Name: Entwicklung eines polymikrobiellen Kolonie-Biofilmmodells zur Erprobung von Antibiotika bei Mukoviszidose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Erfahren Sie die Entwicklung eines polymikrobiellen Biofilmmodells für Mukoviszidose-Erreger mit hohem Durchsatz. Diese Methode ermöglicht realistische Antibiotika-Tests und verbessert die klinische Anwendbarkeit.

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<meta charset="utf8"></head><body>Anpassbares CF-Modell für antimikrobielle Tests und mikrobielle Dynamikanalysen

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 <a target="_blank" href="https://cysticfibrosis.msu.edu/index.php/welcome/news-and-events/39-2021-cf-foundation-patient-registry-highlights-report">https://cysticfibrosis.msu.edu/index.php/welcome/news-and-events/39-2021-cf-foundation-patient-registry-highlights-report</a> (2022).</li>
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<li>Grainha, T., Jorge, P., Alves, D., Lopes, S. P., Pereira, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+pseudomonas+aeruginosa+and+candida+albicans+communication+in+coinfection+scenarios%3A+Insights+through+network+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Unraveling pseudomonas aeruginosa and candida albicans communication in coinfection scenarios: Insights through network analysis.</a> Front Cell Infect Microbiol. 10, 550505(2020).</li>
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<li>Burmølle, M., Ren, D., Bjarnsholt, T., Sørensen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+in+multispecies+biofilms%3A+Do+they+actually+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Interactions in multispecies biofilms: Do they actually matter.</a> Trends Microbiol. 22 (2), 84-91 (2014).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>1 & Mikro; L Impfösen&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13 mm 0,2 &Mikro; M Polycarbonat-Scheiben in Porengröße&nbsp;</td><td>Isopore&nbsp;</td><td>GTTP01300</td><td>Größere Scheiben sind ebenfalls erhältlich&nbsp;</td></tr><tr><td>2 mL verstärkte Schläuche&nbsp;</td><td>Thermofischer&nbsp;</td><td></td><td></td>15545809</tr><tr><td>2,5 mL Keramikperlen&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>13114-325</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Duran-Flasche aus Borosilikatglas</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>Z305197</td><td>größere Flaschen, die in größeren Volumina erhältlich sind, sind erwünscht</td></tr><tr><td>6-Well-Kulturplatten</td><td>Greiner</td><td>657165</td><td></td></tr><tr><td>7 mL Bijou</td><td>Thermofisher&nbsp;</td><td>129B</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platten</td><td>Thermofisher&nbsp;</td><td>167008</td><td>für serielle Verdünnungen im CFU-Assay</td></tr><tr><td>Agarplatten zur Herstellung von Platten aus P. aerugnisa, S. aureus, und C. albicans</td><td></td><td></td><td>&nbsp;LB Miller für P. aeruginosa und S. aureus und Sabouraud Dextrose-Agar&nbsp; für C. albicans&nbsp; </td></tr><tr><td>Bead Beater - geeignet für 2 mL Röhrchen</td><td>Fisherbrand&nbsp;</td><td>15515799</td><td>Thermofisher Kugelmühle 24</td></tr><tr><td>Tischzentrifuge&nbsp;</td><td></td><td></td><td>muss in der Lage sein, mindestens 8000 x g</td></tr><tr><td>Schwarze 96-Well-Platten mit klarem Boden</td><td>zu verarbeiten Costar&nbsp;</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Bunsenbrenner&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Behälter für die Entsorgung von kontaminierten Geräten und Materialien gemäß den Gesundheits- und Sicherheitsvorschriften des Instituts.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>deionisiertes Wasser&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>eDNA&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>31149</td><td></td></tr><tr><td>Filtereinheit&nbsp;</td><td>Fisherbrand&nbsp;</td><td>FB12566504</td><td>Austauschbar je nach verwendeter Vakuumpumpe, muss aber eine Porengröße von 0,2 & Mikro haben; m</td></tr><tr><td>Hämozytometer und Deckglas</td><td>Hawksley&nbsp;</td><td>HC001</td><td>Hämozytometer können sich in Größe und Volumen unterscheiden. Überprüfen Sie die CFU-Berechnungen und passen Sie sie entsprechend an.</td></tr><tr><td>LB Brühe&nbsp;</td><td>Oxoid&nbsp;</td><td>1.46813</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol-Salz-Agar</td><td>Oxoid&nbsp;</td><td></td><td></td>CM0085B</tr><tr><td>meropenem</td><td>abcr</td><td>Ab243429</td><td></td></tr><tr><td>Mucin aus Schweinemagen Typ II</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>M2378</td><td></td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td>1003352658</tr><tr><td>Petrischalen</td><td>SLS</td><td>SLS2000</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas-Isolations-Agar</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>17208</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin Natriumsalz&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>199303</tr><tr><td>Sabouraud Dextrose-Agar&nbsp;</td><td>Oxoid&nbsp;</td><td>CM0041</td><td></td></tr><tr><td>Auswahl der Pinzette&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Pinzetten mit feiner Spitze und Gewebe mit Zähnen zum Transfer von Keramikkügelchen,</td></tr><tr><td>serologischen Pipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Schütteln und statischen Inkubatoren&nbsp;</td><td></td><td></td><td>muss temperiert werden</td></tr><tr><td>Sparks Mikrotiterplattenleser</td><td>Tecan&nbsp;</td><td></td><td>Für den Resazurin-Assay muss der Mikrotiterplatten-Reader über die entsprechenden Filter verfügen oder ein Monochromator zum Nachweis von Fluoreszenz sein.</td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Technischer Agar (Agar Technical No.2 )</td><td>Oxoid&nbsp;</td><td>LP0012B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyclin</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vernetzer&nbsp;</td><td>Spektroline&nbsp;</td><td>11-992-89</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumpumpe/ -kolben</td><td>Fisherbrand</td><td></td><td></td>FB12566504</tr><tr><td>Wasserbad&nbsp;</td><td></td><td></td><td>muss in der Lage sein, 55° zu halten; C</td></tr><tr><td>YPD Brühe&nbsp;</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>Y1375&nbsp;</td><td>Kann vorgefertigt oder mit den Grundzutaten gekauft werden</td></tr></tbody></table>

entwicklung eines polymikrobiellen kolonie-biofilmmodells zur erprobung von antibiotika bei mukoviszidose

Development of a Polymicrobial Colony Biofilm Model to Test Antimicrobials in Cystic Fibrosis

Die Einfachheit des Fest-Luft-Grenzflächen-Biofilmmodells ermöglicht das Screening einer großen Anzahl von Antibiotika unter verschiedenen klinisch relevanten Bedingungen gleichzeitig. Dieses Modell ermöglicht die Bewertung der Wirksamkeit von Antibiotika anhand von KBE-Zahlen und metabolischen Assays sowohl in mono- als auch in polymikrobiellen Biofilmen, die innerhalb einer Woche durchgeführt werden können. Aufgrund der Beschaffenheit des Modells ermöglicht es auch eine einfache Manipulation der Umgebungsbedingungen, wie z. B. die Änderung der Medienzusammensetzung und das Platzieren der Biofilme unter sauerstoffreduzierten und anaeroben Bedingungen. Mit diesem Modell haben wir Veränderungen in der Toleranz gegenüber zwei häufig bei pwCF verwendeten Antibiotika zwischen P. aeruginosa gezeigt, die in Monospezies- und polymikrobiellen Biofilmen gezüchtet wurden (Abbildung 1). Darüber hinaus konnten wir feststellen, wie sich eine antimikrobielle Behandlung auf die Populationsdynamik innerhalb polymikrobieller Biofilme auswirken kann (Abbildung 2).
Zur Durchführung dieser Versuche wurde das erste Inokulum wie im obigen Protokoll spezifiziert vorbereitet, was zur Bildung stabiler Monospezies und polymikrobieller Biofilme mit reproduzierbarer KBE/ml und geringen Standardabweichungen führte, die durch ein- oder bidirektionale ANOVA bestimmt wurden. Dieses Modell unterstreicht auch das konsistente Wachstum und die KBE Rückgewinnung und ermöglicht die Möglichkeit, diese klassischen mikrobiologischen Techniken mit anderen Techniken zu kombinieren, die in dieser Studie nicht durchgeführt wurden, ohne dass eine ausgeklügelte Verarbeitung erforderlich ist. Dazu gehören Bildgebung wie Leben/Tot, Matrixvisualisierung und molekulare Analyse, die andere dreidimensionale Modelle in dieser Form nicht so zugänglich anbieten können (Abbildung 1)31. Es ist zu beachten, dass die erwartete Standardabweichung für KBE/ml zunimmt, wenn die Daten als Prozentsatz des Überlebens im Vergleich zu CFU/ml angezeigt werden (Abbildung 1). Beim Vergleich der Wirksamkeit der Antibiotikabehandlung zwischen Monospezies und polymikrobiellen Biofilmen ergab sich ein signifikanter Anstieg aller Antibiotikakonzentrationen, die erforderlich sind, um eine Abtötung von 50 % zu erreichen. Um dieses Abtötungsniveau für Meropenem und Tobramycin zu erreichen, war eine Erhöhung der Antibiotikakonzentration um 2 log erforderlich (Abbildung 1). Es gab auch eine allgemeine Verlängerung des Überlebens von P. aeruginosa in Gegenwart von S. aureus und C. albicans im polymikrobiellen Biofilm, wenn es mit 64 μg/ml Tobramycin behandelt wurde, während das Gegenteil für Meropenem der Fall war.
Die Methode zur Bestimmung der Stoffwechselaktivität misst die Gesamtaktivität des gesamten polymikrobiellen Biofilms, ohne den individuellen Beitrag jeder Spezies unterscheiden zu können. Aus diesem Grund werden nur metabolische Veränderungen von Monospezies gezeigt, um die Verwendung von Stoffwechselaktivitätsassays für dieses Modell zu demonstrieren. Bei Monospezies-Biofilmen gab es einen starken Zusammenhang zwischen dem Überleben von P. aeruginosa und der Stoffwechselaktivität sowohl für Meropenem als auch für Tobramycin (Abbildung 2). Die Verwendung sowohl der metabolischen Aktivität als auch der KBE-Zahl aus denselben Proben ermöglicht die einfache Identifizierung sowohl bakteriostatischer als auch bakterizider Wirkungen. Bei polymikrobiellen Biofilmen kann die Bestimmung der metabolischen Aktivität darauf hinweisen, wie das Targeting auf eine Spezies eine allgemeine Zunahme der metabolischen Aktivität des Biofilms induzieren und somit möglicherweise das mikrobielle Wachstum anderer Spezies erhöhen kann.
Obwohl KBE der Goldstandard für antimikrobielle Sensitivitätstests sind, ermöglichen sie in polymikrobiellen Biofilmen auch die Beurteilung der Spezieszusammensetzung innerhalb des Biofilms. Durch die Behandlung von P. aeruginosa in polymikrobiellen Biofilmen können wir nicht nur den erhöhten MBEC50-Spiegel für diesen Organismus nachweisen, sondern auch den Effekt auf die anderen co-isolierten Spezies nachweisen (Abbildung 3). Dies ist z. B. bei Meropenem (antipseudomonal) der Fall, bei dem die Reduktion von P. aeruginosa mit einer Zunahme von S. aureus und C. albicans KBE einhergeht, was dazu führt, dass S. aureus bei Exposition gegenüber bestimmten Antibiotikakonzentrationen zum am weitesten verbreiteten Organismus wird (Abbildung 3A). Dies unterstreicht, wie wichtig es ist, die polymikrobielle Natur des Biofilms zu berücksichtigen, da die Populationsgröße anderer krankheitserregender Spezies bei der Behandlung eines bestimmten Krankheitserregers zunehmen kann.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67213/67213fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Variation der antimikrobiellen Toleranz von P. aeruginosa gegenüber Meropenem und Tobramycin zwischen mono- und polymikrobiellen Biofilmen, die im Fest-Luft-Grenzflächenmodell gezüchtet wurden. P. aeruginosa PAO1, gezüchtet in mono- oder polymikrobiellen Biofilmen mit S. aureus und C. albicans , wurde unter Verwendung der Feststoff-Luft-Grenzflächenmodelle für 24 h auf SCFM2 ermittelt. Die Biofilme wurden mit einem Bereich von (A) Meropenem- oder (B) Tobramycin-Konzentrationen von 0,125 μg/ml bis 64 μg/ml zusammen mit einer Antibiotika-Kontrollen behandelt. Die KBE/ml jedes Biofilms wurde bestimmt. P. aeruginosa Die KBE wurden in PIA bestimmt und in das prozentuale Überleben umgerechnet, indem die Negativkontrolle als 100%-Überleben verwendet wurde. Fehlerbalken bezeichnen die Standardabweichung, und jeder Datenpunkt wird aus 3 biologischen Wiederholungen mit jeweils drei technischen Wiederholungen abgeleitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67213/67213fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67213/67213fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Variation der metabolischen Aktivität von P . aeruginosa-Biofilmen in Gegenwart von Meropenem oder Tobramycin, die im Fest-Luft-Grenzflächenmodell gezüchtet wurden. P. aeruginosa PAO1-Biofilme wurden auf SCFM2 im Fest-Luft-Grenzflächenmodell gezüchtet, und eine Reihe von (A) Meropenem- oder (B) Tobramycin-Konzentrationen von 0,125 μg/ml bis 64 μg/ml wurden zusammen mit einer Kontrolle ohne Antibiotika hinzugefügt. Die Platte wurde fluoreszierend bei einer Anregung von 540 nm und einer Emission von 590 nm alle 30 min abgelesen. Die prozentuale metabolische Aktivität wurde berechnet, indem der Prozentsatz dieser Aktivität bei jeder mit Antibiotika behandelten Probe im Vergleich zur Kontrolle ohne Antibiotika bestimmt wurde. Fehlerbalken bezeichnen die Standardabweichung, und jeder Datenpunkt wird aus 3 biologischen Wiederholungen mit jeweils drei technischen Wiederholungen abgeleitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67213/67213fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67213/67213fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Auswirkungen auf die Gesamt-KBE von P. aeruginosa, S. aureus und C. albicans , die nach einer antimikrobiellen Behandlung aus dem polymikrobiellen Fest-Luft-Grenzflächenmodell gewonnen wurden. S. aureus und C. albicans wurden auf SCFM2 auf dem Fest-Luft-Grenzflächenmodell gezüchtet. P. aeruginosa wurde hinzugefügt, und ein Bereich von 0,125 μg/ml bis 64 μg/ml-Konzentrationen von (A) Meropenem oder (B) Tobramycin wurden den Biofilmen zusammen mit einer nicht-antibiotischen Kontrolle zugesetzt. Die KBE/ml jedes Biofilms wurde bestimmt. Fehlerbalken bezeichnen die Standardabweichung, und jeder Datenpunkt wurde aus 3 biologischen Wiederholungen mit jeweils drei technischen Wiederholungen abgeleitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67213/67213fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Abbildung 1: Etablierung und Arbeitsablauf des Fest-Luft-Grenzflächenmodells. Grafische Darstellung der Etablierung des Fest-Luft-Grenzflächenmodells, der Biofilmzerstörung und der Ergebnisse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67213/Supplementary%20figure%201.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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