Erzeugung humaner chimärer Antigenrezeptor-regulatorischer T-Zellen

Unser Labor entwirft künstliche Immunrezeptoren, wie z. B. chimäre Antigenrezeptoren, und untersucht, wie sie die regulatorische T-Zellbiologie beeinflussen. Durch die Erfindung neuer DNA-Sequenzen und die Verwendung humanisierter Mausmodelle von Krankheiten wollen wir technische Immunzelltherapien für Autoimmunerkrankungen, Transplantatabstoßung, Krebs und Alterung entwickeln. Bei der Entwicklung chimärer Antigenrezeptoren für regulatorische T-Zellen ist es entscheidend, ihre Stärke zu berücksichtigen.

Hochaffine CAR-Tregs verhalten sich eher wie Effektor-T-Zellen, produzieren vermehrt entzündliche Zytokine und zeigen eine größere Abtötungsaktivität. Unsere laufende Forschung zeigt, dass eine Verringerung der CAR-Affinität zu verbesserten Zytokinprofilen und -funktionen bei CAR-Tregs führt. Das CAR Treg-Feld ist noch im Entstehen begriffen und es fehlt an Standardisierung.

Unser Protokoll führt einen robusten, universellen Ansatz zum Generieren und Testen von CAR-Tregs ein. Dies verbessert die Reproduzierbarkeit und beschleunigt die Innovation, während es gleichzeitig Labore anleitet, die neu in der CAR-Treg-Forschung sind, insbesondere angesichts der Herausforderungen der Treg-Knappheit und der speziellen Anforderungen. Wir untersuchen die Mechanismen, die regulatorische T-Zellen nutzen, um das Immungleichgewicht aufrechtzuerhalten und die Heilung des Gewebes zu fördern.

Unsere Forschung umfasst das Verständnis der CAR-Treg-Signalgebung und -Funktion sowie die Erforschung neuer Krankheitskontexte, in denen die CAR-Treg-Therapie im Vergleich zu aktuellen Strategien einzigartige Vorteile bieten kann. Übertragen Sie zunächst den Inhalt des Leukopaks in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie das gleiche Volumen DPBS mit 2 % fötalem Rinderserum hinzu und mischen Sie es vorsichtig mit einer Pipette.

Schleudere die Tube bei 300g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Sobald der Überstand aspiriert ist, rekonstituieren Sie das Zellpellet in zwei Millilitern DPBS mit 2 % fötalem Rinderserum. Geben Sie dann acht Milliliter Ammoniumchloridlösung in die Zellsuspension und mischen Sie durch sanfte Inversion.

Mit dem Abbruch die gewaschenen Zellen bei 150 g 10 Minuten bei Raumtemperatur schleudern. Nach dem Aspirieren des Überstands wird das Zellpellet in 30 Millilitern DPBS mit 2 % fötalem Rinderserum resuspendiert. Schleudern Sie dann 10 hoch acht bis 10 hoch neun PBMCs bei 500 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Und resuspendieren Sie in Zelltrennungspuffer in einer Konzentration von fünfmal 10 hoch sieben Zellen pro Milliliter. Für die fluoreszenzgestützte Zellsortierung von regulatorischen T-Zellen werden CD4-positive Zellen fünf Minuten lang bei 500 g gedreht. Rekonstituieren Sie dann die Zellen in 200 Mikrolitern DPBS.

Fügen Sie für jede eine Million Zellen einen Mikroliter Anti-Human-CD4-FITC, einen Mikroliter Anti-Human-CD25 APC und einen Mikroliter Anti-Human-CD127 PE hinzu. Nachdem Sie die Tube vorsichtig vortext haben, legen Sie sie für 30 Minuten in einen vier Grad Celsius heißen Kühlschrank. Sobald die Zellen mit 10 Millilitern DPBS mit 2 % fötalem Rinderserum gewaschen sind, schleudern Sie sie fünf Minuten lang bei 500 g und resuspendieren Sie die gefärbten Zellen vorsichtig bei 1,5 mal 10 hoch sieben Zellen pro Milliliter in DPBS mit 2 % fötalem Rinderserum. Anschließend wird die gefärbte Zellsuspension durch eine 40-Mikrometer-Filterkappe in fluoreszenzgestützte Zellsortierröhrchen geleitet.

Bereiten Sie 15-Milliliter-Entnahmeröhrchen mit drei Millilitern RPMI10-Medium vor und legen Sie sie auf Eis. Sortieren Sie schließlich CD4-positive, CD25-hohe, CD127-negative regulatorische T-Zellen und CD4-positive, CD25-niedrige, CD127-positive konventionelle T-Zellen mithilfe der fluoreszenzgestützten Zellsortierung. Nehmen Sie zunächst regulatorische T-Zellen, die 48 Stunden nach der Aktivierung aus menschlichem Blut isoliert wurden, und resuspendieren Sie sie.

Nach dem Zählen der Zellen bei 500 g fünf Minuten bei Raumtemperatur schleudern. Resuspendieren Sie regulatorische T-Zellen in RPMI10 mit 1,25 mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter mit 1.000 internationalen Einheiten pro Milliliter Interleukin-2. Fügen Sie nun jedes Lentivirus-Aliquot zu 2,5 mal 10 hoch der Leistung von fünf regulatorischen T-Zellen in 200 Mikrolitern in einem Mikrozentrifugenröhrchen hinzu.

Spinokulieren Sie bei 1.000 g für eine Stunde bei 32 Grad Celsius. Verschieben Sie jede 200-Mikroliter-Reaktion auf eine 24-Well-Platte. Inkubieren Sie die Platte mit den transduzierten regulatorischen T-Zellen über Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator.

Füllen Sie jede Vertiefung auf zwei Milliliter mit RPMI10-Medium auf, wobei die endgültige Interleukin-2-Konzentration 1.000 internationale Einheiten pro Milliliter beträgt. Beurteilen Sie die Effizienz von Genmodifikationen mithilfe der Durchflusszytometrie, wie hier gezeigt. Nehmen Sie zunächst resuspendierte regulatorische T-Zellen mit Anti-CD3, CD28-Kügelchen in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen 48 Stunden nach der Aktivierung ein.

Inkubieren Sie die Zellsuspension drei Minuten lang in einem Magneten. Während Sie sich im Magneten befinden, übertragen Sie die Zellen im Medium per Pipette in ein neues Röhrchen. Lassen Sie die entküppelten regulatorischen T-Zellen nach der Perlenentfernung zwei Stunden lang in RPMI10 ruhen.

Dann drehen Sie regulatorische T-Zellen bei 500 g für fünf Minuten. Sobald der Überstand dekantiert ist, resuspendieren Sie die Zellen in vorgewärmtem reduziertem Serummedium bei viermal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter. Aliquot Zellen in 100 Mikrolitern in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung.

Fügen Sie jeder Probe chimäre Antigenrezeptor-Adeno-assoziierte Viren mit einer Infektionsvielfalt von 20.000 hinzu und resuspendieren Sie. Inkubieren Sie dann die Reaktionsgefäße eine Stunde lang im Gewebekultur-Inkubator. Bereiten Sie während der Inkubation CRISPR-Cas9-Ribonukleoproteinkomplexe vor, indem Sie 8,3 Mikroliter Cas9-Protein zu 2,5 Mikrolitern Einzelleit-RNA hinzufügen, die auf den Track-Gen-Locus abzielen.

Nachdem Sie die Komponenten gründlich gemischt haben, inkubieren Sie das Ribonukleoprotein-Gemisch für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius im Gewebekultur-Inkubator. Füllen Sie anschließend ein frisches Elektroporationsröhrchen mit drei Millilitern Elektroporationspuffer mit hoher Osmolarität. Führen Sie den gefüllten Elektroporationsschlauch in die Pipettenstation des Elektroporationssystems ein, bis ein Klicken zu hören ist.

Stellen Sie die Elektroporationsbedingungen im Elektroporationssystem auf 2.200 Volt, 20 Millisekunden und einen Impuls ein. Wenn die einstündige Inkubation mit dem Adeno-assoziierten Virus abgeschlossen ist, drehen Sie die Zellen mit dem Virus bei 300 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Sobald der Überstand aspiriert ist, resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 Mikrolitern des Zellresuspensionspuffers, der vom Elektroporationssystem pro Probe bereitgestellt wird.

Fügen Sie dann 10,8 Mikroliter Ribonukleoproteinkomplex pro Probe hinzu und mischen Sie es gut mit einer Pipette, ohne Blasen zu bilden. Führen Sie nun eine 100-Mikroliter-Elektroporationsspitze ein, indem Sie die Pipette bis zum zweiten Anschlag schieben, um die Klemme zu öffnen. Positionieren Sie den oberen Kopf der Pipette in der Elektroporationsspitze, bis die Klemme sicher in den Befestigungsschaft des Kolbens einrastet.

Lassen Sie den Knopf allmählich los, während Sie den Druck nach unten auf die Pipette aufrechterhalten, um sicherzustellen, dass die Spitze eng anliegt und keine Lücken aufweist. Drücken Sie dann die Pipette bis zum ersten Anschlag und tauchen Sie die Elektroporationsspitze in das Ribonukleoproteingemisch der Zelle ein. Ziehen Sie die Probe vorsichtig und blasenfrei in die Pipette ein.

Führen Sie die Pipette mit der montierten Elektroporationsspitze, die die Probe enthält, senkrecht in das E-Rohr ein, bis ein Klickgeräusch zu hören ist. Nachdem Sie die optimalen Einstellungen für menschliche regulatorische T-Zellen bestätigt haben, drücken Sie auf dem Touchscreen auf Start, um die Zellen zu elektropolieren. Warten Sie, bis der Touchscreen vollständig angezeigt wird.

Entfernen Sie vorsichtig die Pipette und geben Sie die Probe sofort in die vorbereitete Sechs-Well-Platte, die 2,5 Milliliter vorgewärmtes antibiotikafreies RPMI10-Medium mit Interleukin-2 pro Well enthält. Nachdem Sie die Platte vorsichtig in linearen Bewegungen geschaukelt haben, legen Sie sie in den Gewebekultur-Inkubator. Ersetzen Sie am nächsten Tag, 16 bis 18 Stunden später, das Medium durch antibiotikahaltige Medien.

Zählen Sie die elektroporierten regulatorischen T-Zellen und die Kultur bei 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter mit 1.000 internationalen Einheiten pro Milliliter Interleukin-2.