SPE) geben. Das Mehl mit Methanol (200 µL, ACS-Reinheit oder höherer Reinheit) 20 min lang einweichen, um es zu mazerieren. Das Methanol durch Vakuumverdampfung 30 min lang entfernen (Abbildung 3).</li>
	<li>Nach dem Trocknen die Säule an ein Vakuummanifold anschließen. Nichtpolare Bestandteile (Fraction A) mit CH2Cl2 (4 mL) in ein 10-mL-Gefäß extrahieren und das Vakuummanifold so lange betreiben, bis das Mehl vollständig trocken ist.</li>
	<li>Polare Bestandteile (Fraction B) extrahieren, indem eine Mischung aus Methanol und destilliertem H2O (10 mL, 8:2 v/v) hinzugefügt wird. In ein 10-mL-Gefäß sammeln und das Vakuummanifold so lange betreiben, bis das Mehl vollständig trocken ist.</li>
</ol>
<img alt="Aufbau des Vakuum-Probenvorbereitungsmanifolds für die Festphasenextraktion, Probenaufreinigung und chromatographische Analyse im Labor." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67175/67175fig03.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Abbildung 3"> 
Abbildung 3: Der Vakuum-Probenvorbereitungsmanifold-Aufbau. Dieser Aufbau dient zum Trocknen des methanolgetränkten Gerstenmehls. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67175/67175fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
3. Verarbeitung der Fraktion A zur Herstellung der Fraktionen 1 und 2
<ol>
	<li>Fügen Sie Standard 1 und Standard 2 (jeweils 100 µL) zu Fraction A hinzu und mischen Sie durch mehrfaches Pipettieren. Verdampfen Sie das Lösungsmittel vollständig unter vermindertem Druck mit einem Rotationsverdampfer.</li>
	<li>Lösen Sie die Probe erneut in Methyl-tert-butylether (MTBE, 500 µL, ACS-Reinheit oder höherer Reinheit). Geben Sie Methanol (300 µL) und Natriummethoxid (14,6 mg, 97 %) hinzu. Lassen Sie die Umesterung 90 Minuten bei Raumtemperatur unter magnetischem Rühren ablaufen.</li>
	<li>Fügen Sie wässrige Salzsäure (2 mL, 0,35 M, ACS-Reinheit oder höherer Reinheit) hinzu. Mischen Sie die angesäuerte Lösung mit CH2Cl2 (1 mL). Sammeln Sie den Inhalt des Reaktionsgefäßes mit einer langen Pasteurpipette und lassen Sie die Phasen in der Pipette separieren.</li>
	<li>Überführen Sie die untere (organische) Phase in ein neues Reaktionsgefäß. Waschen Sie die organische Phase, indem Sie wässrige Salzsäure (2 mL, 0,35 M) hinzufügen. Sammeln Sie den Inhalt des Reaktionsgefäßes mit einer langen Pasteurpipette und lassen Sie die Phasen in der Pipette separieren.</li>
	<li>Überführen Sie die untere (organische) Phase in ein neues Reaktionsgefäß. Verdampfen Sie die untere (organische) Phase im Rotationsverdampfer bis zur Trockne.</li>
	<li>Fügen Sie wasserfreies Natriumsulfat (200 mg, ACS-Reinheit oder höherer Reinheit) einer SPE-Säule hinzu. Lösen Sie die Probe aus Schritt 3,5 in CH2Cl2 (250 µL) auf und geben Sie sie auf die SPE-Säule.</li>
	<li>Eluieren Sie Fraction 1 aus der SPE-Säule mit drei Portionen von n-Hexan und MTBE (2,04 mL, 50:1 v/v) in ein 10-mL-Gefäß. Verdampfen Sie die Lösung, die Fraction 1 (FAMEs und Kohlenwasserstoffe) enthält, im Rotationsverdampfer bis zur Trockne. Lösen Sie die Probe erneut in n-Hexan (300 µL) auf und überführen Sie sie in ein Autosampler-Gefäß für die GC/MS-Analyse.</li>
	<li>Eluieren Sie pre-fraction 2 aus der SPE-Säule (nach der Elution von Fraction 1 in Schritt 3,7) mit drei aufeinanderfolgenden Portionen von n-Hexan und MTBE (2 mL, 7:3 v/v) in ein 10-mL-Gefäß. Verdampfen Sie pre-fraction 2 im Rotationsverdampfer bis zur Trockne.</li>
	<li>Lösen Sie pre-Fraction 2 im selben Gefäß in wasserfreiem Pyridin (250 µL, 99,8 %) erneut auf (Übertragung des Pyridins mittels Argonballon-Methode – siehe unten) und fügen Sie N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamid (MSTFA, 50 µL, Reagent grade) hinzu. 
	ANMERKUNG: Alle wasserfreien Lösungsmittel werden mittels der Argonballon-Methode übertragen.
	<ol>
		<li>Befestigen Sie mit Kabelbindern einen Nitrilhandschuh an der Spitze einer Spritze, aus der der Kolben entfernt wurde. Füllen Sie den Ballon mit wasserfreiem Argon und setzen Sie eine Einwegnadel auf die Spritze auf.</li>
		<li>Stechen Sie die Ballon-Spritze durch die Septum des Reagenzfläschchens, das das wasserfreie Reagenz enthält, und führen Sie eine zweite Spritze mit einer langen Nadel ein, um das Lösungsmittel abzuziehen (Abbildung 4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Spülen Sie das Probengefäß mit einem sanften Strom wasserfreien Argons, verschließen Sie es, sichern Sie es mit Parafilm und stellen Sie es 15 Minuten lang in ein 70 °C heißes Ölbad unter magnetischem Rühren.</li>
	<li>Kühlen Sie Fraction 2 (TMS-derivatisiert: Fettsäuren, Fettsäurealkohole, Hydroxy-FAMEs, Hydroxyfettsäuren, Phenole und Sterole) nach der Silylierung 5 Minuten lang auf Raumtemperatur ab. Füllen Sie Fraction 2 in ein Autosampler-Gefäß.</li>
</ol>
<img alt="Laboraufbau mit Gasflasche und Handschuhen zur Sicherheit, zur Demonstration eines Gasflussexperiments oder einer Apparatur." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67175/67175fig04.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Abbildung 4"> 
Abbildung 4: Der Argon-Ballon-Aufbau. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67175/67175fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
4. Aufarbeitung der Fraktion B zur Herstellung der Fraktionen 3 und 4
<ol>
	<li>Fügen Sie die Standards 3 und 4 (jeweils 300 µL) zu Fraction B hinzu und mischen Sie durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren. Überführen Sie 2 mL dieser Lösung in ein neues Gefäß, das zu Fraction 3 verarbeitet wird, und anschließend 4 mL dieser Lösung in ein separates Gefäß, das zu Fraction 4 verarbeitet wird, beginnend mit der Verdampfung von pre-fraction 4 in Schritt 4.4. Verdampfen Sie pre-fraction 3 im Vakuumrotationsverdampfer bis zur Trockne, gefolgt von einer Koverdampfung mit wasserfreiem Pyridin (2 × 1,5 mL). 
	ANMERKUNG: Die Koverdampfung dient der Entfernung von Spuren von Wasser, da wasserfreies Pyridin einen azeotropen Gemisch bildet.</li>
	<li>Lösen Sie pre-fraction 3 in wasserfreiem Pyridin (200 µL) erneut auf und geben Sie N-Trimethylsilylimidazol (TMSIM, 100 µL, 97 %) hinzu. Spülen Sie das Probengefäß mit einem sanften Strom wasserfreien Argons, verschließen Sie es, sichern Sie es mit Parafilm und erhitzen Sie es 20 min bei 70 °C in einem Ölbad unter magnetischer Rührung. 
	ANMERKUNG: TMSIM ist ein mildes Silylierungsmittel und silyliert vorzugsweise -OH-Gruppen gegenüber Aminogruppen8.</li>
	<li>Lassen Sie die Lösung nach der Silylierung 5 min bei Raumtemperatur abkühlen, fügen Sie n-Hexan (200 µL) und DI-H2O (400 µL) hinzu und rühren Sie um. Überführen Sie die obere, organische Phase, d. h. Fraction 3 (TMS-derivatisierte Zucker und Polyole), mit einer langen Pasteurpipette in ein Autosampler-Gefäß.</li>
	<li>Verdampfen Sie pre-fraction 4 aus Schritt 4.1 im Vakuumrotationsverdampfer bis zur Trockne, gefolgt von einer Koverdampfung mit wasserfreiem Pyridin (2 × 1,5 mL). Lösen Sie die Probe in wasserfreiem Pyridin (250 µL) erneut auf und fügen Sie Methoxyaminhydrochlorid (5 mg, 98 %) hinzu. Spülen Sie das Probengefäß mit Argon, verschließen Sie es, sichern Sie es mit Parafilm und führen Sie die Oximation 30 min bei 70 °C in einem Ölbad unter magnetischer Rührung durch.</li>
	<li>Lassen Sie die Lösung 5 min bei Raumtemperatur abkühlen, geben Sie MSTFA (100 µL) hinzu, spülen Sie das Probengefäß vorsichtig mit wasserfreiem Argon, verschließen Sie es, sichern Sie es mit Parafilm und führen Sie die Silylierung 20 min bei 70 °C in einem Ölbad unter magnetischer Rührung durch.</li>
	<li>Lassen Sie die Lösung 5 min bei Raumtemperatur abkühlen, fügen Sie anschließend n-Hexan und DI-H2O (800 µL, 5:3 v/v) hinzu. Sammeln Sie die untere (wäßrige) Phase mit einer langen Pasteurpipette und waschen Sie sie viermal mit jeweils 500 µL n-Hexan, wobei Sie jedes Mal die untere Phase auffangen und die obere Phase verwerfen. Verdampfen Sie die wäßrige Phase im Vakuumrotationsverdampfer bis zur Trockne und führen Sie eine Koverdampfung des Rückstandes mit wasserfreiem Acetonitril (2 × 1,5 mL, ACS-Reinheit oder höher) durch.</li>
	<li>Lösen Sie die Probe in wasserfreiem Acetonitril (250 µL) erneut auf und geben Sie MSTFA (50 µL) hinzu. Spülen Sie das Probengefäß vorsichtig mit wasserfreiem Argon, verschließen Sie es, sichern Sie es mit Parafilm und erhitzen Sie es 60 min bei 70 °C in einem Ölbad unter magnetischer Rührung.</li>
	<li>Lassen Sie die Lösung 5 min bei Raumtemperatur abkühlen und überführen Sie anschließend Fraction 4 (TMS-derivatisierte Carbonsäuren, Aminosäuren, Amine) in ein Autosampler-Gefäß.</li>
</ol>
5. GC/MS-Methoden
<ol>
	<li>Laden Sie die Proben auf ein GC/MS-Gerät mit folgenden Säuleneigenschaften: 15 m x 0,25 mm Innendurchmesser, beschichtet mit einem 0,25 µm dicken unpolaren Film.</li>
	<li>Verwenden Sie für Fraktionen 1–4 nacheinander folgende Injektionsvolumina: 1,0, 1,0, 0,5 und 0,5 µL. Führen Sie die injizierten Proben mit einem Split-Fluss (Split-Verhältnis 1:10) von 14 mL/min Helium bei einer Injektionstemperatur von 250 °C durch.</li>
	<li>Für Fraktion 1 und 2 erhöhen Sie die Säulentemperatur von 100 °C auf 300 °C mit einer Rate von 4 °C/min und halten Sie diese 10 min lang konstant. 
	HINWEIS: Die gesamte Laufzeit beträgt 65 min.</li>
	<li>Für Fraktion 3 erhitzen und halten Sie die Säule während des gesamten Laufs bei 300 °C. 
	HINWEIS: Die gesamte Laufzeit beträgt 70 min.</li>
	<li>Für Fraktion 4 erhitzen Sie die Säule von 70 °C auf 142 °C mit einer Rate von 2,5 °C/min und halten Sie diese 10 min lang konstant, gefolgt von einer Erhöhung von 142 °C auf 235 °C mit 4 °C/min und einer weiteren Haltezeit von 10 min. Schließlich tempern Sie die Säule bei 320 °C für 8 min. 
	HINWEIS: Die gesamte Laufzeit beträgt 102 min.</li>
</ol>
6. Identifizierung der Metaboliten
<ol>
	<li>Führen Sie die Metabolitenidentifizierung durch, indem Sie das Massenspektrum jeder Verbindung mit den NIST-Massenspektrenbibliotheken unter Verwendung von Chromatographie-Software mit Suchindexabgleich vergleichen. Wählen Sie einen Kandidatenpeak mithilfe des Computer-Cursors aus; anschließend werden die Spektren angezeigt. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Spektren, um die Bibliothekssuche zu starten. 
	HINWEIS: Dieser Schritt kann je nach Instrumentensoftware automatisiert werden.</li>
	<li>Bestimmen Sie eine Halbquantifizierung jeder Probe, indem Sie die Peakflächen auf den Standard normalisieren, indem Sie die Peakfläche des Probenpeaks durch die Peakfläche des Standards für jede Fraktion dividieren. 
	HINWEIS: Dadurch ist ein Vergleich der Metabolitkonzentrationen über Fraktionen und Proben hinweg möglich, auch wenn die Probenvorbereitung variiert.</li>
</ol>

Derivatization and Separation of Barley Flour Metabolites into Four Fractions

<ol><li>Verstegen, H., Köneke, O., Korzun, V., von Broock, R. The world importance of barley and challenges to further improvements. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVerstegen%2C+H+%22Biotechnological+approaches+to+barley+improvement.+Biotechnology+in+Agriculture+and+Forestry%22">Biotechnological approaches to barley improvement. Biotechnology in Agriculture and Forestry</a>. Kumlehn, J., Stein, N. 69, Springer. Berlin, Heidelberg. 3-19 (2014).</li>
<li>Agribusiness handbook: Barley malt beer. , Agriculture Organization of the United Nations. Rome. 
 <a target="_blank" href="https://www.fao.org/4/i1003e/i1003e00.htm">https://www.fao.org/4/i1003e/i1003e00.htm</a> (2009).</li>
<li>Jena, J., et al. Role of legumes in cropping system for soil ecosystem improvement. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJena%2C+J+%22Ecosystem+services%3A+types%2C+management+and+benefits%22">Ecosystem services: types, management and benefits</a>. , Nova Science Publishers, Inc. New York. 1-21 (2022).</li>
<li>Ahmed, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+changes+in+grain+ultrastructure%2C+amylase%2C+protein+and+amino+acid+profiles+between+Tibetan+wild+and+cultivated+barleys+under+drought+and+salinity+alone+and+combined+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential changes in grain ultrastructure, amylase, protein and amino acid profiles between Tibetan wild and cultivated barleys under drought and salinity alone and combined stress.</a> Food Chem. 141 (3), 2743-2750 (2013).</li>
<li>Marchev, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+and+health%3A+from+nutritional+crops+and+plant-based+pharmaceuticals+to+profiling+of+human+biofluids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Metabolomics and health: from nutritional crops and plant-based pharmaceuticals to profiling of human biofluids.</a> Cell Mol Life Sci. 78 (19-20), 6487-6503 (2021).</li>
<li>Kusch, P. Gas chromatography: Derivatization, sample preparation, application. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKusch%2C+P+%22IntechOpen%22">IntechOpen</a>. , (2019).</li>
<li>Haas, M., Lamour, S., Trapp, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+advanced+derivatization+protocol+for+the+unambiguous+identification+of+monosaccharides+in+complex+mixtures+by+gas+and+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Development of an advanced derivatization protocol for the unambiguous identification of monosaccharides in complex mixtures by gas and liquid chromatography.</a> J Chromatogr A. 1568, 160-167 (2018).</li>
<li>Moldoveanu, S. C., David, V. Derivatization methods in GC and GC/MS. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoldoveanu%2C+SC+%22Gas+chromatography-derivatization%2C+sample+preparation%2C+application%22">Gas chromatography-derivatization, sample preparation, application</a>. , IntechOpen. (2018).</li>
<li>Kim, B. R., Sung, G. H., Kim, J. -J., Yoon, Y. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+development+of+rapid%2C+practical+and+selective+process+for+preparation+of+z-oximes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Korean+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A development of rapid, practical and selective process for preparation of z-oximes.</a> Journal of the Korean Chemical Society. 57 (2), 295-299 (2013).</li>
<li>Miyagawa, H., Bamba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+sequential+derivatization+with+concurrent+methods+for+GC%2FMS-based+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Comparison of sequential derivatization with concurrent methods for GC/MS-based metabolomics.</a> J Biosci Bioeng. 127 (2), 160-168 (2019).</li>
<li>Yi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MeOx-TMS+derivatization+for+GC-MS+metabolic+profiling+of+urine+and+application+in+the+discrimination+between+normal+C57BL%2F6J+and+type+2+diabetic+KK-Ay+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">MeOx-TMS derivatization for GC-MS metabolic profiling of urine and application in the discrimination between normal C57BL/6J and type 2 diabetic KK-Ay mice.</a> Analytical Methods. 6 (12), 4380-4387 (2014).</li>
<li>Röhlig, R. M., Eder, J., Engel, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+profiling+of+maize+grain%3A+differentiation+due+to+genetics+and+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Metabolite profiling of maize grain: differentiation due to genetics and environment.</a> Metabolomics. 5, 459-477 (2009).</li>
<li>Cook, B. I., Mankin, J. S., Anchukaitis, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Climate+change+and+drought%3A+From+past+to+future%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Climate+Change+Reports%22%5BJournal%5D)">Climate change and drought: From past to future.</a> Current Climate Change Reports. 4, 164-179 (2018).</li>
<li>Samarah, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+drought+stress+on+growth+and+yield+of+barley%5BTitle%5D)+AND+%22Agronomy+for+Sustainable+Development%22%5BJournal%5D)">Effects of drought stress on growth and yield of barley.</a> Agronomy for Sustainable Development. 25 (1), 145-149 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Wir stellen eine erfolgreiche Methode zur Extraktion von Metaboliten aus Gerstenkorn für die Stoffwechselanalyse vor. Mehrere Schritte in diesem Extraktionsprotokoll erfordern besondere Aufmerksamkeit, um zufriedenstellende Ergebnisse zu erzielen. Darüber hinaus ist auch in der Analysephase Vorsicht geboten, insbesondere angesichts der Anzahl und der unterschiedlichen Eigenschaften der derivatisierten Produkte.
Damit die Metabolitenderivatisierungen wirksam sind, ist es notwendig, Feuchtigkeit...

Gerste ist weltweit das viertmeistproduzierte Getreide1. Da der Klimawandel die Häufigkeit und Intensität von Dürren erhöht, wird erwartet, dass die Produktivität dieser Kulturpflanze deutlich sinken wird, da starker Dürrestress den Getreideertrag um fast eine Größenordnung verringern kann2. Agrarische Praktiken, die die Landschaft vielfältiger gestalten, sollen die Resilienz steigern – also die Neigung, Erträge und Bodeneigenschaften des Ackerlands aufrechtzuerhalten. Mischkultur, der gleichzeitige Anbau zweier Kulturen auf demselben Feld, ist eine solche Praxis, insbesondere wenn stickstofffixierende Hackfrüchte wie Linsen oder Erbsen einbezogen werden3.
Pflanzenmetaboliten sind kleine Moleküle, die in Pflanzengeweben und -zellen vorkommen, wie Zucker, Aminosäuren und Lipide, und die genutzt werden können, um die Reaktionen der Pflanzen auf physikalische und umweltbedingte Stressfaktoren zu verstehen. Frühere Studien haben gezeigt, dass bestimmte Metaboliten in Gerste, wie Prolin und bestimmte Zucker, unter Trockenstressbedingungen in höherer Konzentration vorhanden sind, doch eine vollständige metabolomische Untersuchung für sowohl Trockenstress als auch für Intercropping-Bedingungen steht noch aus4. Unklar bleibt, wie sich das Metabolom des Getreides aufgrund der biotischen Belastung durch Intercropping und der umweltbedingten Belastung durch Trockenheit verändert. Das Metabolom – das gesamte metabolische Profil des Getreides – ist sowohl für die Endanwendungen der Gerste als auch für die Identifizierung der biochemischen Reaktionen, die es den Pflanzen ermöglichen, sich an Umweltveränderungen anzupassen, von Bedeutung5.
Diese Studie beschreibt die Methodenentwicklung und vorläufigen Ergebnisse der metabolomischen Analyse von unter Trockenstress und interkulturellen Bedingungen angebautem Gerste mittels Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC/MS). Zur Analyse wurden die Gerstemetabolite gemäß ihrer Polarität in vier Fraktionen fraktioniert und derivatisiert (Abbildung 1). Die Hauptbestandteile der Fraktionen sind wie folgt: Fraktion 1: Fettsäuremethylester (FAMEs) und Kohlenwasserstoffe; Fraktion 2: silylierte freie Fettsäuren, Fettsäurealkohole, hydroxylierte FAMEs, Phenole und Sterole; Fraktion 3: silylierte Zucker und Polyole; sowie Fraktion 4: silylierte hydrophile Säuren, Aminosäuren und Amine. Somit enthalten Fraktionen 1 und 2 vorwiegend unpolare Metabolite, während Fraktionen 3 und 4 vorwiegend polare Metabolite enthalten.
Zunächst werden Metaboliten aus dem gemahlenen Gerstenkorn in polare und unpolare Lösungsmittel extrahiert. Eine weitere Fraktionierung erfolgt, um eine bessere Trennung der Metaboliten in den Massenspektren zu ermöglichen. Außerdem ist der Siedepunkt vieler Metaboliten zu hoch, um eine Verdampfung mittels GC zu erlauben, weshalb eine zusätzliche Derivatisierung erforderlich ist. Daher wurden Metaboliten, die Hydroxylgruppen enthalten, in die entsprechenden Trimethylsilyl-(TMS)-Ether umgewandelt6, während Fettsäureester in Fettsäuremethylester überführt wurden. Zusätzlich wurden Zucker in ihre geradkettige Form oximiert, wodurch die Anzahl möglicher Isomere für jeden Zucker reduziert wird7. Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm zur Fraktionierung und Derivatisierung der Metaboliten in Gerstenmehl. Das unten stehende Protokoll erläutert die in dieser Abbildung dargestellten Schritte genauer.
<img alt="Diagramm zur Extraktion von Gerstenmehl, das Lipid- und polare Extraktionsverfahren sowie Verbindungen darstellt." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67175/67175fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Abbildung 1"> 
Abbildung 1: Ein Flussdiagramm zur Fraktionierung und Derivatisierung von Gerstenmetaboliten. Abkürzungen: MeOH = Methanol; NaOMe = Natriummethoxid; TMSIM = N-Trimethylsilylimidazol; MeONH2 = Methoxyaminhydrochlorid; MSTFA = N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamid; DI H2O = deionisiertes Wasser; MTBE = Methyl-tert-butylether; SPE = Festphasenextraktion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67175/67175fig01largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>

<table><tbody><tr><td>4-Chlor-L-phenylalanin</td><td>Alfa Aesar</td><td>15470329</td><td>97%</td></tr><tr><td>5&alpha;-cholestan-3&beta;-ol</td><td>Sigma</td><td>D6128-10G</td><td>95%</td></tr><tr><td>wasserfreies Acetonitril</td><td>Sigma</td><td>360457</td><td>ACS (getrocknet über 3& Aring; Molekularsiebe)</td></tr><tr><td>Wasserfreies Pyridin</td><td>Sigma</td><td>PX2012</td><td>99,8%</td></tr><tr><td>wasserfreies Natriumsulfat</td><td>EMD</td><td>SX0760-1</td><td>ACS</td></tr><tr><td>Argon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gerstenmehl&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Angebaut im Aberdeen Research and Extension Center, University of Idaho</td></tr><tr><td>Deionisiertes Wasser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dichlormethan</td><td>TCI</td><td>D3478</td><td>99%</td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>EMD</td><td>HX0603-3</td><td>ACS</td></tr><tr><td>ISQ 7000 Massenspektrometer</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Long Pastuer Pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Macron</td><td>3016-16</td><td>ACS</td></tr><tr><td>Methoxylaminhydrochlorid</td><td>Thermo</td><td>A19188.06</td><td>98</td></tr>%<tr><td>Methyl-tert-butylether</td><td>VWR</td><td>BDH1139-4LG</td><td>ACS</td></tr><tr><td>n-Heptacosan</td><td>Thermo</td><td>L07796.MD</td><td>97%</td></tr><tr><td>n-Hexan</td><td>Sigma</td><td>HX0295-6</td><td>95%</td></tr><tr><td>N-Methyl-N-trimethylsilyl-trifluoracetamid</td><td>Restek</td><td>35600</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>N-Trimethylsilyimidazol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12512</td><td>97%</td></tr><tr><td>Phenyl-&beta;-D-Glucopyranosid</td><td>Sigma</td><td>292710-5G</td><td>95%</td></tr><tr><td>Rotationsverdampfer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriummethoxid</td><td>Merck</td><td>8.06538.0005</td><td>97%</td></tr><tr><td>SPE Säule</td><td>Agilent</td><td>12113010</td><td></td></tr><tr><td>SPE Lösungsmittel Resevoir Kartusche</td><td>Agilent</td><td>12131014</td><td></td></tr><tr><td>TG-SQC Säule</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trace 1300 Gaschromatograph</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vakuumverteiler</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metabolomische analyse von gerste mittels gaschromatographie/massenspektrometrie

Metabolomic Analysis of Barley by Gas Chromatography/Mass Spectrometry

Der Klimawandel erhöht das Dürrerisiko für die Landwirtschaft und wirkt sich sowohl auf den Nährstoffgehalt der Lebensmittel als auch auf die allgemeine Ernährungssicherheit aus. Die Metabolomik ist eine Möglichkeit, die Auswirkungen von Dürren auf Getreide und andere landwirtschaftliche Produkte zu beobachten und zu quantifizieren. Die identifizierten Metaboliten könnten die Identifizierung der biochemischen Reaktion ermöglichen, die es der Pflanze ermöglicht, stressige Umgebungen zu tolerieren. Die hier vorgestellte Methodik ermöglichte die vollständige metabolomische Analyse von Gerstenmehl mittels Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC/MS). 
Gerstenmehl-Metabolitenextrakte wurden basierend auf der Polarität in vier Fraktionen fraktioniert. Um die Analyse mittels GC/MS zu ermöglichen, wurden Metaboliten derivatisiert, um die Flüchtigkeit und die Metabolitentrennung zu erhöhen: Fettsäureester wurden zu Fettsäuremethylestern derivatisiert; Zucker wurden in ihre geradkettige Form oximiert; und Metaboliten mit Hydroxylgruppen wurden in ihre entsprechenden Silylether umgewandelt. Die derivatisierten Proben wurden in das GC/MS injiziert und die generierten Massenspektren wurden zur Identifizierung von Metaboliten verwendet, indem die generierten Spektren mit der Tandem-Massenspektrenbibliothek des National Institute of Standards and Technology (NIST) verglichen wurden. Die hier beschriebene Methode kann auch verwendet werden, um das Gesamtmetabolom für andere Pflanzen zu untersuchen und so unser Verständnis der biochemischen Reaktionen gestresster Pflanzen zu verbessern.

Das entwickelte Protokoll ermöglicht die erfolgreiche Derivatisierung und Auflösung der zahlreichen Metaboliten im Gerstenmehl. Jeder Peak im Chromatogramm ist einer Verbindung zugeordnet, die anhand ihres Massenspektrums identifiziert wurde. Die drei markantesten Peaks in Fraktion 1 der Probe waren Octadecadiensäuremethylester, Hexadecansäuremethylester und Octadecensäure. Die drei prominentesten Peaks in Fraktion 2 der Probe wurden palmitinsäure- und octadecansäurehaltige TMS-Derivate ...

Eine Methode zur metabolomischen Analyse von Gerste wird vorgestellt. Das Verfahren beinhaltet die Fraktionierung und Derivatisierung von Metaboliten und deren Analyse mittels Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC/MS). Die metabolomische Analyse kann verwendet werden, um die Auswirkungen von Zwischenfruchtanbau und Trockenstress auf das Getreide zu bestimmen.

Metabolomische Analyse von Gerste mittels Gaschromatographie/Massenspektrometrie

Climate change increases drought risk to agriculture and impacts both food nutrient content and overall food security. Metabolomics is one way to observe ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Die Urease-Methode der Probenvorbereitung für die GC / MS-Analyse der Vermittler Metaboliten von seinem Erfinder vorgestellt. Das Verfahren ermöglicht in einem Schritt Follow-up der Neugeborenen-Screening auf angeborene Störungen durch Tandem-Massenspektrometrie durch Quantifizierung Kohlenhydrate, organische und Aminosäuren alle in einem einzigen Prozess.

Ein-Schritt-Metabolomics: Kohlenhydrate, organische und Aminosäuren in einem einzigen Verfahren Quantifizierte

Die nicht-gezielte Erstellung von Metabolitenprofilen durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in Verbindung mit Massenspektrometrie (UPLC-MS) ist eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung des Stoffwechsels.  In diesem Artikel wird ein typischer Arbeitsablauf für die Erstellung von nicht-zielgerichteten Metabolitenprofilen von Serum beschrieben, einschließlich Probenorganisation und -vorbereitung, Datenerfassung, Datenanalyse, Qualitätskontrolle und Metabolitenidentifizierung.

Large Scale Non gezielte Metabolomic Profiling von Serum von Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Dieser Artikel beschreibt die Anwendung von ungezielte Metabolomik, Transcriptomics und multivariate statistische Analysen Traubenbeere Transkripte und Metaboliten , um einen Einblick in das Terroir - Konzept zu gewinnen, das heißt, die Auswirkungen der Umwelt auf die Beere Qualitätsmerkmale.

Das Terroir-Konzept Interpretiert durch Grape Berry Metabolomics und Transcriptomics

Eine verbesserte Protokoll ist für die Messung der transiente Genexpression von Reporter Konstrukte in Gerste Aleuronschicht Zellen nach Bombardement Teilchen vorgestellt. Die Kombination von automatisierten Getreide mahlen mit 96-Well-Platte Enzym-Assays bietet hohen Durchsatz für das Verfahren.

Messung der Genexpression in bombardierten Gerste Aleuronschicht Schichten mit erhöhter Durchsatz

Dieses Protokoll beschreibt die Drosophila Larven für GC-MS-basierte Metabolomic Analyse vorzubereiten.

Vorbereitung von Drosophila Larven Proben für Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS)-basierte Metabolomik

Die systemweite Analyse mehrerer Biomoleküle ist entscheidend, um funktionelle und mechanistische Einblicke in biologische Prozesse zu gewinnen. Dabei wird ein umfangreiches Protokoll zur Hochdurchsatzextraktion von Lipiden, Metaboliten, Proteinen und Stärke aus einer einzigen Probe beschrieben, die aus synchronisierter Chlamydomonas-Kultur geerntet wird.

Eine Multi-Omics Extraktionsmethode für die In-Depth-Analyse synchronisierter Kulturen der Grünen Alga Chlamydomonas reinhardtii

Es wird eine Methode zur Transkription von Getreideprofilen vorgestellt. Das mikroarraybasierte Genexpressionsprofiling beginnt mit der Isolierung hochwertiger Gesamt-RNA aus Getreidekörnern und setzt sich mit der Generierung von cDNA fort. Nach cRNA-Kennzeichnung und Mikroarray-Hybridisierung werden Empfehlungen zur Signalerkennung und Qualitätskontrolle gegeben.

Beschaffung hochwertiger Transkriptomdaten von Getreidesamen durch eine modifizierte Methode zur Genexpressionsprofilierung

Eine Methode zur ungezielten Analyse von Weizenkornmetaboliten und Lipiden wird vorgestellt. Das Protokoll umfasst eine Acetonit-Metabolit-Extraktionsmethode und eine umgekehrte Phase-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Methodik mit Erfassung in positiven und negativen Elektrospray-Ionisationsmodi.

Ungezielte Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierte Metabolomik-Analyse von Weizengetreide

Wir präsentieren ein Protokoll zur Identifizierung und Quantifizierung von Hauptklassen wasserlöslicher Metaboliten in der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Die beschriebene Methode ist vielseitig, robust und sensibel. Es ermöglicht die Trennung von Strukturisomeren und stereoisomeren Formen wasserlöslicher Metaboliten voneinander.

Quantitative Metabolomik von Saccharomyces Cerevisiae mittels Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Die Protokolle beschreiben Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Methoden, gekoppelt an Brechungsindex oder massenspektrometrische Detektion zur Untersuchung von Stoffwechselreaktionen in komplexen lysatbasierten zellfreien Systemen.

Flüssigkeitschromatographie gekoppelt an Brechungsindex oder massenspektrometrische Detektion zur Metabolitenprofilierung in lysatbasierten zellfreien Systemen

Erfahren Sie die metabolomische Analyse von Gerste mittels GC/MS zur Untersuchung von Trockenstress in der Landwirtschaft. Diese Methode verbessert die Effizienz der Metabolitenidentifizierung und liefert Einblicke in pflanzliche Stressantworten.

Metabolomische Analyse von Gerste mittels Gaschromatographie/Massenspektrometrie

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