Name: Erzeugung humaner chimärer Antigenrezeptor-regulatorischer T-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-03T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Erfahren Sie die Erzeugung humaner CAR-Treg-Zellen für Immuntherapien bei Autoimmunerkrankungen und Transplantatabstoßung. Dieses Protokoll optimiert die CAR-Affinität für verbesserte Zytokinprofile und Zellfunktion.

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<meta charset="utf8"></head><body>Entwicklung und Ausbau von humanen CAR-Tregs für Immunregulationstherapien

<ol><li>Zhang, X., Zhu, L., Zhang, H., Chen, S., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cell+therapy+in+hematological+malignancies%3A+current+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">CAR-T cell therapy in hematological malignancies: current opportunities and challenges.</a> Front Immunol. 13, 927153(2022).</li>
<li>Cappell, K. M., Kochenderfer, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+outcomes+following+CAR+T+cell+therapy%3A+what+we+know+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Long-term outcomes following CAR T cell therapy: what we know so far.</a> Nat Rev Clin Oncol. 20 (6), 359-371 (2023).</li>
<li>Choi, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraventricular+CARv3-TEAM-E+T+cells+in+recurrent+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Intraventricular CARv3-TEAM-E T cells in recurrent glioblastoma.</a> N Engl J Med. 390 (14), 1290-1298 (2024).</li>
<li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locoregional+delivery+of+IL-13Ralpha2-targeting+CAR-T+cells+in+recurrent+high-grade+glioma%3A+a+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Locoregional delivery of IL-13Ralpha2-targeting CAR-T cells in recurrent high-grade glioma: a phase 1 trial.</a> Nat Med. 30 (4), 1001-1012 (2024).</li>
<li>Bagley, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+bivalent+CAR+T+cells+targeting+EGFR+and+IL13Ralpha2+in+recurrent+glioblastoma%3A+phase+1+trial+interim+results%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Intrathecal bivalent CAR T cells targeting EGFR and IL13Ralpha2 in recurrent glioblastoma: phase 1 trial interim results.</a> Nat Med. 30 (5), 1320-1329 (2024).</li>
<li>Ghobadinezhad, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+regulatory+cell-based+therapy+in+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The emerging role of regulatory cell-based therapy in autoimmune disease.</a> Front Immunol. 13, 1075813(2022).</li>
<li>Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+and+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells and immune tolerance.</a> Cell. 133 (5), 775-787 (2008).</li>
<li>Sakaguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells and human disease.</a> Annu Rev Immunol. 38, 541-566 (2020).</li>
<li>Ferreira, L. M. R., Muller, Y. D., Bluestone, J. A., Tang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+regulatory+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Next-generation regulatory T cell therapy.</a> Nat Rev Drug Discov. 18 (10), 749-769 (2019).</li>
<li>Rosenblum, M. D., Gratz, I. K., Paw, J. S., Abbas, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+human+autoimmunity%3A+current+practice+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Treating human autoimmunity: current practice and future prospects.</a> Sci Transl Med. 4 (125), 125sr121(2012).</li>
<li>Sawitzki, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+cell+therapy+in+kidney+transplantation+%28The+ONE+Study%29%3A+a+harmonised+design+and+analysis+of+seven+non-randomised%2C+single-arm%2C+phase+1%2F2A+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Regulatory cell therapy in kidney transplantation (The ONE Study): a harmonised design and analysis of seven non-randomised, single-arm, phase 1/2A trials.</a> Lancet. 395 (10237), 1627-1639 (2020).</li>
<li>Spanier, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tregs+with+an+MHC+class+II+peptide-specific+chimeric+antigen+receptor+prevent+autoimmune+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Tregs with an MHC class II peptide-specific chimeric antigen receptor prevent autoimmune diabetes in mice.</a> J Clin Invest. 133 (18), e168601(2023).</li>
<li>Muller, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+engineering+of+an+anti-HLA-A2+chimeric+antigen+receptor+in+regulatory+T+cells+for+transplant+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Precision engineering of an anti-HLA-A2 chimeric antigen receptor in regulatory T cells for transplant immune tolerance.</a> Front Immunol. 12, 686439(2021).</li>
<li>MacDonald, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alloantigen-specific+regulatory+T+cells+generated+with+a+chimeric+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Alloantigen-specific regulatory T cells generated with a chimeric antigen receptor.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1413-1424 (2016).</li>
<li>Boardman, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellin-specific+human+CAR+Tregs+for+immune+regulation+in+IBD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Flagellin-specific human CAR Tregs for immune regulation in IBD.</a> J Autoimmun. 134, 102961(2023).</li>
<li>Schreeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+design%3A+human+leukocyte+antigen+Cclass+I+molecule+A%28%2A%2902-chimeric+antigen+receptor+regulatory+T+cells+in+renal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int+Rep%22%5BJournal%5D)">Study design: human leukocyte antigen Cclass I molecule A(*)02-chimeric antigen receptor regulatory T cells in renal transplantation.</a> Kidney Int Rep. 7 (6), 1258-1267 (2022).</li>
<li>Zimmerman, C. M., Robino, R. A., Cochrane, R. W., Dominguez, M. D., Ferreira, L. M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+human+conventional+and+regulatory+T+cells+using+chimeric+antigen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Redirecting human conventional and regulatory T cells using chimeric antigen receptors.</a> Methods Mol Biol. 2748, 201-241 (2024).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+decrease+of+donor-reactive+T%28regs%29+after+liver+transplantation+limits+T%28reg%29+therapy+for+promoting+allograft+tolerance+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Selective decrease of donor-reactive T(regs) after liver transplantation limits T(reg) therapy for promoting allograft tolerance in humans.</a> Sci Transl Med. 14 (669), eabo2628(2022).</li>
<li>Bender, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+2+randomized+trial+with+autologous+polyclonal+expanded+regulatory+T+cells+in+children+with+new-onset+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A phase 2 randomized trial with autologous polyclonal expanded regulatory T cells in children with new-onset type 1 diabetes.</a> Sci Transl Med. 16 (746), eadn2404(2024).</li>
<li>Ferreira, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conference+report%3A+Advanced+Therapies+Week+2023%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Conference report: Advanced Therapies Week 2023.</a> Regen Med. 18 (4), 297-299 (2023).</li>
<li>Cochrane, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+test+human+CAR+T+cells+in+solid+tumors%2C+the+next+frontier+of+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">How to test human CAR T cells in solid tumors, the next frontier of CAR T cell therapy.</a> Methods Mol Biol. 2748, 243-265 (2024).</li>
<li>Roy, A., Krzykwa, E., Lemieux, R., Neron, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+efficiency+of+gamma-irradiated+versus+mitomycin+C-treated+feeder+cells+for+the+expansion+of+normal+human+cells+in+long-term+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematother+Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Increased efficiency of gamma-irradiated versus mitomycin C-treated feeder cells for the expansion of normal human cells in long-term cultures.</a> J Hematother Stem Cell Res. 10 (6), 873-880 (2001).</li>
<li>Eyquem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+CAR+to+the+TRAC+locus+with+CRISPR%2FCas9+enhances+tumour+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection.</a> Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).</li>
<li>Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Bjorklund, T., Davidsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+Production+everywhere%3A+a+simple%2C+fast%2C+and+reliable+protocol+for+in-house+AAV+vector+production+based+on+chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">AAV Production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house AAV vector production based on chloroform extraction.</a> Curr Protoc Neurosci. 93 (1), e103(2020).</li>
<li>Velasco Cardenas, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+CD3+diversity+to+optimize+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Harnessing CD3 diversity to optimize CAR T cells.</a> Nat Immunol. 24 (12), 2135-2149 (2023).</li>
<li>Boomer, J. S., Green, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enigmatic+tail+of+CD28+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">An enigmatic tail of CD28 signaling.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (8), a002436(2010).</li>
<li>Suhoski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+artificial+antigen-presenting+cells+to+express+a+diverse+array+of+co-stimulatory+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Engineering artificial antigen-presenting cells to express a diverse array of co-stimulatory molecules.</a> Mol Ther. 15 (5), 981-988 (2007).</li>
<li>Fung, V. C. W., Rosado-Sanchez, I., Levings, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+human+T+cell+subsets+with+lentivirus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transduction of human T cell subsets with lentivirus.</a> Methods Mol Biol. 2285, 227-254 (2021).</li>
<li>Bailey-Bucktrout, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-antigen-driven+activation+induces+instability+of+regulatory+T+cells+during+an+inflammatory+autoimmune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Self-antigen-driven activation induces instability of regulatory T cells during an inflammatory autoimmune response.</a> Immunity. 39 (5), 949-962 (2013).</li>
<li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+of+Helios-deficient+Tregs+is+associated+with+conversion+to+a+T-effector+phenotype+and+enhanced+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Instability of Helios-deficient Tregs is associated with conversion to a T-effector phenotype and enhanced antitumor immunity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (22), 6248-6253 (2016).</li>
<li>Dawson, N. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+effects+of+chimeric+antigen+receptor+co-receptor+signaling+domains+in+human+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Functional effects of chimeric antigen receptor co-receptor signaling domains in human regulatory T cells.</a> Sci Transl Med. 12 (557), eaaz3866(2020).</li>
<li>Rana, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-+and+TRuC-redirected+regulatory+T+cells+differ+in+capacity+to+control+adaptive+immunity+to+FVIII%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">CAR- and TRuC-redirected regulatory T cells differ in capacity to control adaptive immunity to FVIII.</a> Mol Ther. 29 (9), 2660-2676 (2021).</li>
<li>Battaglia, M., Stabilini, A., Tresoldi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+human+T+regulatory+cells+with+the+mTOR-inhibitor+rapamycin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Expanding human T regulatory cells with the mTOR-inhibitor rapamycin.</a> Methods Mol Biol. 821, 279-293 (2012).</li>
<li>Brady, B. L., Steinel, N. C., Bassing, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+receptor+allelic+exclusion%3A+an+update+and+reappraisal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen receptor allelic exclusion: an update and reappraisal.</a> J Immunol. 185 (7), 3801-3808 (2010).</li>
<li>Samarasinghe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+alloreactive+T+cells+identifies+CD25+and+CD71+as+optimal+targets+for+a+clinically+applicable+allodepletion+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of alloreactive T cells identifies CD25 and CD71 as optimal targets for a clinically applicable allodepletion strategy.</a> Blood. 115 (2), 396-407 (2010).</li>
<li>Voss, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXP3+protects+conventional+human+T+cells+from+premature+restimulation-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">FOXP3 protects conventional human T cells from premature restimulation-induced cell death.</a> Cell Mol Immunol. 18 (1), 194-205 (2021).</li>
<li>Collison, L. W., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Treg+suppression+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro Treg suppression assays.</a> Methods Mol Biol. 707, 21-37 (2011).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Adeno-assoziiertes Virus&nbsp;( AAV)</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CAR-Target-exprimierende K562-Zellen</td><td></td><td></td><td>, z.B. CD19-K562</td></tr><tr><td>Cäsium-137-Bestrahlungsgerät</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-humanes CD8 PerCP (Klon SK1)</td><td>Biolegend</td><td>344708</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humanes CD4 PE/Cy7 (Klon SK3)</td><td>Biolegend</td><td>344612</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-15 Magnet</td><td>ThermoFisher</td><td>12301D</td><td></td></tr><tr><td>Ghost BV510 Lebensfähigkeits-Farbstoff</td><td>TONBO</td><td>13-0870-T100</td><td></td></tr><tr><td>K562 Küvetten</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>15575020</tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumchlorid-Lösung</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7850</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD127 PE (Klon hIL-7R-M21)</td><td>BD Biosciences</td><td>557938</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD25 APC (Klon BC96)</td><td>Biolegende&nbsp;</td><td>302610</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD4-FITC (Klon SK3)</td><td>Biolegende&nbsp;</td><td></td><td></td>344604</tr><tr><td>Anti-Human-CD71 PE (Klon SK1)</td><td>Biolegend</td><td>334106</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD8 PerCP (Klon SK1)</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td></td><td></td>344707</tr><tr><td>Anti-Mensch CTLA-4 PerCP-e710</td><td>ThermoFisher</td><td>46-1529-42</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mensch EGFR APC (Klon AY13)</td><td>Biolegend</td><td>352905</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mensch FOXP3 eFluor 450</td><td>ThermoFisher</td><td>48-4776-42</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mensch HELIOS PE</td><td>Biolegend</td><td>137216</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+ und Mg2+ freies Dulbecco" s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Zellzähler (TC20 Automatisierter Zellzähler)</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger zur Zellzählung</td><td>Bio-Rad</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Violet Cell Proliferation Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>C34571</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep Magnet</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>EasySep CD4+ T-Zell-Anreicherungskit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19052</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human CD8+ T-Zell-Anreicherungskit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19053</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Foxp3 Transkriptionsfaktor-Färbepuffer-Set</td><td>ThermoFisher</td><td>00-5523-00</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Reagenzgläser aus Polystyrol mit rundem Boden und Zellsieb-Schnappkappe, 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-23</td><td>40&mu; m</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>CytoFLEX LX U3-V5-B3-Y5-R3-I2</td></tr><tr><td>Fluoreszenzaktivierter Zellsortierer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>FACS Aria III Zellsortierer</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>humane CD3/28 T-Zellexpansions- und -aktivierungsdynabeads</td><td>Gibco</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Neon Transfektion</td><td>System ThermoFisher</td><td>10431915</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Neon Transfektion System 100 &mu; L Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>10114334</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus</td><td>VectorBuilder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Myc Tag Antikörper A647 (Klon 9B11)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>2233S</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduziertes Serummedium</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycin-Lösung</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>rekombinantes humanes Interleukin-2 (rhIL-2)</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, kein Glutamin</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Spektrales Durchflusszytometer</td><td>Cytek</td><td></td><td>Northern Lights</td></tr><tr><td>TRAC gRNA</td><td>Synthego</td><td></td><td>Sequenz (CAGGGTTCTGGATATCTGT)</td></tr><tr><td>TrueCut Cas9 Protein v2</td><td>ThermoFisher</td><td>A36496</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblaue Lösung&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T8154-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1/10 Leukopak</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>200-0092</td><td>1-2 Milliarden PBMC</td></tr></tbody></table>

erzeugung humaner chimärer antigenrezeptor-regulatorischer t-zellen

Generation of Human Chimeric Antigen Receptor Regulatory T Cells

Das hier beschriebene Protokoll bietet eine optimierte und standardisierte Pipeline zur Bewertung neuer chimärer Antigenrezeptor (CAR)-Konstrukte in humanen regulatorischen T-Zellen (Tregs) mit dem Ziel, lebende Therapeutika für Autoimmunerkrankungen, Graft-versus-Host-Krankheit, Abstoßung von Organtransplantaten und Allergien zu entwickeln. Abbildung 1 zeigt, wie wir mit Hilfe von FACS hochreine humane Tregs aus peripherem Blut gewinnen (Abbildung 1A), was anha...

Erzeugung humaner chimärer Antigenrezeptor-regulatorischer T-Zellen

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has reshaped the face of cancer treatment, leading to record remission rates in previously incurable ...

generation-of-human-chimeric-antigen-receptor-regulatory-t-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir beschreiben ein Verfahren zum Erzeugen regulatorische, Speicher und naive T-Zellen aus einem einzelnen menschlichen Blutspender. Polarisierten Tregs können dann auf andere Teilmengen in einer Vielzahl von genetischen und funktionelle Anwendungen mit genetische Homogenität, einschließlich einer Unterdrückung Assay auch hier detailliert verglichen werden.

Generation der induzierte regulatorische T-Zellen aus primären humanen naiven und Gedächtnis-T-Zellen

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Herstellung von chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen ex vivo. Menschliche T-Zellen werden mit magnetischen Kügelchen inkubiert, die mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern beschichtet sind, zusammen mit einem mit Interleukin-2 (IL-2) angereicherten Medium, was zu einer Aktivierung und Proliferation von T-Zellen führt. Transgene lentivirale Vektoren werden eingeführt, die es der transgenen RNA ermöglichen, sich in das Wirtsgenom zu integrieren und...

Eine ex vivo-Technik zur Herstellung chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen

Dieses Video demonstriert eine Technik zur ex vivo Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen. Retrovirale Vektoren, die transgene RNA tragen, werden mit Milzzellen in einem mit Interleukin-2 supplementierten Medium gemischt, um das Überleben und die Proliferation von T-Zellen zu fördern. Das Gemisch wird dann auf eine mit rekombinanten menschlichen Fibronektinfragmenten beschichtete Platte überführt und zentrifugiert, um die Fusion des Virus mit der Zelle...

Eine ex vivo-Technik zur Erzeugung tumorspezifischer chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Erzeugung antigenspezifischer chimärer Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen durch retrovirale Transduktion. Aktivierte murine CD8+ T-Zellen werden in eine Mikrotiterplatte gegeben, die mit rekombinanten Fibronektinfragmenten beschichtet ist. Retrovirale Vektoren, die transgene RNA enthalten, die für einen antigenspezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) kodieren, werden dann eingeführt, und die Platte wird zentrifugiert, um die Transduktion zu erleichtern.

Eine Technik zur Erzeugung antigenspezifischer CAR-T-Zellen

Wir beschreiben einen Ansatz zur zuverlässigen Generierung von chimeric antigen receptor (CAR) T-Zellen und testen deren Differenzierung und Funktion in vitro und in vivo.

Herstellung von Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Zellen für die Adoptivimmuntherapie

Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Transduktion primärer menschlicher T-Zellen mit einem Gen von Interesse, um die Kompatibilität mit den GMP-Standards (Good Manufacturing Practice) sicherzustellen.

Ein GMP-konformes Verfahren zur Erzeugung genmodifizierter T-Zellen

Dieser Artikel beschreibt den Herstellungsprozess für chimäre Antigenrezeptor-T-Zellen für den klinischen Einsatz, insbesondere unter Verwendung eines automatisierten Zellprozessors, der in der Lage ist, virale Transduktion und Kultivierung von T-Zellen durchzuführen. Wir geben Empfehlungen und beschreiben Fallstricke, die bei der Prozessentwicklung und Durchführung einer frühen klinischen Studie berücksichtigt werden sollten.

Herstellung von chimären Antigenrezeptor-T-Zellen auf einem automatisierten Zellprozessor

Dieses Protokoll rationalisiert die retrovirale Vektorproduktion und die murine T-Zelltransduktion und erleichtert die effiziente Generierung von CAR-T-Zellen der Maus.

Effiziente Generierung von murinen chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung und funktionellen Verifizierung von Hypoxie-sensitiven chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen vor. Dieses Protokoll stellt die Lentivirus-basierte Generierung von Hypoxie-sensitiven CAR-T-Zellen und deren Charakterisierung vor, einschließlich der Validierung der Hypoxie-abhängigen CAR-Expression und der selektiven Zytotoxizität.

Generierung und funktionelle Verifizierung von Hypoxie-sensitiven chimären Antigenrezeptor-T-Zellen

CD4+ Regulatorische T-Zellen sind potente Immunmodulatoren und erfüllen wichtige Funktionen bei der Immunhomöostase. Der Mangel an diesen Zellen im peripheren Blut macht funktionelle Studien, insbesondere im Zusammenhang mit HIV-1-Infektionen, zu einer Herausforderung. Wir beschreiben hier eine Methode zur Isolierung und Expansion funktioneller CD4+ Tregs aus peripherem Blut von HIV-1-infizierten Personen.

Neue Tools erweitern regulatorischen T-Zellen von HIV-1-infizierten Personen

Erfahren Sie die Erzeugung humaner CAR-Treg-Zellen für Immuntherapien bei Autoimmunerkrankungen und Transplantatabstoßung. Dieses Protokoll optimiert die CAR-Affinität für verbesserte Zytokinprofile und Zellfunktion.

Erzeugung humaner chimärer Antigenrezeptor-regulatorischer T-Zellen

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