Name: Bestimmung der Serumstabilität des humanen Adenosin-Desaminase-1-Enzyms (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:25:00.000+00:00
Duration: 4 min 17 s
Description: Erfahren Sie Methoden zur Bestimmung der Serumstabilität von Enzymen für die Proteinbiologie und Krebstherapie. Diese Technik hilft Forschern, die pharmakokinetischen Profile von Proteinbiologika zu optimieren.

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1. Inkubation im Serum
<ol><li>Bereiten Sie eine 10-fache Brühe HsADA1 in 1x PBS pH 7,4 (1x PBS) in einer Endkonzentration von 10 μM vor. Tauen Sie ein 15-ml-Aliquot des gepoolten Humanserums auf und erwärmen Sie es auf 37 °C. Erwärmen Sie ein 50 mL aliquot von 1x PBS auf 37 °C.</li>
	<li>Bereiten Sie die Enzym-Serum-Inkubationsgemische vor, indem Sie 100 μl des 10x HsADA1-Stammes zu 900 μl gepooltem Humanserum in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung hinzufügen, das als Enzym + Serum-Mischung bezeichnet wird. Geben Sie in einem separaten Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung 100 μl des 10x HsADA1-Stammes zu 900 μl 1x PBS zum Vergleich mit einer Nicht-Serumkontrolle, die als Enzym + 1x PBS-Mischung bezeichnet wird. Die Endkonzentration von HsADA1 in jedem Gemisch beträgt 1 μM.</li>
	<li>Bereiten Sie eine zusätzliche Kontrolle in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung vor, das aus 100 μl 1x PBS gemischt mit 900 μl gepooltem humanem Serum besteht. Dies dient als Nicht-Enzym-Kontrolle für die Enzym + Serum-Mischung. Machen Sie zusätzlich eine Kontrolle, die aus 1 mL 1x PBS besteht. Dies dient als Nicht-Enzym-Kontrolle für das Enzym + 1x PBS-Gemisch.</li>
	<li>Aliquotieren Sie 100 μl jedes Gemisches aus Schritt 1.2 in separate Röhrchen mit geringer Bindung und verdünnen Sie es 1:1 mit 100 μl 30 % (v/v) Glycerin in 1x PBS. Mit flüssigem Stickstoff schockgefrieren und bei -80 °C lagern. Diese Proben sind der Zeitpunkt von Tag 0, und die Konzentration von HsADA1 in ihnen beträgt 500 nM. Dieser Schritt wird für die Nicht-Enzym-Kontrollmischungen aus Nummer 1.3 wiederholt. Verschließen Sie alle Enzyme und Kontrollgemische mit einer transparenten Folie und geben Sie sie in einen 37 °C heißen Inkubator.</li>
	<li>Nach 24 h aliquotieren Sie 100 μl jeder inkubierten Probe und verdünnen sie 1:1 mit 100 μl 30 % (v/v) Glycerin in 1x PBS. Mit flüssigem Stickstoff schockgefrieren und bei -80 °C lagern. Bei diesen Beispielen handelt es sich um den Zeitpunkt von Tag 1. Alle Enzym- und Kontrollgemische wieder in den 37 °C-Inkubator geben. Wiederholen Sie diesen Schritt bei 72 h und 120 h. HINWEIS: Aliquotierte Proben müssen nicht unbedingt schockgefroren werden. Alternativ kann der Benutzer den Mikrotiterplatten-basierten Assay unmittelbar nach der Entnahme jeder Probe durchführen, obwohl jedes Mal, wenn eine Probe getestet wird, frische Standardkurven und Adenosin-Substratbestände vorbereitet werden sollten.</li>
</ol>2. Mikrotiterplatten-basierter Assay
<ol><li>Bereiten Sie den Mikroplatten-Reader vor, indem Sie ein kinetisches Leseprotokoll einrichten (Abbildung 2), um die Absorption bei 260 nm mit dem kürzesten Leseintervall für 30 Minuten zu messen und den Reader auf einen Sollwert von 37 °C vorzuheizen.</li>
	<li>Tauen Sie alle gesammelten Proben auf Eis auf. Jede aufgetaute Probe wird 1:10 mit 1x PBS verdünnt, das auf 37 °C als Verdünnungsmittel in Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung vorgewärmt wird. Die neue HsADA1-Konzentration in diesen Proben wird 50 nM betragen.</li>
	<li>Führen Sie eine 10-fache Verdünnung in 1x PBS auch aus der Nicht-Enzym-Serum-Kontrollprobe durch. Bereiten Sie zusätzlich eine 5 mM Adenosin-Brühe vor, indem Sie 66,8 mg Adenosin zu 50 mL 1x PBS hinzufügen. Bereiten Sie eine 250 μM Verdünnung von Adenosin vor, indem Sie 400 μl des Adenosinstocks zu 7.600 μl 1x PBS hinzufügen und in einem Inkubator auf 37 °C vorwärmen.</li>
	<li>Zu einer UV-kompatiblen 96-Well-Mikroplatte fügen Sie 160 μl der 250 μM Adenosinverdünnung und 40 μl jeder verdünnten Proteinprobe in dreifacher Ausfertigung hinzu, um ein Gesamtvolumen von 200 μl zu erhalten. Dies ergibt eine endgültige Adenosinkonzentration von 200 μM und eine endgültige Enzymkonzentration von 10 nM.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Verdünnung für die Kontrollproben, indem Sie 40 μl des verdünnten Serums oder 1x PBS-Kontrollen und 160 μl der 250 μM Adenosinverdünnung in dreifacher Ausfertigung hinzufügen. Dies ergibt auch eine endgültige Adenosinkonzentration von 200 μM, jedoch ohne Enzym. HINWEIS: Es kann von Vorteil sein, zuerst alle verdünnten Enzym- und Kontrollproben einzeln in die Mikroplatte zu geben und dann das Adenosinsubstrat mit einer 12-Kanal-Mikropipette hinzuzufügen, um die Gesamtladezeit zu verkürzen. Zusätzlich müssen in diesem Schritt UV-transparente Platten verwendet werden, um zu verhindern, dass die Platte selbst das gemessene Absorptionssignal verfälscht.</li>
	<li>Messen Sie die Extinktion jeder Vertiefung bei 260 nm für 30 min bei 37 °C. Sobald dies erledigt ist, exportieren Sie die Daten zur weiteren Analyse in eine Tabelle.</li>
</ol>3. Analyse der Daten von Mikroplatten-Readern
<ol><li>Bestimmen Sie die Steigung des linearen Bereichs der Absorptionsdaten als Funktion der Zeit für die ersten Minuten der Mikroplattendaten. Bei den serumverdünnten Proben entsprach dies den ersten ~120 s. Bei den 1x PBS-verdünnten Proben entsprach dies den ersten ~270 s. Diese Steigung der degressiven Absorptionswerte hat einen negativen numerischen Wert und hat Einheiten für die Änderung der Absorptionseinheiten pro Sekunde (ΔA260/s).</li>
	<li>Subtrahieren Sie die Steigung der Negativkontrolle, die aus gepooltem Humanserum besteht, von der Steigung der Enzym + Serumdaten. Führen Sie den gleichen Vorgang mit den Enzym + 1x PBS-Mischungen durch, indem Sie die Steigung der 1x PBS-Kontrolle subtrahieren.</li>
	<li>Normalisieren Sie alle angepassten Steigungen auf die ursprüngliche Steigung bei t=0 h, um den Anteil der verbleibenden Aktivität unter Verwendung von Gleichung 1 zu erhalten. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67216/67216eq01.jpg" style="margin: auto;">Gleichung 1</li>
	<li>Plotten Sie den Anteil der verbleibenden Aktivität über die Zeit.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Bewertung der Serumstabilität von HsADA1: Ein Mikroplatten-basierter Ansatz

<ol><li>Valero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum-stable+RNA+aptamer+specific+for+SARS-COV-2+neutralizes+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A serum-stable RNA aptamer specific for SARS-COV-2 neutralizes viral entry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (50), e2112942118(2021).</li>
<li>Iannuzo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+identifies+synthetic+peptides+with+antibacterial+activity+against+mycobacterium+abscessus+and+serum+stability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening identifies synthetic peptides with antibacterial activity against mycobacterium abscessus and serum stability.</a> ACS Omega. 7 (27), 23967-23977 (2022).</li>
<li>Ma, M. T., Jennings, M. R., Blazeck, J., Lieberman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytically+active+holo+homo+sapiens+adenosine+deaminase+i+adopts+a+closed+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallograph+Sect+D%22%5BJournal%5D)">Catalytically active holo homo sapiens adenosine deaminase i adopts a closed conformation.</a> Acta Crystallograph Sect D. 78 (1), 91-103 (2022).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+4+nucleosides+via+one+reference+compound+in+chinese+cordyceps+by+hplc-uv+at+equal+absorption+wavelength%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Prod+Comm%22%5BJournal%5D)">Determination of 4 nucleosides via one reference compound in chinese cordyceps by hplc-uv at equal absorption wavelength.</a> Natural Prod Comm. 18 (3), 1934578X231161410(2023).</li>
<li>Whitmore, K. V., Gaspar, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+deaminase+deficiency+-+more+than+just+an+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adenosine deaminase deficiency - more than just an immunodeficiency.</a> Front Immunol. 7, 314(2016).</li>
<li>Jennings, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+expression+and+purification+of+a+human+adenosine+deaminase+in+E.+coli+and+characterization+of+its+asp8asn+variant%5BTitle%5D)+AND+%22Prot+Express+Purificat%22%5BJournal%5D)">Optimized expression and purification of a human adenosine deaminase in E. coli and characterization of its asp8asn variant.</a> Prot Express Purificat. 213, 106362(2024).</li>
<li>Blazeck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bypassing+evolutionary+dead+ends+and+switching+the+rate-limiting+step+of+a+human+immunotherapeutic+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Catalysis%22%5BJournal%5D)">Bypassing evolutionary dead ends and switching the rate-limiting step of a human immunotherapeutic enzyme.</a> Nat Catalysis. 5 (10), 952-967 (2022).</li>
<li>Lu, J., Grenache, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rapid%2C+microplate-based+kinetic+assay+for+measuring+adenosine+deaminase+activity+in+body+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of a rapid, microplate-based kinetic assay for measuring adenosine deaminase activity in body fluids.</a> Clinica Chimica Acta. 413 (19), 1637-1640 (2012).</li>
<li>Maciel, L. G., Dos Anjos, J. V., Soares, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+low-cost+evaluation+of+hydroxykynurenine+activity%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Fast and low-cost evaluation of hydroxykynurenine activity.</a> MethodsX. 7, 100982(2020).</li>
<li>Bokman, A. H., Schweigert, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-hydroxyanthranilic+acid+metabolism.+Iv.+Spectrophotometric+evidence+for+the+formation+of+an+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">3-hydroxyanthranilic acid metabolism. Iv. Spectrophotometric evidence for the formation of an intermediate.</a> Arch Biochem Biophys. 33 (2), 270-276 (1951).</li>
<li>Tanford, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanford%2C+C+%22Advances+in+protein+chemistry%22">Advances in protein chemistry</a>. 23, Academic Press. 121-282 (1968).</li>
<li>Tritsch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validity+of+the+continuous+spectrophotometric+assay+of+kalckar+for+adenosine+deaminase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Validity of the continuous spectrophotometric assay of kalckar for adenosine deaminase activity.</a> Anal Biochem. 129 (1), 207-209 (1983).</li>
<li>Gracia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+catalytic+site+structural+gate+of+adenosine+deaminase+allosterically+modulates+ligand+binding+to+adenosine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The catalytic site structural gate of adenosine deaminase allosterically modulates ligand binding to adenosine receptors.</a> FASEB J. 27 (3), 1048-1061 (2013).</li>
<li>Kalckar, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+spectrophotometry+of+purine+compounds+by+means+of+specific+enzymes%3A+Iii.+Studies+of+the+enzymes+of+purine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential spectrophotometry of purine compounds by means of specific enzymes: Iii. Studies of the enzymes of purine metabolism.</a> J Bio Chem. 167 (2), 461-475 (1947).</li>
<li>Hartwick, R., Jeffries, A., Krstulovic, A., Brown, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+assay+for+adenosine+deaminase+using+reverse+phase+high+pressure+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatographic+Sci%22%5BJournal%5D)">An optimized assay for adenosine deaminase using reverse phase high pressure liquid chromatography.</a> J Chromatographic Sci. 16 (9), 427-435 (1978).</li>
<li>Paul, M. K., Grover, V., Mukhopadhyay, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merits+of+hplc-based+method+over+spectrophotometric+method+for+assessing+the+kinetics+and+inhibition+of+mammalian+adenosine+deaminase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Merits of hplc-based method over spectrophotometric method for assessing the kinetics and inhibition of mammalian adenosine deaminase.</a> J Chromatography B. 822 (1), 146-153 (2005).</li>
<li>Ubbink, J. B., Vermaak, W. J. H., Bissbort, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+liquid+chromatographic+assay+of+human+lymphocyte+kynureninase+activity+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatography+B%3A+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">High-performance liquid chromatographic assay of human lymphocyte kynureninase activity levels.</a> J Chromatography B: Biomed Sci Appl. 566 (2), 369-375 (1991).</li>
<li>Tsentalovich, Y. P., Snytnikova, O. A., Forbes, M. D. E., Chernyak, E. I., Morozov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemical+and+thermal+reactivity+of+kynurenine%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Photochemical and thermal reactivity of kynurenine.</a> Exp Eye Res. 83 (6), 1439-1445 (2006).</li>
<li>Demain, A. L., Vaishnav, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+proteins+by+microbes+and+higher+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms.</a> Biotechnol Adv. 27 (3), 297-306 (2009).</li>
<li>Gräslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Faber, M. S., Whitehead, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data-driven+engineering+of+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Data-driven engineering of protein therapeutics.</a> Curr Opin Biotechnol. 60, 104-110 (2019).</li>
<li>Das, S., Zhao, L., Elofson, K., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+stabilization+by+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme stabilization by virus-like particles.</a> Biochemistry. 59 (31), 2870-2881 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Adenosin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9251-25G</td><td>25 g</td></tr><tr><td>BioTek Synergy HT Microplate Reader</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind Mikrozentrifugenröhrchen: Protein&nbsp;</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>13-698-795</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>G33-4</td><td>4 L</td></tr><tr><td>HsKYNase66-W102H-T333N</td><td>Inhouse-Humanserum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, gepoolt</td><td>MP Biomedicals</td><td>92931149</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Hydroxy-Kynurenin</td><td>Cayman Chemicals</td><td>27778</td><td></td></tr><tr><td>Inosin&nbsp;</td><td>TCI</td><td>I0037</td><td>25 g</td></tr><tr><td>PBS, 1x&nbsp; pH 7,4+/- 0,1</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxal 5-phosphat Monohydrat, 99%&nbsp;</td><td>Thermo Scientifc</td><td>228170010</td><td>1 g</td></tr><tr><td>UV-STAR MICROPLATE, 96 WELL, COC, F-BOTTOM</td><td>Greiner Bio</td><td>&nbsp; </td><td></td>655801</tr><tr><td>Wildtyp Humane Adenosin-Desaminase 1</td><td>Inhouse</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bestimmung der serumstabilität des humanen adenosin-desaminase-1-enzyms

Determining the Serum Stability of Human Adenosine Deaminase 1 Enzyme

Die Abbildungen zeigen die Ergebnisse des Assay-Laufs, der mit Wildtyp-HsADA1 durchgeführt wurde. Abbildung 3A,B zeigt die Absorptionsabfallkurven bei 260 nm der Proben, die aus den 1x PBS/Serum-Enzym-Gemischen für Wildtyp HsADA1 nach Zugabe von Adenosin stammen. Diese abnehmende Absorption in Abhängigkeit von den Zeitdaten ist das, was der Benutzer nach erfolgreichem Abschluss des Mikroplatten-basierten Assays erwarten kann und ähnelt den Absorptionsdaten, die nach Zugabe ausreichender Mengen an funktionellem HsADA1 zu Adenosin anfallen würden. Abbildung 3C,D zeigt die Absorptionskurven der getesteten Negativkontrollen, die nach Adenosinzugabe kein Enzym enthalten. Im Vergleich zu den eigentlichen Enzymproben ist die Absorptionsänderung dieser Negativkontrollen nahezu vernachlässigbar. Aus Abbildung 3 ist ersichtlich, dass sich die Steigungen der Enzymkurven in Abhängigkeit von der Inkubationszeit ändern. Beispielsweise ist die Steigung des Zeitpunkts Tag 0 drastisch steiler als die des Zeitpunkts Tag 5.
Abbildung 4 zeigt den Anteil der Aktivität, der von Wildtyp-HsADA1 als Funktion der Zeit beibehalten wird, wenn es entweder in 1x PBS oder gepooltem humanem Serum bei 37 °C inkubiert wird. Insbesondere werden die Steigungen aller Absorptionsabfallkurven in Abbildung 3A,B auf die Tag-0-Steigungen aus ihren jeweiligen Gruppen normiert. Wie in Abbildung 4 zu sehen ist, gibt es eine Divergenz in der Aktivität, die für Wildtyp-HsADA1 in 1x PBS im Vergleich zu gepooltem humanem Serum erhalten bleibt. Insbesondere verliert das Enzym seine Aktivität in gepooltem menschlichem Serum schneller, wobei das Enzym an Tag 5 etwa 10 % seiner ursprünglichen Aktivität beibehält. Ein Aktivitätsverlust ist immer noch nachweisbar, wenn HsADA1 in 1x PBS inkubiert wird, obwohl das Enzym etwa 75% seiner Aktivität behält. Dies stimmt mit den Ergebnissen von Jennings et al. überein, die ebenfalls über eine Abnahme der Aktivität nach der Inkubation mit Serum bei 37 °C um fast 40% nach 48 hberichten 6. Lu et al. haben auch gezeigt, dass die HsADA1-Aktivität in pleuralen, peritonealen und zerebrospinalen Körperflüssigkeiten bei Umgebungstemperatur (25 °C) abnimmt8.
Um die Flexibilität dieses Protokolls zu demonstrieren, haben wir es verwendet, um die Serumstabilität eines anderen Enzyms menschlichen Ursprungs zu testen, einer gentechnisch veränderten humanen Kynureninase-Variante, die zuvor als HsKYNase66-W102H-T333N7 bezeichnet wurde. HsKYNase66_W102H-T333N katalysiert effizient die Umwandlung von OH-Kyn in OH-AA, ähnlich wie das Wildtyp-Enzym HsKYNase, obwohl es sich tatsächlich um eine Zwei-Aminosäure-Reversionsmutante einer manipulierten humanen Kynureninase-Variante mit veränderter Substratspezifität handelt, d. h. die Kynurenin effizient in Anthranilsäure abbaut7. OH-Kyn absorbiert bei 379 nm stark, während OH-AA dies nicht tut, was zu einem messbaren Rückgang der Absorption führt, wenn unsere technisch hergestellte HsKYNase-Variante zu OH-kyn 9,10 hinzugefügt wird. Abbildung 5A,B zeigt die Absorptionsabfallkurven bei 379 nm der Proben, die aus den 1x PBS/Serum-Enzym-Gemischen für HsKYNase nach Zugabe von OH-Kyn stammen. Abbildung 5C,D zeigt die Absorptionskurven der getesteten Kontrollen, die keine Enzyme enthalten. Wie bei HsADA1 zu sehen ist, gibt es einen deutlichen Unterschied in den Steigungen der Absorptionskurven zwischen den Proben. Dies wird besonders in Abbildung 5A deutlich, da die Steigung des Zeitpunkts von 0 h viel steiler ist als die Zeitpunkte von 3 h und 24 h. Abbildung 6 zeigt den entsprechenden Anteil der Aktivität, der für die getestete HsKYNase als Funktion der Zeit erhalten bleibt. Wie HsADA1 verliert auch HsKYNase66-W102H-T333N im Serum schneller an Aktivität als im PBS (~85% Aktivitätsverlust gegenüber ~40% im Verlauf von 24 Stunden). Obwohl die Serumstabilität dieser Enzymvariante bisher nicht getestet wurde, folgt sie dem allgemeinen Trend wie andere HsKYNase-Varianten, die im Serum bei 37 °C ebenfalls innerhalb von 24 Stunden den größten Teil ihrer Aktivität verloren7. 
Im Allgemeinen können Enzyme im Laufe der Zeit aufgrund einer Vielzahl von Faktoren wie pH-Wert, Salzkonzentration, Temperatur und mehr an Aktivität verlieren11. Daher könnte ein Ergebnis, das diesem Trend nicht folgt, als abnormal angesehen werden. Wenn beispielsweise die enzymatische Aktivität im Laufe der Zeit drastisch zunimmt, könnte dies darauf hindeuten, dass die Ergebnisse ungültig sind. Dies setzt voraus, dass die Bedingungen der Enzyme nicht verändert werden, und wir sprechen streng genommen in einem zeitlichen Sinne.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig01.jpg"> Abbildung 1: Flussdiagramm, in dem die Schritte des Protokolls für HsADA1 aufgeführt sind. Die Abbildung zeigt die Schritte, die in diesem Protokoll ausgeführt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig02.jpg"> Abbildung 2: Einstellungen für den kinetischen Lesevorgang des Mikroplatten-Readers. Es wurde ein kinetisches Leseprotokoll erstellt, um die Absorption bei 260 nm für 30 min bei 37 °C mit dem minimalen Intervall zu messen. Die Abbildung zeigt die gewählten Einstellungen zum Einrichten dieses Protokolls. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig03.jpg"> Abbildung 3: Absorptions-Zeit-Kurven für HsADA1 nach Zugabe von 200 μM Adenosin. (A) Absorptions-Zeit-Kurven für seruminkubiertes HsADA1 nach Zugabe von 200 μM Adenosin. (B) 1x PBS-inkubiertes HsADA1. (C) Serum-Negativkontrolle. (D) 1x PBS-Negativkontrolle (n =3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig04.jpg"> Abbildung 4: Beibehaltung der HsADA1-Aktivität. Die Aktivität wird in 1x PBS im Vergleich zu gepooltem Humanserum bei 37 °C bewertet. Es wurde der Anteil der ursprünglichen Aktivität bestimmt, der für HsADA1, inkubiert in 1x PBS, im Vergleich zu gepooltem Humanserum über einen Zeitraum von 5 Tagen beibehalten wurde (Balken = mittlere ± SD, n=3). Ein zweiseitiger ungepaarter t-Test wurde mit *p&lt;0,05, **p &lt; 0,01 und ***p &lt; 0,001 verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig05.jpg"> Abbildung 5: Absorptions-Zeit-Kurven für HsKYNase66-W102H-T333N nach Zugabe von 400 μM OH-Kyn. (A) Absorptions-Zeit-Kurven für serum-inkubierte HsKYNase nach Zugabe von 400 μM OH-Kyn. (B) 1x PBS-inkubierte HsKYNase. (C) Serum-Negativkontrolle. (D) 1x PBS-Negativkontrolle (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig06.jpg"> Abbildung 6: Beibehaltung der HsKYNase66-W102H-T333N-Aktivität. Die Aktivität wird in 1x PBS im Vergleich zu gepooltem Humanserum bei 37 °C bewertet. Es wurde der Anteil der ursprünglichen Aktivität bestimmt, der für HsKYNase66-W102H-T333N, inkubiert in 1x PBS, im Vergleich zu gepooltem humanem Serum über einen Zeitraum von 24 h erhalten blieb (Balken = mittlere ± SD, n=3). Es wurde ein zweiseitiger ungepaarter t-Test verwendet; p &lt; 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Abbildung 1: Standardkurve von Adenosin und Inosin. Das Diagramm wurde für 0-200 μM gezeichnet. Adenosin oder Inosin wurde zu 1x PBS in den angegebenen Konzentrationen hinzugefügt, und dann wurde die Extinktion bei 260 nm gemessen. (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 2: Standardkurve von OH-Kyn. Das Diagramm wurde für 0-400 μM gezeichnet. OH-Kyn wurde zu 1x PBS bei den angegebenen Konzentrationen hinzugefügt und dann die Extinktion bei 379 nm gemessen. (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%202.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 3: Absorptions-Zeit-Kurven bei 260 nm mit steigenden Konzentrationen von HsADA1 nach Zugabe von 200 μM Adenosin. (A) Reaktionskurven für unterschiedliche Konzentrationen von HsADA1. (B) Faltung der Änderung der Steigung des linearen Bereichs der Absorptionskurven in Bezug auf eine 1x PBS-Kontrolle (Balken = Mittelwert ± SD, n=3). Es wurde ein zweiseitiger ungepaarter t-Test von **p &lt; 0,01 und ****p &lt; 0,0001 verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%203.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 4: Absorptions-Zeit-Kurven bei 379 nm mit steigenden Konzentrationen von technologisch hergestellter HsKYNase nach Zugabe von 400 μM OH-Kyn. (A) Reaktionskurven für unterschiedliche Konzentrationen von technisch hergestellter HsKYNase. (B) Faltung der Änderung der Steigung des linearen Bereichs der Absorptionskurven in Bezug auf eine 1x PBS-Kontrolle (Balken = Mittelwert ± SD, n=3). Der zweiseitige ungepaarte t-Test wurde &lt; ****p 0,0001 verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%204.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 5: Absorptions-Zeit-Kurven bei 379 nm unter Verwendung eines hitzedeaktivierten Enzyms in 400 μM OH-Kyn. Das hitzedeaktivierte HsKYNase-Enzym wurde zu 400 μM OH-Kyn in 1x PBS hinzugefügt und dann die Extinktion bei 379 nm gemessen. (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%205.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Bestimmung der Serumstabilität des humanen Adenosin-Desaminase-1-Enzyms

The concept of enzyme stability is typically used to refer to an enzyme's thermostability - its ability to retain structure and activity as temperature ...

determining-the-serum-stability-of-human-adenosine-deaminase-1-enzyme

Research

Forschung

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Bioengineering

Biotechnik

Eine Methode zur Bestimmung von Acetat-Kinase-Aktivität beschrieben. Dieser Assay nutzt eine direkte Reaktion zur Bestimmung der Enzymaktivität und die Kinetik der Acetat-Kinase in die Acetat-bildenden Richtung mit unterschiedlichen Phosphoryl Akzeptoren. Darüber hinaus kann diese Methode für die Untersuchung auf andere Acetyl-Phosphat-oder Acetyl-CoA-Enzyme verwendet genutzt werden.

Direkter Nachweis der Acetat-bildenden Aktivität des Enzyms Acetat-Kinase

In diesem Artikel wird das Verfahren zur Synthese eines hydrophob modifizierten Nafion Membran und Enzymimmobilisierung, wie Proteine ​​und / oder Enzyme in der Membran zu immobilisieren und Testen ihrer spezifischen Aktivität beschreiben.

Hydrophobe Salz-modifizierte Nafion zur Enzymimmobilisierung und Stabilisierung

Dieses Video erklärt eine quantitative Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) Methode zur Messung des Metabolismus von Adenosin und assoziierten Purinen, die durch den Verzehr von AMP in der extrazellulären Umgebung von leukämischen Krebszellen erzeugt werden. Das Protokoll beschreibt einen sensitiven, spezifischen, zuverlässigen und reproduzierbaren RP-HPLC-Assay, der für die Quantifizierung von extrazellulären Purinnukleotiden und Nukleosiden entwickelt und validiert...

Extrazellulärer Purinstoffwechsel: Ein HPLC-basierter Assay zur Messung der Adenosinbildung und des Metabolismus in leukämischen Zellen

Radical-basierte biomimetische Chemie hat zur Gebäude-up-Bibliotheken, die für Biomarker-Entwicklung angewendet.

Free Radicals in Chemical Biology: ab chemisches Verhalten, um Biomarker Entwicklung

PAD4 ist ein Enzym, das für die Umwandlung von Peptidyl-Arginin in Peptidyl-Citrullin verantwortlich ist. Eine Dysregulation von PAD4 wurde mit einer Reihe von menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht. Es wird ein einfacher und hochdurchsatzkompatibler fluoreszenzbasierter PAD4-Assay beschrieben.

Fluoreszenz-basierte Überwachung von PAD4 Aktivität über eine Pro-Fluoreszenz Substratanalogon

Das hier beschriebene Protokoll stellt eine einfache und reproduzierbare Methode dar, die Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) verwendet, um den Purinstoffwechsel an chronischen lymphatischen Leukämie (CLL)-Zellen zu messen, die unter verschiedenen Bedingungen kultiviert wurden.

HPLC-basierten Assay extrazelluläre Nucleotid / Nukleosid Metabolismus in menschlichen chronischer lymphatischer Leukämie-Zellen zu überwachen

Die thermische Stabilität der Enzym-Aktivität wird leicht durch isothermen Titration Kalorimetrie (ITC) gemessen. Die meisten Protein Stabilität Assays derzeit verwendet Maßnahme Protein entfaltet, aber keine Informationen über enzymatische Aktivität. ITC ermöglicht die direkte Bestimmung der Wirkung des Enzyms Modifikationen auf die Stabilität der Enzym-Aktivität.

Enzymatische Stabilität durch isothermen Titration Kalorimetrie Messung

Ein Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH)-gekoppelter ATPase-Assay wurde an das semihohe Durchsatzscreening von kleinen Molekül-Myosininhibitoren angepasst. Dieser kinetische Assay wird in einem 384-Well-Mikroplattenformat mit einem Gesamtreaktionsvolumen von nur 20 l pro Brunnen ausgeführt. Die Plattform sollte für praktisch jedes ADP-produzierende Enzym gelten.

Eine semi-High-Throughput-Anpassung des NADH-gekoppelten ATPase-Assays zum Screening kleiner Molekülinhibitoren

Die schnelle photochemische Oxidation von Proteinen ist eine aufkommende Technik zur strukturellen Charakterisierung von Proteinen. Verschiedene Lösungsmittelzusätze und Liganden haben unterschiedliche Hydroxyl-Radikal-Aufräumeigenschaften. Um die Proteinstruktur unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen, ist eine Echtzeitkompensation von Hydroxylradikalen, die in der Reaktion erzeugt werden, erforderlich, um die Reaktionsbedingungen zu normalisieren.

Ermöglicht Echtzeitkompensation bei schnellen photochemischen Oxidationen von Proteinen zur Bestimmung von Proteintopographie-Änderungen

Dieses Protokoll beschreibt eine kolorimetrische Methode, um den Einfluss von Chemikalien auf die Deiodinase-1 (DIO1)-Aktivität in menschlichen Lebermikrosomen mithilfe der Sandell-Kolthoff-Reaktion zuverlässig zu bewerten. Sie enthält vordefinierte Akzeptanzkriterien und statistische Leistungskennzahlen und unterstützt laufende Bemühungen zur Einbeziehung von OECD-Testrichtlinien.

Kolorimetrische Bewertung der Deiodinase-1-Aktivität in menschlichen Lebermikrosomen mittels der Sandell-Kolthoff-Reaktion

Erfahren Sie Methoden zur Bestimmung der Serumstabilität von Enzymen für die Proteinbiologie und Krebstherapie. Diese Technik hilft Forschern, die pharmakokinetischen Profile von Proteinbiologika zu optimieren.

Bestimmung der Serumstabilität des humanen Adenosin-Desaminase-1-Enzyms

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