Entwicklung eines polymikrobiellen Kolonie-Biofilmmodells zur Erprobung von Antibiotika bei Mukoviszidose

Unsere Forschung konzentrierte sich auf die Verwendung komplexer polymikrobieller Modelle, um die komplexen Wechselwirkungen zwischen Mikroben in der Mukoviszidose-Umgebung zu verstehen und zu verstehen, wie dies zu einer erhöhten antimikrobiellen Toleranz führt. Wir hoffen, dieses Wissen nutzen zu können, um neuartige therapeutische Interventionen zu entwickeln. Die Fortschritte auf dem Gebiet der Biofilme werden durch Visualisierung in Verbindung mit Quantifizierungsmethoden und biophysikalischen Ansätzen vorangetrieben.

Dazu gehören Techniken wie 3D-OrbiSIMS, die eine räumliche Auflösung bis in den Mikro- und Nanobereich ermöglichen. Diese Forschung zielt darauf ab, ein polymikrobielles Modell zu schaffen, das ein Maß an Komplexität beibehält, das repräsentativ für das ist, was bei der Antibiotikabehandlung bei CF-Patienten zu beobachten ist. Es wird auch einen höheren Durchsatz, relevantere Ergebnisse und die Anpassungsfähigkeit an andere Stämme und Bedingungen ermöglichen.

Dieses Protokoll bietet eine relevante Testumgebung für CF-Erreger. Er ist robust und hat einen relativ hohen Durchsatz. Es ist auch für mehrere Endpunkte zugänglich, so dass komplexere Studien durchgeführt werden können.

Diese Forschung hat gezeigt, dass eine für Mukoviszidose relevante Umgebung die mikrobielle Anfälligkeit verändert. Darüber hinaus kann auch die Art der vorhandenen Pilze die Anfälligkeit für Pseudomonas aeruginosa verändern, was von erheblicher klinischer Relevanz sein kann. Nehmen Sie zunächst Kulturen von Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus und Candida albicans, die bis zur exponentiellen Phase gezüchtet wurden.

Übertragen Sie mit einer Mikropipette einen Milliliter jeder Flüssigkultur in ein separates steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen zwei Minuten lang bei 8.000 x g, um die Bakterien oder Pilze zu pelletieren. Danach saugen Sie mit einer Pipette den Überstand aus jedem Röhrchen ab und resuspendieren die Pellets in einem Milliliter PBS.

Verdünnen Sie die resuspendierten Zellen von Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus von eins bis 10 in PBS. Messen Sie dann mit einem Spektralphotometer die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 Nanometern. Nachdem Sie die gewaschenen Proben von Candida albicans um eins bis 100 in PBS verdünnt haben, pipettieren Sie 10 Mikroliter jeder Probe in zwei einzelne Kammern eines Hämozytometers.

Stellen Sie dann die Candida albicans-Probe auf 1 x 10 hoch acht KBE pro Milliliter in PBS ein. Um das Inokulum für die Zugabe zum Biofilm vorzubereiten, passen Sie das Inokulum von Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans und Staphylococcus aureus mit PBS an. Bei Monospezies-Biofilmen pipettieren Sie 10 Mikroliter der verdünnten Mikrobe auf die Mitte einer Polycarbonatscheibe, die auf dem SCFM2 1,5%-technischen Agar in 6-Well-Platten platziert wird.

Inkubieren Sie die Platte 24 Stunden lang statisch bei 37 Grad Celsius, bevor Sie sie behandeln oder aufbrechen. Für polymikrobielle Biofilme geben Sie jeweils 10 Mikroliter Staphylococcus aureus und Candida albicans übereinander auf dieselbe Polycarbonatscheibe. Inkubieren Sie die geimpfte Scheibe 24 Stunden lang statisch bei 37 Grad Celsius.

Nach der Inkubation mit einer sterilen Pinzette werden die Polycarbonatscheiben auf frische SCFM2 1,5 %-Agarplatten übertragen. Fügen Sie 10 Mikroliter des 1 x 10 hoch vier KBE pro Milliliter Verdünnung von Pseudomonas aeruginosa über den bereits etablierten Staphylococcus aureus, Candida albicans-Biofilm hinzu. Inkubieren Sie weitere 24 Stunden bei 37 Grad Celsius.

Nehmen Sie zunächst den Biofilm der Festluft-Grenzflächenkolonie von Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus und Candida albicans. Geben Sie Keramikperlen mit einem Durchmesser von 2,8 Millimetern auf die Platte und vernetzen Sie die Platte mit UV. Übertragen Sie mit einer flammsterilisierten Pinzette fünf Keramikkügelchen in ein steriles Homogenisatorröhrchen mit zwei Millilitern.

Pipettieren Sie einen Milliliter PBS in das zwei Milliliter Homogenisierungsröhrchen. Wirbeln Sie die Röhrchen mindestens 10 Sekunden lang vor oder bis der Biofilm von der Polycarbonatscheibe entfernt wurde, wie durch Sichtprüfung festgestellt. Nehmen Sie nach dem Entfernen die Polycarbonatscheibe heraus, legen Sie die Röhrchen mit den Kügelchen in den Homogenisator und schlagen Sie sie zweimal 10 Sekunden lang bei sechs Metern pro Sekunde mit einem Intervall von zehn Sekunden zwischen den Schlägen.

Gießen Sie nun den zerbrochenen Biofilm aus dem Homogenisatorröhrchen in ein Sieben-Milliliter-Bijou, das vier Milliliter PBS enthält, was zu einem endgültigen Volumen von fünf Millilitern führt. Die Homogenisatorröhrchen werden zwei Minuten lang bei 8.000 x g zentrifugiert. Übertragen Sie dann die restliche Flüssigkeit auf das Sieben-Milliliter-Bijou, um sicherzustellen, dass die gesamte Flüssigkeit übertragen wird.

Geben Sie 200 Mikroliter des aufgebrochenen Biofilms in eine schwarze 96-Well-Platte mit klarem Boden und pipettieren Sie dann 10 Mikroliter 0,02%ige Resazurinlösung in jede Vertiefung. Inkubieren Sie den mit Resazurin behandelten Biofilm in einem Plattenleser bei 37 Grad Celsius. Wenden Sie alle 30 Minuten für 10 Sekunden bei 200 U/min ein Orbitalschütteln an, bevor Sie Fluoreszenzmessungen vornehmen.

Messen Sie die Fluoreszenz mit einer Anregungswellenlänge von 540 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 590 Nanometern. Monospezies-Biofilme erforderten signifikant niedrigere Konzentrationen von Meropenem und Tobramycin, um eine Abtötung von 50 % zu erreichen, verglichen mit polymikrobiellen Biofilmen, wobei für letztere eine Erhöhung der Antibiotikakonzentration um zwei log erforderlich war. Das Überleben von Pseudomonas aeruginosa stieg in polymikrobiellen Biofilmen mit 64 Mikrogramm pro Milliliter Tobramycin, während Meropenem unter ähnlichen Bedingungen eine Abnahme des Überlebens zeigte.

In Monospezies-Biofilmen wurde eine starke Korrelation zwischen dem Überleben von Pseudomonas aeruginosa und seiner metabolischen Aktivität beobachtet, wenn es sowohl mit Meropenam als auch mit Tobramycin behandelt wurde.