Name: Mikrofluidik zur Beurteilung der Thrombozytenfunktion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Erfahren Sie, wie Mikrofluidik die Thrombozytenfunktion unter physiologischen Flussbedingungen bewertet. Diese Methode ermöglicht realistischere Assays für die Transfusionsmedizin und hämostatische Reanimation.

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Alle Untersuchungen wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien durchgeführt. Es wurde die Genehmigung des Human Research Protection Office der University of Pittsburgh eingeholt und die Einverständniserklärung gesunder menschlicher Freiwilliger eingeholt.
1. Vorbereitung des mikrofluidischen Geräts
<ol>
	<li>Um den PDMS-Teil des Geräts herzustellen, bereiten Sie eine Urform aus Messing durch CNC-Mikrobearbeitung (Computer Numerical Control) vor. HINWEIS: Abhängig von den Kanalabmessungen können Fotolithographietechniken verwendet werden, um eine Urform zu erstellen. Die in diesem Protokoll verwendete Vorrichtung umfasst acht parallele mikromaschinell bearbeitete Kanäle mit einer Breite von etwa 480 μm, einer Höhe von 140 μm am Einlass und Auslass der Vorrichtung und einer Höhe von 40 μm an der Stenose der Vorrichtung, mit einer Rampenlänge zum/vom stenotischen Bereich von etwa 0,3 mm. Die Kanallängen betragen ca. 6 mm.</li>
	<li>Gießen Sie mit einer erhaltenen Urform die Silikonelastomerbasis (aus dem Elastomer-Kit) in eine Wiegeschale. Fügen Sie das Silikonhärtungsmittel (aus dem Elastomer-Kit) hinzu, das die Vernetzung der Silikonpolymerketten erleichtert, um das flüssige PDMS in einen haltbaren und flexiblen Feststoff im Verhältnis 10:1 (Basismittel) umzuwandeln, und rühren Sie die Mischung gut um.</li>
	<li>Lege die Form in eine Petrischale und gieße das nicht ausgehärtete PDMS auf die Form. Stellen Sie die Petrischale für 30 Minuten in einen Vakuumexsikkator, um Blasen zu entfernen.</li>
	<li>Beenden Sie die Aushärtung des PDMS in der Urform, indem Sie es für 90 min in einen auf 70 °C eingestellten Ofen stellen.</li>
	<li>Schneiden Sie nach vollständiger PDMS-Aushärtung den mikrofluidischen Abdruck mit einer Rasierklinge oder einem Skalpell aus. Stanzen Sie Löcher an den Rändern der Kanäle (1,5 mm Durchmesser auf beiden Seiten).</li>
	<li>Reinigen Sie mit Laborklebeband die Oberfläche eines Objektträgers und die geätzte Seite des mikrofluidischen Abgusses. Verwenden Sie bei Bedarf Druckluft, um verbleibende Ablagerungen zu entfernen.</li>
	<li>Legen Sie den Objektträger und den mikrofluidischen Abguss mit der geätzten Seite nach oben in einen Plasmareiniger. Starten Sie die Vakuumpumpe, verschließen Sie die Kammer und schalten Sie den Plasmareiniger auf die hohe Stufe ein. Lassen Sie den Objektträger und das PDMS 30 s lang im Plasmareiniger, schalten Sie dann den Plasmareiniger aus und entfernen Sie den Staubsauger.</li>
	<li>Binden Sie den plasmagereinigten Guss und den Glasobjektträger zusammen, indem Sie die Seiten, die im Plasmareiniger nach oben lagen, vorsichtig zusammendrücken. Stellen Sie dann das mikrofluidische Gerät für 10 Minuten bei 70 °C in einen Ofen/eine Kochplatte. HINWEIS: Üben Sie nicht zu viel Druck aus, wenn Sie den Guss und den Glasobjektträger miteinander verbinden, da dies zu einem Verlust der Kanalmorphologie führen kann.</li>
	<li>Spülen Sie jede Kammer mit 10-30 μl 70%igem Ethanol, um es zu sterilisieren und das mikrofluidische Gerät auf einer 70 °C heißen Platte trocknen zu lassen. HINWEIS: Geräte sollten mindestens 24 Stunden im Voraus hergestellt werden, können aber auch Wochen bis Monate im Voraus hergestellt werden. Die Geräte sollten in einem luftdichten Behälter oder einer abgedeckten Petrischale bei Raumtemperatur gelagert werden.</li>
	<li>Spülen Sie am Tag vor dem Experimentieren mit dem mikrofluidischen Gerät jede Kammer erneut mit 10-30 μl 70%igem Ethanol, um es zu sterilisieren und das mikrofluidische Gerät auf einer 70 °C-Heizplatte trocknen zu lassen.</li>
	<li>Die Kammer wird mit einem Typ 1 Fibrillärkollagenreagenz (1 mg/ml) bestrichen, das in 0,9 % NaCl in einem volumetrischen Verhältnis von 1:5 durch einen dafür vorgesehenen Auslass zum vorgesehenen Einlass verdünnt wird. Stellen Sie sicher, dass die Richtungsabhängigkeit innerhalb eines Experiments beibehalten wird. Lagern Sie das Gerät in einem warmen, feuchten, geschlossenen Behälter, um eine Verdunstung des beschichteten Kollagens im Kanal zu verhindern.</li>
	<li>Nach 1 h mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) spülen, um die Kollagenlösung auszuspülen. Bündig in die entgegengesetzte Richtung der Beschichtung. Bewahren Sie das Gerät bei Nichtgebrauch wieder in einem warmen, feuchten, geschlossenen Behälter auf.</li>
</ol>
2. Vorbereitung der Blutprobe
<ol>
	<li>Entnehmen Sie eine Citrat-Vollblutprobe durch Venenpunktion. Inkubieren Sie citriertes Vollblut mit einer FC-Rezeptor-Blockierungslösung (1:600). HINWEIS: Blutproben werden vor und während des Experiments bei Raumtemperatur gelagert.</li>
	<li>Inkubieren Sie citriertes Vollblut mit fluoreszenzkonjugiertem (unter Verwendung eines Fluorophors Ihrer Wahl) CD41-Antikörper (1:600). 30 min lang auf eine Nutenwippe auftragen.</li>
	<li>Als Positivkontrolle für die Thrombozytenhemmung fügen Sie Ticagrelor hinzu, einen P2Y12-Rezeptorantagonisten, der in einer Lösung von 30 % w/v 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD) in PBS rekonstituiert wird. HINWEIS: Ticagrelor-Bestände bis zu 6,4 mM sollten hergestellt werden und eine weitere Verdünnung der Ticagrelor-Bestände in HP-β-CD-Lösung (30 % HP-β-CD gelöst in PBS) kann vor dem Versuch erfolgen (empfohlen werden 1.000-fache Stammkonzentrationen).</li>
	<li>Inkubieren Sie die citrierte Probe 30 Minuten lang mit Ticagrelor (Endkonzentration bis zu 6,4 μM), um die Thrombozytenhemmung zu beobachten.</li>
	<li>Wenn Sie das Blutprodukt mit der Citratprobe mischen, färben Sie das Blutprodukt mit einer FC-Rezeptorblockierungslösung (1:600) und einem fluoreszenzkonjugierten (unter Verwendung eines separaten und von der Citratprobe getrennten Fluorophors) CD41-Antikörpers (1:600).<ol>
		<li>Mischen Sie ein volumetrisches Äquivalent der transfundierten Produkteinheiten mit der Citratprobe. Um beispielsweise 2 Einheiten von Thrombozytenprodukten zu simulieren, die in eine blutende Person transfundiert werden (ca. 250 ml pro Produkt in einem Gesamtblutvolumen von 5.000 ml), mischen Sie 100 μl Blutprodukt in 1.000 μl Citratblutprobe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Unmittelbar vor dem Experimentieren filtrieren Sie die Blutprobe durch einen 40-μm-Filter in ein steriles 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
</ol>
3. Prüfung der Thrombozytenfunktion unter Durchfluss (Methode 1)
<ol>
	<li>Schalten Sie das Mikroskop und die zugehörige Software ein.</li>
	<li>Stellen Sie die Pumpe einer Entnahmespritze auf eine Höhe mit dem Tisch des Mikroskops ein. Passen Sie die Einstellungen an der Spritzenpumpe an.<ol>
		<li>Berechnen Sie einen volumetrischen Durchfluss (Q) für eine gewünschte durchschnittliche Wandscherrate (γ) von 3.500 s-1 im stenotischen Bereich des Kanals unter Verwendung der Gleichungen (1) und (2)21. 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67214/67214eq01.jpg" style="margin: auto;">(1) 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67214/67214eq02v2.jpg" style="margin: auto;">(2) Dabei ist A die Querschnittsfläche des Kanals, P der benetzte Umfang, λ der Formfaktor, b die kurze Seite des Rechtecks (Höhe) und a die lange Seite des Rechtecks (Breite). HINWEIS: Der Wert von 3.500 s-1 wurde aufgrund der kritischen VWF-Scherung gewählt und liegt im arteriellen Regime 7,22,23.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Platzieren Sie das mikrofluidische Gerät auf dem Mikroskoptisch. Kleben Sie die Kanten des mikrofluidischen Geräts an den Tisch, um Bewegungen zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass der Auslass zur Rückseite des Mikroskops zeigt.</li>
	<li>Verbinden Sie ein Ende des 1/16" ID-Schlauchs (ca. 30 cm lang) mit einem Winkelanschluss und das andere Ende mit einer 10 mL Spritze mit 1/16" ID Anschluss.</li>
	<li>Füllen Sie die Spritze mit sterilem PBS und schließen Sie sie an die Spritzenpumpe an.</li>
	<li>Stecken Sie den Winkelstecker in die Gerätesteckdose.</li>
	<li>Bereiten Sie ca. 10 cm lange Einlaufleitungen vor, mit dem Winkelverbinder an einem Ende und dem abgewinkelten Schnitt am anderen Ende.</li>
	<li>Verbinden Sie den Einlass-Winkelstecker mit dem Geräteeinlass.</li>
	<li>Positionieren Sie die Einlaufleitung in einem Abfall-Mikrozentrifugenröhrchen auf einem abgewinkelten Halter.</li>
	<li>Verwenden Sie das 10-fach-Objektiv für Kanalabmessungen mit einer Breite von ca. 500 μm und fokussieren Sie sich auf die Kanalkanten des mikrofluidischen Geräts.</li>
	<li>Grundieren Sie die Leitungen mit PBS und befreien Sie den Kanal von PDMS/Schmutz, indem Sie die Spritzenpumpe manuell vorschieben. Achten Sie darauf, in der Nähe des Kanaleinlasses und -auslasses zu prüfen.</li>
	<li>Öffnen Sie die gespeicherten Bildaufnahmeeinstellungen oder erstellen Sie ein Bildaufnahmeverfahren für Zeitreihenbilder, die alle 1–2 s mit einem Hellfeldkanal und Fluoreszenzkanälen aufgenommen werden, die den in der Blutprobe verwendeten fluoreszierenden CD41-Antikörpern entsprechen.</li>
	<li>Entnehmen Sie die gefilterte Citratblutprobe und mischen Sie sie, indem Sie sie kurz vor dem Experiment auf und ab pipettieren. Legen Sie die Probe auf den abgewinkelten Mikrozentrifugenhalter.</li>
	<li>Positionieren Sie die Einlassleitung in der Probe.</li>
	<li>Starten Sie die Aufnahme der Bildaufnahme.</li>
	<li>Ziehen Sie die Spritze langsam heraus, um das Totvolumen im Schlauch zu füllen. Sobald das Blut den Kanal erreicht, drücken Sie sofort auf Play an der Spritzenpumpe, um den Fluss mit der gewünschten Schergeschwindigkeit fortzusetzen.</li>
	<li>Passen Sie den Fokus bei Bedarf an.</li>
	<li>Führen Sie das Experiment so lange durch, bis die Blutplättchen den stenotischen Bereich des mikrofluidischen Geräts vollständig verschlossen haben oder bis zu einem experimentellen Endpunkt (d. h. 10 Minuten).</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass der Einlassschlauch für die Dauer des Experiments in die Blutprobe eingetaucht ist.</li>
	<li>Sobald das Experiment abgeschlossen ist, stoppen Sie die Bilderfassung und stoppen Sie die Spritzenpumpe. Speichern Sie die Bildaufnahme.</li>
	<li>Entfernen Sie den Einlasswinkelverbinder und entleeren Sie den Inhalt des Schlauchs in einen konischen Ablauf. Entleeren Sie den Inhalt der Spritze und der Auslassleitungen ebenfalls in den konischen Abfall.</li>
	<li>Ersetzen Sie die Einlass- und Auslassanschlüsse sowie die Schläuche bei Bedarf für nachfolgende Proben.</li>
</ol>
4. Prüfung der Thrombozytenfunktion im Fluss mit Proben mit geringem Volumen (unter 1 ml) (Methode 2)
<ol>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.1 bis 1.4 wie oben.</li>
	<li>Stanzen Sie an den Rändern der Kanäle einen Auslass mit einem Durchmesser von 1,5 mm und einen Einlass mit einem Durchmesser von 3 mm.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.6 bis 3.6 wie oben.</li>
	<li>Verwenden Sie das 10-fach-Objektiv für Kanalabmessungen mit einer Breite von ca. 500 μm und fokussieren Sie sich auf die Kanalkanten des mikrofluidischen Geräts.</li>
	<li>Befreien Sie den Kanal von PDMS/Schmutz, indem Sie die Spritzenpumpe manuell vorschieben und die Zugangsflüssigkeit mit einem Labortuch ableiten. Entfernen Sie alle Rückstände mit Laborklebeband auf der Oberseite des mikrofluidischen Geräts.</li>
	<li>Schieben Sie die Pumpe manuell vor, um den 3-mm-Einlassbehälter mit PBS zu füllen.</li>
	<li>Öffnen Sie die gespeicherten Bildaufnahmeeinstellungen oder erstellen Sie ein Bildaufnahmeverfahren für Zeitreihenbilder, die alle 1–2 s mit einem Hellfeldkanal und Fluoreszenzkanälen aufgenommen werden, die den in der Blutprobe verwendeten fluoreszierenden CD41-Antikörpern entsprechen.</li>
	<li>Starten Sie die Entnahme an der Spritzenpumpe (manuell oder mit eingestellter Drehzahl) und unterbrechen Sie die Entnahme an der Pumpe, sobald PBS in den Kanal vordringt und die Füllleitung im Behälter abnimmt.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssiges PBS mit einer Pipette aus dem Reservoir.</li>
	<li>Starten Sie die Bildaufnahme.</li>
	<li>Pipettieren Sie die Blutprobe in das Reservoir (ca. 40 μl) und starten Sie sofort die Entnahmespritze. Stellen Sie sicher, dass der Ablauf gestartet wird. HINWEIS: Wenn der Motor der Spritzenpumpe für die Entnahme in Schritt 4.8 nicht vorbereitet wurde, beginnt der Durchfluss nicht sofort und der Versuch sollte wiederholt werden.</li>
	<li>Füllen Sie das Blutreservoir für die Dauer des Experiments wieder auf und stellen Sie sicher, dass keine Lufteinschlüsse in den Kanal gelangen.</li>
	<li>Führen Sie das Experiment so lange durch, bis die Blutplättchen den stenotischen Bereich des mikrofluidischen Geräts vollständig verschlossen haben oder bis zu einem experimentellen Endpunkt (d. h. 10 Minuten).</li>
	<li>Sobald das Experiment abgeschlossen ist, stoppen Sie die Bildaufnahme und stoppen Sie die Spritzenpumpe. Speichern Sie die Bildaufnahme.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssiges Blut aus dem Reservoir durch Pipettieren. Entleeren Sie den Inhalt des Entnahmeschlauchs in ein konisches Abfallrohr.</li>
	<li>Ersetzen Sie die Anschlüsse und Schläuche bei Bedarf für nachfolgende Proben.</li>
</ol>
5. Dekontamination
<ol>
	<li>Befreien Sie die Ein- und Auslassleitungen von Blut, indem Sie es in eine 10%ige Bleichlösung spülen.</li>
	<li>Wenn alle Kanäle des mikrofluidischen Geräts verwendet wurden, entsorgen Sie das Gerät im Behälter für biogefährliche Abfälle von Sharps. HINWEIS: Alle biologischen Abfälle sollten ordnungsgemäß in biologisch gefährlichen Abfällen entsorgt werden.</li>
</ol>
6. Bildanalyse
<ol>
	<li>Exportieren Sie die Bilder aus kinetischen Experimenten mit Hilfe der Software, indem Sie auf Datei | Exportieren/Importieren | Exportieren.</li>
	<li>Wählen Sie die folgenden Parameter aus: Dateityp: Tagged Image File Format (TIFF); Kompression: LZW; Aktivieren Sie Originaldaten und Pixel verschieben. Deaktivieren Sie die Option Anzeigekurve und Kanalfarbe anwenden. Aktivieren Sie die Option Teilmenge definieren (Bereich, Rechteckbereich) und wählen Sie den Kanalbereich aus, bei dem die Breiten- und Höhenmessung zwischen den Bedingungen beibehalten wird. Exportieren Sie in den gewünschten Ordner und aktivieren Sie Ordner erstellen.</li>
	<li>Beachten Sie die folgenden experimentellen Werte in der Software: Starten Sie den Rahmen , wenn Blut in den Kanal eintritt; Bildrate (Info, Zeitreihe).</li>
	<li>Messen Sie die normierte mittlere Fluoreszenzintensität jedes Frames in einem Experiment unter Verwendung des Matlab-Codes, der als ergänzende Datei 1 bereitgestellt wird, und ändern Sie die folgenden Eingaben für jedes Experiment: Start-Frame/End-Frame basierend auf der Experimentlänge (stellen Sie sicher, dass die Experimentlänge zwischen den Bedingungen erhalten bleibt); Name des Experiments/Ordnername; Zuschneiden der Parameter X, Y, H und W. Führen Sie den Code einmal für den Thrombozyten-Fluoreszenzkanal des Empfängers und einmal für den Thrombozyten-Fluoreszenzkanal des Produkts aus. Melden Sie normalisierte MFI- (Spalte 2) und normalisierte AUC-Werte (normalisiert auf Start-Frame). Subtrahieren Sie den Wert für die Experimentlänge vom normalisierten AUC-Wert.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Plattform zur Beurteilung der Thrombozytenfunktion bei Trauma und Transfusion

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<li>Sorrells, M. G., Neeves, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+and+absorption+of+collagen+peptides+to+polydimethlysiloxane+and+its+influence+on+platelet+adhesion+flow+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Adsorption and absorption of collagen peptides to polydimethlysiloxane and its influence on platelet adhesion flow assays.</a> Micromachines. 11 (1), 62(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Ausrüstungen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer</td><td>Zeiss</td><td>491917-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Bel-Art Space Saver Vakuum-Exsikkatoren</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-594-15A</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Isotemp Digital Heizplattenrührer</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB30786161</td><td></td></tr><tr><td>Nutating Mixer</td><td>Fischer Scientific</td><td>88-861-043</td><td></td></tr><tr><td>OHAUS Scout Waage</td><td>Uline</td><td>H-5852</td><td></td></tr><tr><td>Ofen</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-103-0520</td><td></td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Harrick</td><td>PDC-32G (115V)</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpe (PHD ULTRA CP, I/W PROGRAMMIERBAR)</td><td>Harvard Apparat</td><td>883015</td><td></td></tr><tr><td>Zen 3.4</td><td>Zeiss</td><td>Blue Edition</td><td>Software</td></tr><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/16 inch ID - Winkelverbinder mit Widerhaken</td><td>Qosina</td><td>11691</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Spritze</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-955-459</td><td></td></tr><tr><td>2-Hydroxypropyl-&beta;-Cyclodextrin</td><td>Cayman Chemicals</td><td>16169</td><td>30% Gelöst in phosphatgepufferter Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>40-Mikron-Filter</td><td>Fischer Scientific</td><td></td><td></td>NC1469671</tr><tr><td>CD41 Antikörper</td><td>Novus Biologicals</td><td>&nbsp; NB100-2614</td><td>Verhältnis 1:600 in Vollblut</td></tr><tr><td>Chrono-Par Kollagen Reagenz</td><td>Chrono Log Corporation</td><td>385</td><td>1:5 Verhältnis in 0,9% Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>Elektronenmikroskopie Sciences Miltex Biopsie Stanze mit Kolben, 3,0 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0856599</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Snap-Cap Mikrozentrifuge SafeLock Röhrchen, 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>Essendant 121oz. Clorox Keimtötende Bleiche</td><td>Fischer Scientific</td><td>50371500</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-678-005</td><td>70%</td></tr><tr><td>Falcon Safety Dust Off DPSXLRCP Compressed</td><td>Gas Supra</td><td>1381978</td><td></td></tr><tr><td>Human TruStain</td><td>Biolegend</td><td>422302</td><td>Verhältnis 1:600 im Vollblut</td></tr><tr><td>LevGo smartSpatel Einweg-Polypropylen-Spatel</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-001-017</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Sicherheitsskalpell</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-718</td><td></td></tr><tr><td>Kochsalzlösung</td><td>Millipore</td><td>567442</td><td>0,90%</td></tr><tr><td>Sartorius Polystyrol Wägeschiffchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-735-744</td><td></td></tr><tr><td>Superslip Abdeckfolien - Superslip Nr. 1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-055</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Silikonelastomer Kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9285739</td><td>Polydimethylsiloxan (PDMS)</td></tr><tr><td>Ticagrelor</td><td>Cayman Chemicals</td><td>15425</td><td></td></tr><tr><td>Tygon PVC Klarsichtschlauch 1/16" ID, 1/8" OD, 50 ft Länge</td><td>McMaster-Carr</td><td>6516T11</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-bearbeitbar 360 Messing Stange</td><td>McMaster-Carr</td><td>8954K721</td><td>Für die Herstellung</td></tr> von <tr><td>Urformen Vacutainer</td><td>BD</td><td>363083</td><td></td></tr><tr><td>World Precision Instrument Wiederverwendbare Biopsie-Stanze, 1,5 mm</td><td>Fisher</td><td>Scientific NC1215626</td><td></td></tr></tbody></table>

mikrofluidik zur beurteilung der thrombozytenfunktion

Microfluidics in Assessing Platelet Function

Mikrofluidische Experimente, die auf diese Methode folgen, sollten eine thrombozytenreiche Thrombenbildung im Bereich der Stenose des Strömungskanals zeigen (Abbildung 1). Abbildung 1A zeigt repräsentative Ergebnisse, bei denen funktionelle Blutplättchen einen Thrombus im stenotischen Bereich des Kanals bildeten, um den Blutfluss durch den Kanal zu blockieren. Mittlere Fluoreszenzintensitätskurven (MFI) von kinetischen Bildern, die während der Dauer des Experiments aufgenommen wurden, veranschaulichen eine Verzögerungs-, Wachstums- und Plateauphase des Thrombozyteneinbaus in den wachsenden Thrombus (Abbildung 2A, C). Eine Erhöhung der Konzentrationen eines P2Y12-Antagonisten, Ticagrelor, verringert die Thrombozyten-MFI sowie die berechnete Fläche unter der Kurve (AUC) der MFI-Kurven (Abbildung 2B,D). Längere Inkubationszeiten sind erforderlich (30 min im Vergleich zu 5 min), um eine ausgeprägte Thrombozytendysfunktion zu beobachten, in Übereinstimmung mit einer ausgeprägteren Dosis-Wirkungs-Beziehung unter Verwendung der Vollblutimpedanzaggregometrie nach einer 30-minütigen Ticagrelor-Inkubation im Vergleich zu einer 5-minütigen Inkubation (Ergänzende Abbildung S1). Unter unterschiedlichen Fahrzeugbedingungen wurden ähnliche zeitabhängige Effekte der P2Y12-Hemmung im mikrofluidischen Modell beobachtet (Ergänzende Abbildung S2).
Die Visualisierung von zwei Thrombozytenpopulationen in der simulierten hämostatischen Wiederbelebungsmethode veranschaulicht den Einbau beider Thrombozytenpopulationen in den Thrombus (Abbildung 3A). Der Einbau beider Thrombozytenpopulationen in ihr entsprechendes Fluoreszenzsignal kann über die Dauer des Experiments über MFI-Messungen kinetisch quantifiziert werden (Abbildung 3B). Steilere Steigungen in der Wachstumsphase sowie erhöhte Endpunkt-MFI-Messungen zeigen eine erhöhte Thrombozytenfunktionalität und ein erhöhtes hämostatisches Potenzial, was sich in der Quantifizierung der Empfängerthrombozyten zeigt, wenn die Blutprobe mit Thrombozytendysfunktion über P2Y12-Hemmung induziert wurde und dann die Wiederbelebung durch Mischen von frischem autologen Vollblut in einem volumetrischen Verhältnis von 1:10 simuliert wurde, das mit einem ausgeprägten Thrombozytenfluorophor gefärbt wurde. Bei der autologen Vollblutmischung wurden mehr Blutplättchen aus dem simulierten transfundierten Produkt eingebaut als bei einem Apherese-Thrombozytenprodukt bei Raumtemperatur am 5. Lagertag, das einen minimalen Produkteinbau in den sich bildenden Thrombus zeigte. Das Mischen des Thrombozytenprodukts bei Raumtemperatur an Tag 5 zeigte im Vergleich zum Mischen mit frischem autologen Vollblut auch einen geringeren Thrombozyteneinbau des Empfängers (Abbildung 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67214/67214fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Darstellung der Thrombozytenfunktionsprüfung mittels Mikrofluidik. (A) Es wird ein schematischer mikrofluidischer Versuchsaufbau für die Thrombozytenfunktionsprüfung mit Blutproben mit geringem Volumen gezeigt, einschließlich einer Entnahmespritzenpumpe, die Blut durch eine stenotische Flusskammer zieht, was eine Bildaufnahme in Echtzeit ermöglicht. (B) Es wird eine Seitenansicht einer stenotischen Strömungskammer gezeigt, einschließlich einer kollagenbeschichteten Oberfläche, auf der Blutplättchen anhaften, aktivieren und aggregieren, was zu einem wachsenden Thrombus an der stenotischen Region führt. (C) Echtzeit-Bilderfassung einer Citratblutprobe unter Fluss in einem stenotischen mikrofluidischen Kanal (3.500 s-1) und eines wachsenden Thrombus, der sich über 300 s gebildet hat. Maßstabsleisten = 200 μm (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67214/67214fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Reduzierte Veränderungen der Thrombozyten-MFI-Faltung und Fläche unter der Kurve nach 30 min Inkubation mit dem P2Y12-Antagonisten Ticagrelor. (A) Die Inkubation mit dem P2Y12-Antagonisten für nur 5 min zeigt leicht verlängerte Verzögerungsphasen der MFI-Kurven und (B) eine leichte Abnahme der MFI-AUC. (C) Eine 30-minütige Inkubation mit dem P2Y12-Antagonisten führt zu verlängerten Verzögerungsphasen und reduzierten Endpunkt-MFI-Werten sowie (D) zu einer robusteren Dysfunktion, die über MFI AUC nachgewiesen wird. Einzelne Datenpunkte stellen biologische Replikate dar und es wird eine mittlere ± Standardabweichung angezeigt. Abkürzungen: MFI = mittlere Fluoreszenzintensität; AUC = Fläche unter der Kurve; HP-β-CD = 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67214/67214fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Mischen von Blutprodukten mit koagulopathischer P2Y12-Hemmung in der Empfängerprobe, die eine Thrombozytendysfunktion des Patienten simuliert, in der mikrofluidischen Kammer. (A) Apherese-Thrombozyteneinheit (Plasma, Lagertag 7) (CD41 in Cyan) gemischt im Verhältnis 1:10 mit Citratblut, das 30 min lang mit 0,8 μM Ticagrelor vorinkubiert wurde (CD41 in rot). (B) Repräsentative normierte mittlere Fluoreszenzintensitätskurven der Empfängerblutprobe, die entweder eine Apherese-Thrombozyteneinheit (Lagertag 5) oder autologes frisches Vollblut (Verhältnis 1:10) erhält, zusammen mit der Thrombozytenkinetik des Empfängers im Laufe der Zeit. Das Citratblut des Empfängers wurde 30 Minuten lang mit 0,8 μM Ticagrelor vorinkubiert, bevor es mit Blutprodukten gemischt wurde. (C) Repräsentatives Z-Stapel-Bild eines modifizierten Geräts, das mit einem Deckglas für die konfokale Mikroskopie verbunden ist. Das Apherese-Thrombozytenprodukt wurde mit einer thrombozytopenischen Blutprobe im volumetrischen Verhältnis von 1:5 (Produkt:Blut) zusätzlich zu einem von-Willebrand-Faktor-Antikörper (1:600) gemischt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Datei 1: Matlab-Code für die Bildanalyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/ImageReader_Jove_Supplemental.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung S1: Zeitabhängigkeit der P2Y12-Hemmung der Vollblutimpedanzaggremetrie mit Ticagrelor. Eine Inkubation von 30 Minuten führt zu einer ausgeprägteren Dosis-Wirkungs-Beziehung im Vergleich zu 5 Minuten. Vehikel- und Arzneimittellösungen wurden mit 0,1 % vol verwendet. Einzelne Datenpunkte stellen biologische Replikate dar und es wird eine mittlere ± Standardabweichung angezeigt. Abkürzungen: AUC = Fläche unter der Kurve; HP-β-CD = 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214_Supp%20Fig%201.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung S2: Zeitabhängige P2Y12-Hemmung mit Ticagrelor in einem mikrofluidischen Modell der Thrombozytenfunktion. Repräsentative MFI-Kurven und Flächenwerte unter der Kurve für technische Replikate eines einzelnen gesunden Spenders sind mit Ethanolvehikel (1 % v/v) dargestellt, das für die Löslichkeit des Arzneimittels verwendet wird. Abkürzungen: MFI = mittlere Fluoreszenzintensität; AUC = Fläche unter der Kurve. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214_Supp%20Fig%202.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Mikrofluidik zur Beurteilung der Thrombozytenfunktion

Microfluidics incorporate physiologically relevant substrates and flows that mimic the vasculature and are, therefore, a valuable tool for studying ...

microfluidics-in-assessing-platelet-function

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Die Plättchenadhäsion Kaskade erfolgt in Gegenwart von Scherströmung, ein Faktor, nicht entfielen in konventionellen (statischen) Well-Platte-Assays. Dieser Artikel berichtet über eine Thrombozyten-Aggregation-Assay unter Verwendung eines mikrofluidischen Well-Platte-Format auf physiologische Scherströmung Bedingungen zu emulieren.

Adhäsion und Aggregation unter Fluss mit Mikrofluidik-Flow-Cells

Die Thrombozytentransfusion und Hämostase wurde unter Verwendung von Blutrekonstitution und mikrofluidischen Flusskammern modelliert, um die Funktion von Blutbankplättchen zu untersuchen. Die Daten zeigen die Auswirkungen einer Thrombozytenspeicherung auf die Blutstillung in vitro.

Mikrofluidik-Strömungskammern Mit Rekonstituierte Blut Hämostaseologie und Transfusions Platelet zu Modell<em&gt; In Vitro</em

Dieses Dokument beschreibt ein experimentelles Modell der Hämostase, die Thrombozytenfunktion und Koagulation gleichzeitig misst. Blutplättchen- und Fibrin- Fluoreszenz wird in Echtzeit gemessen und die Plättchenadhäsion Rate, Gerinnungsrate und Einsetzen der Gerinnung bestimmt. Das Modell wird verwendet, um die Thrombozyten Prokoagulanz-Eigenschaften unter Strömung in Konzentraten für Transfusions bestimmen.

Ein Mikrofluidik-Flow-Kammer-Modell für Platelet Transfusions und Hämostase Maßnahmen Platelet Deposition und Fibrinbildung in Echtzeit

Wir beschreiben eine einfache Methode zur Isolierung von gewaschenen Thrombozyten aus menschlichem Blut, gefolgt von Agonisten induzierte Thrombozytenaggregation Messungen durch Turbidimetrie. Als Beispiel verwenden wir diese Methode zur Untersuchung der Aggregationsreaktion von menschlichen Blutplättchen an Kollagen nach einer Vorinkubation mit dem Pannexin1 Kanalinhibitor Brilliant Blue FCF.

Turbidimetrie Menschen Gewaschene Thrombozyten: Die Wirkung des Pannexin1-Inhibitor Brilliant Blue FCF auf Collagen-induzierte Aggregation

Diese Arbeit beschreibt eine Fluoreszenzmikroskopie-basierte Methode für die Untersuchung von Thrombozytenadhäsion, -ausbreitung und -sekretion unter Strömung. Diese vielseitige Plattform ermöglicht die Untersuchung der Thrombozytenfunktion für die mechanistische Forschung auf Thrombose und Hämostase.

Live-Zelle Bildgebung von Platelet Degranulation und Sekretion unter Flow

Wir präsentieren ein In-vitro-Modell für Gefäßerkrankungen, um Vollblut-Wechselwirkungen mit patientenabgeleitetem Endothel zu untersuchen. Dieses System ermöglicht die Untersuchung der thrombogenen Eigenschaften der primären Endothelzellen unter verschiedenen Umständen. Das Verfahren eignet sich besonders zur Beurteilung der Thrombogenität und Antikoagulationstherapie in verschiedenen Phasen der Gerinnung.

In Vitro Mikrofluidic Disease Model zur Untersuchung von Blut-Endothel-Wechselwirkungen und Blutgerinnsungsdynamik in Echtzeit

Hier wird ein Protokoll für einen neuartigen dynamischen Multiparameter-Thrombozyten-Funktionsassay unter Verwendung eines kapazitiven Biosensors vorgestellt. Dieser Ansatz, der in einer halbstarren Mikroumgebung entwickelt wurde, um die physiologische Relevanz zu erhöhen, bietet drei Ausgangsparameter, die für die Thrombozytenzahl, die Stimulationsstärke und die Aktivierungswege empfindlich sind.

Dynamische Multiparameter-Bewertung der Thrombozytenfunktion mit einem kapazitiven Biosensor

Die Bildung von prokoagulanzien Blutplättchen wurde mit einem erhöhten Thromboserisiko korreliert. Hier wird ein präzises Protokoll zur Isolierung von gewaschenen Blutplättchen aus menschlichem Blut vorgestellt, das dazu bestimmt ist, die Exposition von Phosphatidylserin und Mikrovesikelfreisetzung zu quantifizieren, die charakteristische Merkmale von Prokoagulanzienthrombozyten sind.

Charakterisierung von Prokoagulanzien-Thrombozyten durch Messung der Phosphatidylserin-Exposition und der Mikrovesikelfreisetzung aus humanen gereinigten Blutplättchen

Diese Arbeit beschreibt einen mikrofluidischen Assay, der Scherspannung nutzt, um die Thrombusbildung im Blut auszulösen, und charakterisiert den Thrombus anhand mehrerer Auswertungsdimensionen. Der Test kann die prothrombotische Tendenz von Blutproben messen und ist daher nützlich für die Krankheitsdiagnose, Arzneimittelentwicklung sowie grundlegende mechanistische Studien im Zusammenhang mit Thrombose.

Thrombusprofiling-Assay: Eine auf Mikrofluidik basierende Plattform zur umfassenden Charakterisierung biomechanischer Thrombogenese

Eine nicht-invasive Verfahren zur Endothelfunktion beurteilen wird mit Hilfe des Endo-PAT 2000.

Die Beurteilung Endothelial Vasodilator-Funktion mit der Endo-PAT 2000

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Mikrofluidik zur Beurteilung der Thrombozytenfunktion

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